李心甜，馬 樂，耿越飛，沈詠梅，曾娟妮＊＊

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 長沙 410005；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 長沙410007；3.藥用美洲大蠊四川省重點實驗室 成都 610000)

據(jù)調(diào)查顯示，我國糖尿病發(fā)病人群較20年前增長近7倍[1]，而糖尿病患者發(fā)生肛周膿腫的機率是非糖尿病的1.5-2.5倍[2]。手術(shù)是作為治療肛漏、肛周膿腫的最主要方法，術(shù)后肛漏創(chuàng)面愈合時間長、療效欠佳，如何促進創(chuàng)面愈合成為近現(xiàn)代研究學(xué)者亟待解決的問題，而中醫(yī)外治在促進創(chuàng)面愈合上積累了豐富的科研成果。研究前期發(fā)現(xiàn)美洲大蠊提取液能提高大鼠難愈合創(chuàng)面前中期Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白的表達[3]；能優(yōu)化細胞凋亡機制，有效調(diào)控蛋白聚糖及透明質(zhì)酸的表達[4]；能減弱Smad7對TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制，提高TGFβ1的表達，加速細胞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、橋粒等的增生與分化，從而縮短創(chuàng)面愈合時間[5,6]。隨著對非編碼RNA研究的深入，發(fā)現(xiàn)lncRNA與多種人類疾病密切相關(guān)。在王偉等人的研究中l(wèi)ncRNA核富集豐富的轉(zhuǎn)錄本1(NEAT1)在調(diào)節(jié)巨噬細胞極化中的作用及其在膿毒癥發(fā)病過程中減輕炎癥反應(yīng)的潛力，證明NEAT1通過下調(diào)miR-125a-5p/TRAF6/TAK1軸促進巨噬細胞M2極化來改善LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[7]。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA AK142386、AK133540、AdipoQAS、HOXA11-AS1等可以調(diào)節(jié)脂肪發(fā)育與代謝[8]。lncRNA MIAT可能通過抑制ERK5磷酸化以減少IL-1β、TNFα合成從而發(fā)揮抑制巨噬細胞炎癥反應(yīng)的作用[9]。隨著國內(nèi)外對lncRNA認識的逐步加深，以及許多l(xiāng)ncRNA在組織發(fā)育過程中具有明顯的特異性表達，本項目旨在對糖尿病肛漏創(chuàng)面應(yīng)用美洲大蠊提取液差異表達lncRNA分析，探討美洲大蠊提取液是否通過調(diào)控lncRNA誘導(dǎo)細胞增殖、分化、遷移、凋亡從而促進創(chuàng)面愈合，為豐富中醫(yī)養(yǎng)陰生肌理論提供理論基礎(chǔ)，為推廣中醫(yī)外治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

本實驗標(biāo)本來自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院收治的高位肛瘺合并2型糖尿病患者術(shù)后創(chuàng)面12例，對照組(A組)6例(A4、A5取樣組織過少無法測序，A6組織保存不當(dāng)降解無法測序)，實驗組(B組)6例。A組采用手術(shù)后用組織剪剪除創(chuàng)面中央直徑約0.5 cm組織；B組采用術(shù)后創(chuàng)面每日予以雙氧水、生理鹽水清洗傷口后，絡(luò)合碘消毒，應(yīng)用美洲大蠊提取液外敷及口服(四川好醫(yī)生，國藥準(zhǔn)字Z51021834，商品名：康復(fù)新液)，口服及外用藥物后第10天，用組織剪剪除創(chuàng)面中央直徑約0.5 cm新鮮肉芽。采集的標(biāo)本立即放入干冰中凍存，詳細登記患者信息，交由上海晶能生物科技有限公司完成lncRNA高通量測序。入組標(biāo)準(zhǔn)：符合高位肛瘺及2型糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)(肛瘺診斷標(biāo)準(zhǔn)參照國家中醫(yī)藥管理局行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及中華中醫(yī)藥學(xué)會肛腸分會肛瘺診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]，2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2013年中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)分會制定的《中國2型糖尿病防治指南(2013年版)》[11])；②年齡在18-65歲之間；高位及2型糖尿病病程均在5年以內(nèi)；③簽訂知情同意書并配合觀察的患者。本研究獲得湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 總RNA樣本的制備

采用Trizol法提取糖尿病肛漏創(chuàng)面組織的總RNA，測定濃度，并電泳質(zhì)檢RNA。運用Nanodrop儀器(美國Thermo公司)定量計算RNA的濃度及純度，再根據(jù)Nanodrop儀器定量結(jié)果，取500 ng 1%瓊脂糖電泳檢測RNA完整性。

