胡琳雅，洪承呂，陳潛，何文斐，吳建章

1.溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心血管內(nèi)科，浙江 溫州 325015

研究表明，氧化應(yīng)激是多種心血管疾病的重要病理機(jī)制，外界刺激誘使機(jī)體中產(chǎn)生過(guò)量的ROS，介導(dǎo)組織和細(xì)胞中脂質(zhì)、DNA和蛋白質(zhì)氧化損傷，進(jìn)而導(dǎo)致強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞死亡（焦亡、凋亡和壞死）[1-3]。而心臟作為高能量需求器官，極易受到氧化損傷[4]。

查耳酮類化合物是一類低毒的藥食同源的天然產(chǎn)物，具有抗氧化[5]、抗炎[6]、抗腫瘤[7]和抗真菌[8]等廣泛的生物活性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)查耳酮衍生物L(fēng)2H24能通過(guò)抗氧化和抗炎作用改善腦缺血再灌注損傷和急性肺損傷[9-10]，而L2H24能否在氧化應(yīng)激相關(guān)的心肌細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)作用及其分子機(jī)制尚未可知。本研究探討了L2H24對(duì)大鼠心肌細(xì)胞H9c2的保護(hù)作用，旨在闡明其對(duì)H2O2刺激所致細(xì)胞氧化應(yīng)激和焦亡的影響及潛在的分子機(jī)制，以期為心肌氧化損傷的治療提供新的候選抗氧化劑。

1 材料和方法

1.1 材料 本研究所用化合物L(fēng)2H24由本課題組的化學(xué)實(shí)驗(yàn)室合成，結(jié)構(gòu)見圖1[9]。大鼠心肌細(xì)胞H9c2購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院，DMEM（1 g/L）培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%含EDTA胰酶、PBS緩沖液、雙抗（10 000 U/mL） 購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，MTT噻唑藍(lán)購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司，結(jié)晶紫染色液、MDA檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)公司，多聚甲醛、TBHQ（食品抗氧化劑）、30% H2O2購(gòu)于上海阿拉丁試劑有限公司，一抗HO-1、Nrf2、IL-1β購(gòu)自美國(guó)Santa公司，β-actin、GAPDH購(gòu)于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，Caspase-1、抗兔、抗鼠二抗購(gòu)于美國(guó)CST公司，Lipofectamine 2000購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，小干擾RNA（si-Nrf2）序列購(gòu)于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，CO2恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)Thermo公司，倒置熒光顯微鏡購(gòu)于日本Nikon公司，酶標(biāo)儀、ChemiDocTMXRS+凝膠成像儀器購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司。

圖1 L2H24的分子結(jié)構(gòu)

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：H9c2細(xì)胞用DMEM（1 g/L）基礎(chǔ)培養(yǎng)基加10%的胎牛血清、1%的雙抗的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。約2～3 d消化傳代1次，傳代后約留30%的細(xì)胞用于繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 造模損傷H2O2濃度的確定：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞，3 000個(gè)/孔鋪96孔板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中貼壁過(guò)夜。用終濃度為100、200、300、400、500、600 μmol/L的H2O2孵育細(xì)胞24 h后，加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，4 h后吸走96孔板中的液體，重新加入DMSO 120 μL/孔，并置于微型振蕩器上混勻。待紫色晶體全部溶解，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞生存率（實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%）。

1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn)：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞，3 000個(gè)/孔鋪96孔板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中貼壁過(guò)夜（24 h），L2H24以不同濃度（0.3125、0.625、1.25、2.5、5 μmol/L）預(yù)孵育18 h后，加H2O2刺激，24 h后MTT法測(cè)細(xì)胞存活率。

1.2.4 集落克隆實(shí)驗(yàn)：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞，2 000個(gè)/孔鋪12孔板，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱貼壁培養(yǎng)過(guò)夜（24 h），先加不同濃度的L2H24預(yù)孵育18 h，再加H2O2共同孵育。7 d后，棄去板內(nèi)原有細(xì)胞培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛室溫下固定細(xì)胞20 min， PBS緩沖液洗兩次，再用結(jié)晶紫染色30 min（可適當(dāng)延長(zhǎng)），用PBS清洗后晾干、拍照。

