唐曉龍，金慶江，王瑞平，王 鑫，滕鈺浩，湯海林，周逸群，尹 浩，金慶雷＊＊

(1.蘇州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 蘇州 215000；2.江蘇省中醫(yī)院 南京 210009)

國際癌癥研究中心(International Agency for Research on Cancer，IARC)報告了2018年全球有新發(fā)癌癥患者1808萬例，癌癥死亡率達125.2/10萬，新發(fā)癌癥前5位的是肺癌、女性乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、胃癌，這五個病種占全部新發(fā)癌癥患者的45.9%，并有48.4%的患者來自亞洲，我國全年新發(fā)癌癥患者占全球23.7%，已經(jīng)是全球新增癌癥病例最高的國家[1，2]。腫瘤的治療已進入精準治療時代，無論靶向治療、免疫治療，甚至化療，均強調(diào)基因檢測的重要性，基因檢測的運用使得治療具有針對性。精準治療與中醫(yī)辨證施治有異曲同工之妙，均強調(diào)個體差異性，中醫(yī)藥是一個偉大寶庫，歷史悠久，古代醫(yī)家運用中醫(yī)手段治療腫瘤的歷史也很悠久，值得我們深入挖掘。

明末李中梓是中醫(yī)大家、教育家，其著作《醫(yī)宗必讀》對后世影響深遠，最早提出治療腫瘤當分早中晚三期，治療腫瘤有新制陰陽攻積丸、息賁丸等名方，在這些治療腫瘤的方劑中都共同使用到巴豆[3]，巴豆是大戟科植物，有一定毒性，因為其毒性，目前臨床運用較少，但是“以毒攻毒”是治療腫瘤的一個重要手段，現(xiàn)代學者也有很多針對巴豆的研究，有選用巴豆有效成分治療腫瘤，并獲得陽性結(jié)果，其中巴豆生物堿是研究較廣泛的一類化合物，被廣泛用于胃癌、腸癌、婦科腫瘤等多種腫瘤的研究中[4]。木蘭花堿(magnoflorine)是目前從巴豆中分離出的生物堿中的一種[5]，其分子結(jié)構(gòu)見圖1，木蘭花堿被證實具有抗真菌[6]、改善脂多糖誘導的急性肺損傷[7]、減輕早期關(guān)節(jié)炎軟骨退變[8]等功能，也有學者單獨將木蘭花堿用于腫瘤治療，結(jié)果顯示[9]木蘭花堿可以通過AKT/mTOR和p38信號通路誘導細胞凋亡和自噬，提高乳腺癌細胞對阿霉素(DOX)的敏感性，目前已有大量研究表明，巴豆生物堿對多種腫瘤細胞具有殺傷作用[10-12]。

圖1 Mag化學結(jié)構(gòu)

然而目前針對木蘭花堿的研究大多局限于某一作用靶點或者單一信號通路，研究比較局限，并且缺乏理論依據(jù)。網(wǎng)絡藥理學是通過生物信息數(shù)據(jù)庫，結(jié)合了生物信息學、藥理學分析、計算生物學等多學科，進行虛擬篩選藥物作用疾病的潛在靶點及通路，從整體性和系統(tǒng)性角度初步預測藥物作用疾病的可能作用機制的學科，目前網(wǎng)絡藥理學參與了很多中醫(yī)藥研究項目的前期預測，被廣泛應用于中藥領(lǐng)域中，包括中藥新藥研發(fā)、中藥藥理學作用機制研究、中藥質(zhì)量控制、組方配伍等[13-18]。反向分子技術(shù)是以小分子化合物作為研究對象，在與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的已知蛋白自動對接，尋找小分子化合物潛在作用靶點，除預測潛在機制，還可預測不良反應的蛋白靶點[19]。本次為了探索木蘭花堿在人體抗腫瘤的作用靶點及潛在機制，首次采用反向分子對接和網(wǎng)絡藥理學聯(lián)合運用研究木蘭花堿抗腫瘤的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 預測木蘭花堿潛在靶點