1.2.2 lncRNA表達譜分析

高通量測序由上海晶能生物科技有限公司完成。具體操作，首先將DNA打斷，然后末端補平，完成補平后，在3’端使用酶加上一個特異的堿基A，再進行PCR擴增。統(tǒng)計后剔除Mapping ratio低于50%的樣本。利用DESeq2軟件對不同樣本組之間篩選差異表達的已知轉(zhuǎn)錄本，滿足|log2FC|＞=1和Pvalue＜=0.05差異表達范圍篩選兩組之間的差異表達的mRNAs及l(fā)ncRNAs。針對差異表達的mRNAs及l(fā)ncRNAs采用TopGO軟件進行GO功能分析及KEGG數(shù)據(jù)庫中Pathway的功能注釋和歸類，根據(jù)P＜=0.05篩選顯著富積GO及顯著的Pathway通路。從生物信息學(xué)的角度來預(yù)測長鏈非編碼RNA調(diào)控的順式靶標(biāo)基因，采用基于表達量相關(guān)性的共表達分析方法來預(yù)測長鏈非編碼RNA調(diào)控的反式靶標(biāo)基因。

1.2.3 PCR驗證

選取A組與B組樣本為研究對象，篩選出來差異表達的lncRNA，挑選FC＞2以及靶標(biāo)預(yù)測中與本實驗相關(guān)的lncRNA進行RT-PCR驗證。

2 結(jié)果

2.1 總RNA樣本質(zhì)量分析

本實驗采用illumina Hiseq測序平臺的雙端測序模式對多個樣本進行高通量測序。結(jié)果表明A組中A4、A5取樣組織過少脫落無法進行測序，A6組織保存不當(dāng)降解導(dǎo)致無法測序；B組中B4的Mapping Ratio9.6%為污染樣本在后續(xù)分析中予以剔除，B6樣本降解脫落未納入實驗數(shù)據(jù)。其余樣本完整性較好，9張芯片達到質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)，滿足實驗需求。圖1為測序數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計表。

圖1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計表

2.2 篩選差異表達的lncRNAs

通過高通量測序檢測分析發(fā)現(xiàn)，lncRNAs在促進糖尿病肛漏創(chuàng)面愈合中表達存在明顯差異表達，圖2為lncRNAs表達的散點圖(每個點對應(yīng)一個lncRNA，對應(yīng)的橫坐標(biāo)、縱坐標(biāo)分別為A、B組的表達量)。共有2242條差異表達的lncRNAs(差異倍數(shù)＞2，且P＜=0.05)，表達上調(diào)的649個(藍色)，下調(diào)的1593個(紫色)(圖3)。差異表達的mRNAs共13186個，其中上調(diào)5162個，下調(diào)8024個。進一步篩選出差異表達5倍以上的lncRNA共26個，上調(diào)6個，下調(diào)20個(表1)，在知網(wǎng)檢索26個lncRNA，暫未檢索出與本研究相關(guān)文獻，暫不行RT-PCR驗證實驗。

表1 兩組差異表達lnc RNA統(tǒng)計情況

圖2 應(yīng)用美洲大蠊提取液肛漏創(chuàng)面差異表達的lncRNA散點圖

圖3 應(yīng)用美洲大蠊提取液肛漏創(chuàng)面差異表達的lncRNA火山圖

2.3 對差異表達的lncRNAs進行GO分析

GO分析發(fā)現(xiàn)lncRNA-cis顯著差異的有1000個GO，相關(guān)功能主要集中在表皮細胞分化、上皮細胞分化、細胞代謝過程的調(diào)節(jié)、角質(zhì)形成細胞分化、表皮發(fā)育、角質(zhì)化、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、序列特異性DNA結(jié)合、編碼角質(zhì)化包膜等(圖4A)。

圖4A lncRNAs-cis中GO分析三大類中最顯著的前10項

lncRNA-trans顯著差異的有2388個GO，相關(guān)功能主要集中在細胞代謝過程、蛋白質(zhì)結(jié)合、細胞內(nèi)部分、細胞外、細胞質(zhì)、細胞質(zhì)部分等(圖4B)。

圖4B lncRNAs-trans中GO分析三大類中最顯著的前10項

2.4 對差異表達的lncRNAs進行KEGG通路分析

Pathway分析顯示lncRNA-cis顯著差異57條，在前10條通路中通過檢索相關(guān)文獻，篩選出與本課題研究相關(guān)的1條通路是炎癥性腸病(Inflammatiory bowel disease，IBD)(圖5A)。