1.2.5 MDA含量測(cè)定：H9c2細(xì)胞20萬(wàn)/孔鋪6孔板，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)過(guò)夜（24 h），先加5 μmol/L的L2H24、TBHQ各自預(yù)孵育18 h，再加H2O2刺激，2 h后收蛋白檢測(cè)MDA含量，實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.6 細(xì)胞焦亡拍片：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞，2 000個(gè)/孔鋪96孔板，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱貼壁培養(yǎng)過(guò)夜（24 h），先加L2H24預(yù)孵育18 h，再加H2O2刺激，24 h后倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變。

1.2.7 Western blot檢測(cè)：H9c2細(xì)胞30萬(wàn)/孔鋪6孔板，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)（24 h），加不同濃度的藥物孵育18 h后收蛋白或者先加藥物預(yù)孵育18 h，再加H2O2刺激24 h后收蛋白。細(xì)胞總蛋白含量用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定，用SDS-PAGE分離蛋白樣品（80 μg），然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。PVDF膜用5%的脫脂牛奶在室溫下封閉1 h，后一抗4 ℃孵過(guò)夜（HO-1 1:500；β-actin 1:2 000；Caspase-1 1:1 000；IL-1β 1:1 000）。次日，用TBST室溫下在搖床上洗3次，后二抗孵60 min。蛋白條帶由ChemiDoc XRS+系統(tǒng)成像，ImageJ軟件定量。

1.2.8 細(xì)胞中核、漿Nrf2蛋白的檢測(cè)：細(xì)胞鋪板及加藥：大鼠心肌H9c2細(xì)胞30萬(wàn)/孔鋪6孔板，37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中貼壁過(guò)夜，加DMSO、L2H24孵育6 h后收蛋白。細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白的提取：按漿蛋白提取試劑A:磷酸酶抑制劑為100:1的比例預(yù)先配制好蛋白裂解液并于冰上預(yù)冷，棄去6孔板中原有細(xì)胞培養(yǎng)基，加入PBS清洗干凈后，加入裂解液于冰上裂解10 min。用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞蛋白并收集于1.5 mL的EP管中。將收完的蛋白在渦旋儀上渦旋 15 s，冰上靜置1 min。按說(shuō)明書用量加入漿蛋白提取試劑B，渦旋5 s，冰上靜置1 min，重復(fù)兩次。以上蛋白樣品在高速離心機(jī)中以12 000×g離心 5 min。小心吸取上清液（即為漿蛋白），裝入新的EP管中備用。剩余沉淀，完全吸盡殘余的上清液，加入添加了磷酸酶抑制劑的細(xì)胞核蛋白抽提試劑，渦旋15 s，冰上靜置15 min，重復(fù)2次。之后，4 ℃ 12 000～16 000×g離心10 min。立即吸取上清液至一預(yù)冷的EP管中，即為抽提得到的細(xì)胞核蛋白，可以-70 ℃凍存?zhèn)溆?。后以Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白，一抗稀釋度：Nrf2 1:500，PCNA 1:1 000，GAPDH 1:2 000。

1.2.9 小干擾RNA沉默實(shí)驗(yàn)：以Nrf2為靶點(diǎn)的si-RNA序列是由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并化學(xué)合成，nrf2-rat-1482的序列為sense（5’-3’）GGAGAGGGAAGAAUAAAGUTT，antisense（5’-3’）ACUUU AUUCUUCCCUCUCCTT。將大鼠心肌H9c2細(xì)胞以80萬(wàn)/皿 鋪中皿，待細(xì)胞貼壁后加入按照說(shuō)明書配制好的nrf2-rat-1482或Negtive Control序列（6 μL/mL，2 mL體系），用Lipofectamine 2000于饑餓培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染12 h，之后換為正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，剩余細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng) 48 h后收蛋白檢測(cè)Nrf2-si-RNA干擾效果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上，數(shù)據(jù)以表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H2O2損傷對(duì)H9c2心肌細(xì)胞存活率的影響 不同濃度的H2O2（100、200、300、400、500、600 μmol/L） 刺激H9c2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率隨著H2O2濃度的增加而不斷降低，呈現(xiàn)濃度依賴性。H2O2抑制細(xì)胞活力的IC50約為500 μmol/L。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選擇500 μmol/L濃度的H2O2構(gòu)建心肌氧化損傷細(xì)胞模型。見圖2。