Pharm Mapper數(shù)據(jù)庫[20,21]是一個藥效團匹配與潛在識別靶標平臺，通過預先構(gòu)建好含有多個藥效團模型的數(shù)據(jù)庫，將目標分子輸入，進行反向匹配，獲得與搜索結(jié)構(gòu)匹配較好的靶點。該過程具體操作如下：首先在Pubchem網(wǎng)站(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，搜索關(guān)鍵詞“Magnoflorine”，查找并下載Magnoflorine的3D化合物結(jié)構(gòu)，保存為.mol2格式，將其導入Pharm Mapper服務器(http：//lilab-ecust.cn/pharmmapper/)，根據(jù)文獻進行參數(shù)設置[22]，如下：Generate Conformers：Yes；Maximum Generated Conformations：300；Select Target Set：Human Protein Target Only；Number of Reserved Matched Targets：300。獲得潛在靶點后，將靶點輸入Uniprot網(wǎng)站[23]中，將基因名規(guī)范化，并找到對應的Uniprot號。

1.2 潛在靶點相關(guān)的生物過程及參與的KEGG通路

DAVID(the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery)數(shù) 據(jù) 庫(http：//david.abcc.ncifcrf.gov/)是一款在線免費使用的生物信息數(shù)據(jù)庫，主要用于差異基因的功能和通路富集分析[24]。將所獲得的潛在靶點，輸入DAVID中，在線分析得到潛在靶點參與的生物過程(GO)以及參與的信號通路(KEGG)。通過Omicshare數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果繪制成氣泡圖，將結(jié)果進行可視化。

1.3 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡的構(gòu)建

String數(shù)據(jù)庫是研究已知蛋白相互作用關(guān)系的數(shù)據(jù)庫[25]。通過該數(shù)據(jù)庫分析潛在作用靶蛋白之間的相互作用，將結(jié)果下載導入Cytoscape軟件，可視化蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(PPI網(wǎng)絡)。并使用插件Network Analyzer分析其網(wǎng)絡特征。

2 結(jié)果

2.1 木蘭花堿潛在的作用靶點

將木蘭花堿與PharmMapper服務器中人源蛋白靶標(human protein targets)進行反向分子對接，得到242個潛在蛋白，其中有4個蛋白為非人類靶點，故予以刪除，總計獲得238個靶點進行下一步的分析(表1)。

表1 PharmMapper服務器預測到的Mag潛在作用靶標

續(xù)表

2.2 共表達網(wǎng)絡的構(gòu)建

將前期獲得的潛在靶點，共238個，輸入STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建共表達網(wǎng)絡，本網(wǎng)絡共有237個節(jié)點，平均相鄰節(jié)點數(shù)是18.5，可見各靶點之間存在密切聯(lián)系(圖2)。

圖2 Mag相關(guān)潛在靶點基因共表達網(wǎng)絡

2.3 木蘭花堿潛在作用靶點功能分析

將木蘭花堿的分子結(jié)構(gòu)輸入SWISS數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http：//www.swisstargetprediction.ch/)，通過分析結(jié)果可見，靶點中最多的是膜受體(30%)，其次是G蛋白偶聯(lián)受體家族(26%)其他的還有激酶、氧化還原酶、磷酸酶等(圖3)。