圖5A lncRNA-cis顯著的前20項KEGG通路

Pathway分析顯示lncRNA-trans顯著差異88條，在前10條通路中通過檢索相關(guān)文獻，篩選出與本課題研究相關(guān)的2條通路分別是：MAPK signaling pathway(MAPK信號通路)、AMPK signaling pathway(AMPK信號通路)(圖5B)。

圖5B lncRNA-trans顯著的前20項KEGG通路

2.6 lncRNA靶標(biāo)基因預(yù)測

篩選出Primary lncRNA共54380個，篩選lncRNA with multi-exon and length＞=200共1662個。采用4種軟件(即PLEX，CPAT，CNCI和CPC2)對初步篩選的1662個lncRNA進行分析，繪制出維恩圖取其交集1413個lncRNA作為最終預(yù)測的lncRNA(圖6)。

圖6 韋恩圖

從1413個lncRNA中挑選出顯著差異表達的lncRNA順式調(diào)控靶標(biāo)基因前50個靶標(biāo)基因及l(fā)ncRNA反式調(diào)控靶標(biāo)基因前50個靶標(biāo)基因。通過在中國知網(wǎng)中檢索篩選出的50個lncRNA-cis及50個lncRNA-trans。我們發(fā)現(xiàn)在50個lncRNA-cis中，ENST00000401499、ENST00000428029與糖尿病相關(guān)；ENST00000532541與抗細胞凋亡促生殖相關(guān)；ENST00000443364與調(diào)節(jié)人體穩(wěn)態(tài)相關(guān)；ENST00000576797與巨核細胞及血小板形成相關(guān)。在 lncRNA-trans 中 ， ENST00000444032、ENST00000424194與細胞凋亡相關(guān)，ENST00000620167與微血管通透性相關(guān)；ENST00000424194與成纖維生長因子相關(guān)(表2)。

表2 差異表達lncRNA靶標(biāo)預(yù)測

圖7A中的A圖代表差異表達的lncRNA順式調(diào)控靶標(biāo)基因前50個靶標(biāo)基因網(wǎng)絡(luò)圖，紅色節(jié)點代表lncRNA，藍色節(jié)點代表靶標(biāo)基因。圖8B代表差異表達的lncRNA反式調(diào)控靶標(biāo)基因前50個靶標(biāo)基因網(wǎng)絡(luò)圖，紅色節(jié)點代表lncRNA，藍色節(jié)點代表靶標(biāo)基因。

圖7A 差異表達的lncRNA順式調(diào)控靶標(biāo)基因網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 PCR驗證

差異表達5倍以上的lncRNA共26個，上調(diào)6個，下調(diào)20個(表1)，在知網(wǎng)檢索26個lncRNA，未檢索出相關(guān)文獻研究，暫不行RT-PCR驗證。對靶標(biāo)基因預(yù)測中篩選出的8個lncRNA中挑選FC大于2的lncRNA即 ENST00000443364、 ENST00000576797、ENST0000620167進行PCR驗證。結(jié)果在擴大樣本中，得到了較好的驗證，ENST00000443364、ENST00000576797PCR結(jié)果與芯片結(jié)果一致(圖8A、圖8B)。

圖8B ENST00000443364基因擴增曲線

圖8A ENST00000576797基因擴增曲線

3 討論

肛漏創(chuàng)面是慢性創(chuàng)面中的一種，如何加速肛周創(chuàng)面愈合成為肛腸科醫(yī)師亟待解決的重要問題，合并糖尿病是肛周術(shù)后創(chuàng)面愈合不良的獨立危險因素[12]，在高血糖狀態(tài)中病原菌易定植及繁衍，并損害內(nèi)皮細胞，減慢創(chuàng)面蛋白合成，毛細血管新生及肉芽組織生長緩慢。目前西醫(yī)的治療方法主要包括抗感染、局部清創(chuàng)、負壓引流、控制血糖等，但臨床療效欠佳，費用昂貴。在臨床研究中發(fā)現(xiàn)美洲大蠊提取液可加速創(chuàng)面愈合[13]，在實驗研究中美洲大蠊提取液可作用于創(chuàng)面修復(fù)過程的多種靶效應(yīng)[14]，因此探究美洲大蠊提取液差異表達lncRNA對治療糖尿病肛漏創(chuàng)面具有積極意義。

長鏈非編碼RNA是一類具有組織特異性的ncRNA[15-18]。lncRNA不僅參與了染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細胞增殖、分化和凋亡等多種生物過程，還與多種人類疾病密切相關(guān)，包括結(jié)直腸癌、肝癌、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥腸病、糖尿病等[19-22]。