圖3 木蘭花堿潛在靶點功能分析

2.4 木蘭花堿潛在作用靶點通路分析

將238個靶蛋白進行標準化基因名，然后輸入DAVID數(shù)據(jù)庫進行KEGG通路分析，富集分析結(jié)果顯示共有20條與腫瘤相關(guān)的通路，其中實體腫瘤18條：分別是腫瘤通路(Pathways in cancer)40個、癌癥中的蛋白多糖(Proteoglycans in cancer)23個、前列腺癌通路(Prostate cancer)15個、病毒致癌機理(Viral carcinogenesis)13個、化學致癌機理(Chemical carcinogenesis)12個、胰腺癌通路(Pancreatic cancer)12個、轉(zhuǎn)錄失調(diào)的腫瘤通路(Transcriptional misregulation in cancer)12個、結(jié)直腸癌通路(Colorectal cancer)10個、黑色素瘤通路(Melanoma)10個、非小細胞肺癌通路(Non-smallcell lung cancer)10個、腎細胞癌通路(Renal cellcarcinoma)10個、膀胱癌通路(Bladder cancer)9個、中心碳代謝通路(Central carbon metabolism in cancer)9個、子宮內(nèi)膜癌通路(Endometrial cancer)9個、小細胞肺癌通路(Small cell lung cancer)9個、膽堿代謝通路(Choline metabolism in cancer)8個、膠質(zhì)瘤通路(Glioma)8個、甲狀腺癌通路(Thyroid cancer)7個；血液腫瘤2條：慢性髓性白血病通路(Chronic myeloid leukemia)9個和急性髓性白血病通路(Acute myeloid leukemia)8個；所有通路P值均＜0.05(表2)。使用Omicshare網(wǎng)站中的高級氣泡圖功能，對上訴20條腫瘤相關(guān)通路信息進行分析，主要參考指標是通路基因參與數(shù)量、P值及富集因子，繪制氣泡圖(圖4A)，分析圖4可推測，木蘭花堿在前列腺癌中的作用較強(圖4C，紅色方框部分為木蘭花堿靶點作用位置)。

圖4 A：木蘭花堿腫瘤相關(guān)信號通路KEGG富集圖；B：腫瘤信號通路；C：前列腺癌信號通路

表2 木蘭花堿潛在靶點參與的腫瘤相關(guān)通路

2.5 化合物Mag的“化合物-靶點-通路-疾病”藥理網(wǎng)絡構(gòu)建

以化合物Mag、潛在與腫瘤相關(guān)的靶點、腫瘤相關(guān)通路、疾病為節(jié)點，建立數(shù)據(jù)文件及表型文件2個Excel文件，使用Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建相關(guān)藥理網(wǎng)絡，并可視化(圖5)。結(jié)果表明，Mag可以通過71個靶點，參與不同信號通路而作用于不同腫瘤，可見木蘭花堿具有多靶點多通路的特點。

圖5 Mag的“化合物-靶點-通路-疾病”藥理網(wǎng)絡

3 結(jié)論

木蘭花堿抑制腫瘤已有多次文獻報道，但目前研究多較局限，存在盲目性，缺乏針對性。反向分子對接及網(wǎng)絡藥理學，可以構(gòu)建藥物靶點疾病網(wǎng)絡，可系統(tǒng)闡述其復雜的作用機制，對于新藥研發(fā)有很好的指導作用，為進一步的深入研究提供了理論依托，故本次采用反向分子對接與網(wǎng)絡藥理學聯(lián)合使用，研究木蘭花堿作用于腫瘤的潛在機制。

本次結(jié)果顯示，通過PharmMapper數(shù)據(jù)庫得到與木蘭花堿匹配的238個潛在靶點；為研究各靶點之間是否存在關(guān)聯(lián)性，將靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫，結(jié)果可見，各靶點之間存在較強關(guān)聯(lián)性，平均相鄰節(jié)點數(shù)是18.5；這些靶點的類型中最多的是膜受體，表明Mag主要作用于細胞膜上的靶點；其次是G蛋白偶聯(lián)受體家族，這也是一類膜蛋白，研究證實這類蛋白家族與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[26]；除此之外主要分類有氧化還原酶、磷酸酶、激酶等，表明木蘭花堿具有多靶點作用的特點；為進一步探索木蘭花堿潛在作用機制，單一靶點不能體現(xiàn)，故將這些靶點進行富集分析，結(jié)果可見，這些靶點不同程度富集在腫瘤信號通路、前列腺癌信號通路、胰腺癌通路、轉(zhuǎn)錄失調(diào)的腫瘤通路、結(jié)直腸癌通路、黑色素瘤通路、非小細胞肺癌通路、腎細胞癌通路、膀胱癌通路、中心碳代謝通路、子宮內(nèi)膜癌通路、小細胞肺癌通路、膽堿代謝通路、膠質(zhì)瘤通路、甲狀腺癌通路等。為了將結(jié)果可視化，我們構(gòu)建了木蘭花堿、靶點、通路網(wǎng)絡，復雜的網(wǎng)絡提示木蘭花堿發(fā)揮抗腫瘤活性是多靶點，多機制的，可能的機制有調(diào)

節(jié)某些特定蛋白激酶、磷酸酶的活性，或者結(jié)合某些特地靶點蛋白，阻止其與下游分子結(jié)合，從而改變這些蛋白的生物活性，影響腫瘤生長、轉(zhuǎn)移等，但這些只是理論研究，具體作用機制還需進一步實驗論證。

3.1 Mag相關(guān)靶蛋白的研究

從本次富集結(jié)果可見，Mag主要作用于MAP2K1、MET、MMP、KDR、TGFB2、GSK-3等靶點，這些靶基因在多條信號通路中發(fā)揮中藥作用，這些基因目前已被證實與腫瘤的生長存在密切聯(lián)系：

MAP2K1(Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase 1，絲裂原活化蛋白激酶1)別稱MEK 1、MAPKK 1或MKK1，屬于STE7家族中的一種蛋白激酶[27]，是一種雙特異性蛋白激酶，在RAS-RAF-MEK-ERK信號轉(zhuǎn)導通路中起重要作用，該通路介導多種生物功能，如細胞生長、粘附、存活和分化，而MAPK等基因的突變會導致該通路被激活，在多種腫瘤細胞中，MAP2K1過度表達，常被用來作為腫瘤治療的靶標，體外藥效學研究顯示[28]，發(fā)現(xiàn)Mag通過ERK、p38MAPK和JNK信號傳導通路相關(guān)蛋白調(diào)控細胞凋亡。

MMP(Matrix Metallopeptidase，基質(zhì)金屬蛋白酶)家族蛋白參與細胞外基質(zhì)(ECM)的分解過程，幾乎能降解ECM中的各種蛋白成分，參與胚胎發(fā)育、組織重塑等生物過程，在腫瘤中，參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程，是該過程的主要蛋白水解酶[29]。目前已分離鑒定的家族成員有26個，目前對MMP2、MMP9研究較為深入。本次研究發(fā)現(xiàn)，Mag可作用于多個MMP家族成員，如MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9等，由此可推測，Mag或許有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，但目前尚未有關(guān)Mag與MMP相互作用的實驗報道。

MET(MET proto-oncogene，receptor tyrosine kinase)基因編碼的蛋白為HGFR(肝細胞生長因子受體)[30]，具有酪氨酸激酶活性，參與多種細胞生物過程，如細胞增殖、分化和運動。目前研究表明c-met與多種癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)，許多腫瘤病人有c-met過度表達和基因擴增，但目前尚未有關(guān)Mag與MET相互作用的報道。

GSK-3(Glycogen synthase kinase-3，糖原合成酶激酶-3)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[31]，分為GSK-3α和GSK-3β兩個亞型，參與糖原代謝，通過調(diào)節(jié)多種信號因子和轉(zhuǎn)錄因子，進而調(diào)控腫瘤細胞生物過程。目前暫未有Mag與GSK-3信號通路相關(guān)的文獻報道。

TGF-β(Transforming growth factor-β，轉(zhuǎn)化生長因子-β)通過轉(zhuǎn)化生長因子所介導的一系列信號傳遞的過程[32]，在體內(nèi)以TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3三種形式存在，目前對TGF-β1的研究最為深入和活躍。本次研究發(fā)現(xiàn)，Mag可作用于TGF-β2，但目前尚未有關(guān)于Mag作用于TGF-β的報道。

KDR(Kinase insert domain receptor，血管內(nèi)皮生長因子受體)，又名VEGFR，是一種受體酪氨酸激酶[33]，接受VEGF的信號之候，可以促進血管內(nèi)皮細胞增殖、存活、遷移等過程，大量研究證明，正常人體組織中VEGFR表達較低，相反在絕大多數(shù)腫瘤細胞中高表達，它除了影響血管內(nèi)皮細胞的分裂、增值外，還可誘導腫瘤血管增生，促使其生長轉(zhuǎn)移。