LncRNAENST00000443364靶標(biāo)基因SLAMF9屬于保守的淋巴細胞激活分子家族(SLAMF)。主要與調(diào)控巨噬細胞、調(diào)節(jié)pDC穩(wěn)態(tài)、影響促炎性細胞因子的分泌和轉(zhuǎn)移等有關(guān)。SLAMF8和SLAMF9共同調(diào)節(jié)巨噬細胞介導(dǎo)的肝臟炎癥，SLAMF8和SLAMF9的缺乏通過下調(diào)Toll樣受體4(TLR4)(一種特異性結(jié)合LPS的受體)的表達而抑制了炎性細胞因子的分泌[23]。在Sever Lital等人的研究中，通過產(chǎn)生CRISPR/Cas9 SLAMF9基因敲除小鼠，證實SLAMF9在穩(wěn)定狀態(tài)和實驗性自身免疫性腦脊髓炎期間在pDC分化，體內(nèi)平衡和功能中起著關(guān)鍵作用[24]。在Dollt Claudia等人研究中，SLAMF9在刮擦試驗中延遲了RAW 264.7細胞的傷口閉合，SLAMF9是一種新型的I型跨膜受體，在巨噬細胞中具有免疫調(diào)節(jié)特性[25]。

lncRNAENST00000576797靶標(biāo)基因MKL2(心肌樣蛋白2)隸屬MRTF，MRTF在血管SMC中占主導(dǎo)。在Madeleine C.Smith等人研究中MKL1/2通過影響cAMP調(diào)節(jié)VSMC和EC的增殖和遷移[26]。lncRNAENST00000620167靶標(biāo)基因RAPGEF3經(jīng)Kopperud RK等相關(guān)研究證實缺乏RAPGEF3的小鼠微血管通透性增加[27]。從上可見lncRNA在創(chuàng)面愈合領(lǐng)域扮演重要角色。

本研究中我們采用lncRNA高通量測序技術(shù)篩查lncRNA在糖尿病肛漏創(chuàng)面與應(yīng)用美洲大蠊糖尿病肛漏創(chuàng)面中的表達水平。與未應(yīng)用美洲大蠊提取液的肛漏創(chuàng)面比較，發(fā)現(xiàn)共有2242條差異表達的lncRNAs(差異倍數(shù)＞2，且P＜=0.05)。對差異表達的lncRNAs進行GO分析，發(fā)現(xiàn)lncRNA-cis的GO功能主要富集在表皮細胞分化、上皮細胞分化、細胞代謝過程的調(diào)節(jié)等；差異表達的lncRNA-trans的GO功能主要富集在細胞代謝過程、蛋白質(zhì)結(jié)合、細胞內(nèi)部分等。通過KEGG通路分析，篩選出lncRNA-cis的Inflammatiory bowel disease(IBD)以及l(fā)ncRNA-trans的MAPK signaling pathway、AMPK signaling pathway與本課題相關(guān)。挑選出顯著差異表達的lncRNA順式調(diào)控靶標(biāo)基因前50個靶標(biāo)基因及l(fā)ncRNA反式調(diào)控靶標(biāo)基因前50個靶標(biāo)基因，從靶標(biāo)基因預(yù)測中篩選出的8個lncRNA中挑選FC大于2的lncRNA即ENST00000443364、ENST00000576797、ENST00000620167，進 行PCR驗證，在擴大樣本中，ENST00000443364、ENST00000576 797PCR結(jié)果與芯片結(jié)果一致。研究證實美洲大蠊提取 液 可 能 通 過 lncRNAENST00000443364、ENST00000576797順式及反式調(diào)控靶標(biāo)基因調(diào)控巨噬細胞、影響促炎性細胞因子的分泌和轉(zhuǎn)移以及調(diào)節(jié)VSMC和EC的增殖和遷移，影響表皮細胞分化、上皮細胞分化、細胞代謝過程的調(diào)節(jié)等功能通過IBD、MAPK signaling pathway、AMPK signaling pathway促進糖尿病肛漏創(chuàng)面愈合。有助于從基因水平認識美洲大蠊提取液促進創(chuàng)面愈合的機制，為中醫(yī)外治難愈合創(chuàng)面開創(chuàng)新的思路和線索，為大力發(fā)展中醫(yī)外治提供科學(xué)依據(jù)。

圖7B 差異表達的lnc RNA反式調(diào)控靶標(biāo)基因網(wǎng)絡(luò)圖