這些靶基因與木蘭花堿之間的關(guān)聯(lián)性，目前報道尚較少，這可為木蘭花堿進一步機制研究可提供靶標及研究方向。

3.2 Mag相關(guān)通路的研究進展

通過富集分析木蘭花堿相關(guān)的靶基因，40個靶點參與腫瘤通路，23個靶點參與多聚糖腫瘤通路，15個靶點前列腺癌通路，有13個靶點參與病毒致癌機理，有12個靶點參與化學致癌機理、胰腺癌通路、轉(zhuǎn)錄失調(diào)的腫瘤通路，10靶點個參與結(jié)直腸癌通路、黑色素瘤通路、非小細胞肺癌通路、腎細胞癌通路，9個靶點參與膀胱癌通路、子宮內(nèi)膜癌通路、小細胞肺癌通路7個靶點參與甲狀腺癌通路。富集分析結(jié)果分析可見Mag對腫瘤通路具有極顯著差異，在腫瘤通路中主要通 過RAS-RAF-MEK-ERK signaling pathway，PPAR signaling pathway，TGF-βsignaling pathway等通路導致腫瘤細胞的凋亡和抑制腫瘤細胞的增殖。

通過綜合基因富集數(shù)量、P值和富集因子(rich factor)信息分析可知，木蘭花堿在前列腺癌通路KEGG富集中的P值和富集因子值較高，Mag表現(xiàn)出較強的抗前列腺癌的作用。但木蘭花堿對前列腺癌治療作用，尚未有研究報道。前列腺癌通路富集中木蘭花堿作用靶點基因有FGFR2，EGFR，F(xiàn)GFR1，AR，HRAS，HSP90AA1，BRAF，MAP2K1，IGF1，CDK2，AKT1，IGF1R，MAPK1，PDPK1，GSK3B等，推測木蘭花堿在人體內(nèi)通過Ras/Raf/MEK、IGF1/PDK1等通路，或者作用于AR、CDK2等靶蛋白達到治療前列腺癌的作用。

除前列腺癌外，富集分析結(jié)果可見，Mag在結(jié)直腸癌腫瘤中也存在較大治療價值，主要通過TGF-β，MAPK，JAK/STAT多個信號通路達發(fā)揮作用。另外潛在靶基因在胰腺癌、非小細胞肺癌通路中也存在有意義的富集，說明Mag對胰腺癌、非小細胞肺癌具有一定治療作用。目前已有報道證實，Mag可以通過誘導自噬細胞死亡、凋亡和S/G2期阻滯具有抗胃癌能力[28]，主要與AKT的阻斷和JNK信號通路的激活密切相關(guān)。

本次研究以木蘭花堿為研究對象，采用反向分子對接技術(shù)及網(wǎng)絡藥理學方法研究其抗腫瘤的潛在機制，研究顯示，木蘭花堿具有多靶點、多機制特點，本次研究得出的一些靶點及通路與現(xiàn)有研究報道相符合，證明該研究方法具有可靠性。

綜上所述，中醫(yī)藥優(yōu)點在于低毒高效，但因其成分復雜，常規(guī)研究手段有明顯局限性，網(wǎng)絡藥理學近年來研究較為熱門，其依托生物信息大數(shù)據(jù)，為中醫(yī)藥研究體提供理論依據(jù)及研究方向。巴豆是一味有毒中藥，使得其臨床運用受限，因此尋找其有效成分，避開毒性成分，將可有利于發(fā)揮其藥效價值。本次研究選擇巴豆生物堿的其中之一，木蘭花堿作為研究對象，運用反向分子對接方法，篩選出木蘭花堿抗腫瘤的潛在的人源靶蛋白，并對潛在靶點進行富集分析，及其KEGG通路研究，結(jié)果表明木蘭花堿確實具有潛在抗腫瘤作用，其抗腫瘤作用是多靶點，并能作用于多種腫瘤。木蘭花堿在胃癌、乳腺癌中的價值已被體內(nèi)外實驗證實，具體作用機制還需進一步的深入研究。