圖2 不同濃度H2O2刺激對(duì)H9c2細(xì)胞存活率的影響

2.2 H2O2介導(dǎo)H9c2細(xì)胞的氧化損傷 與對(duì)照組比，H2O2損傷降低了H9c2細(xì)胞在極低密度時(shí)的增殖能力，嚴(yán)重抑制了細(xì)胞的集落形成。MDA是由ROS引起的多不飽和脂肪酸過(guò)氧化的副產(chǎn)物，是氧化應(yīng)激的重要生物標(biāo)志物[11]。與對(duì)照組（100%）相比，H2O2處理2 h后，H2O2損傷模型組細(xì)胞中的MDA含量（234.0± 10.4）%明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。過(guò)量產(chǎn)生的ROS會(huì)促使細(xì)胞發(fā)生焦亡[12]。在H2O2損傷模型組中觀察到大量焦亡細(xì)胞腫脹膨大，并且有許多氣泡狀突出物。見圖3。

圖3 H2O2對(duì)H9c2心肌細(xì)胞氧化損傷和焦亡的影響

2.3 L2H24對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的H9c2細(xì)胞具有保護(hù)作用 與對(duì)照組比，H2O2組細(xì)胞存活率約為50%，用L2H24預(yù)孵育18 h后，氧化損傷的H9c2心肌細(xì)胞的存活率增加（P＜0.05），且隨著劑量的增加，存活率顯著升高，5 μmol/L濃度的L2H24對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用明顯優(yōu)于相同濃度的陽(yáng)性對(duì)照藥TBHQ。集落克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，H2O2損傷抑制了心肌細(xì)胞的克隆形成能力，而L2H24預(yù)孵育18 h可逆轉(zhuǎn)上述情況。與對(duì)照組比，H2O2組細(xì)胞中的MDA含量明顯升高，而用L2H24預(yù)孵育18 h后，氧化損傷的心肌細(xì)胞中的MDA含量明顯降低（P＜0.05），且其降低MDA的能力明顯優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥TBHQ。見圖4。

圖4 L2H24對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷的H9c2細(xì)胞的保護(hù)作用

2.4 L2H24改善H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞焦亡 L2H24預(yù)孵育18 h后，H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡現(xiàn)象得到改善。Western blot及其定量結(jié)果顯示，與對(duì)照組比，H2O2損傷組細(xì)胞中焦亡相關(guān)蛋白Caspase-1 p48、Caspase-1 p20、IL-1β的表達(dá)均增加（P＜ 0.05）。經(jīng)L2H24處理后，細(xì)胞中Caspase-1 p48、Caspase-1 p20、IL-1β的表達(dá)降低（P＜0.05）。見圖5。

圖5 L2H24改善H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞焦亡

2.5 L2H24促進(jìn)Nrf2易位入核并增加其下游抗氧化蛋白HO-1的表達(dá) 氧化損傷相關(guān)蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，L2H24給藥組細(xì)胞核中的Nrf2表達(dá)水平顯著上調(diào)，而胞漿中Nrf2蛋白表達(dá)水平則明顯降低（P＜0.05），即L2H24能促進(jìn)Nrf2易位入核。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，L2H24能上調(diào)H9c2細(xì)胞中Nrf2下游抗氧化蛋白HO-1的表達(dá)水平。與DMSO組相比，L2H24以較低濃度（1.25 μmol/L）孵育細(xì)胞就能顯著上調(diào)細(xì)胞中的抗氧化蛋白HO-1的表達(dá)（P＜0.05），并且藥物濃度越高，HO-1蛋白表達(dá)水平隨之升高。見圖6。

圖6 L2H24促進(jìn)H9c2細(xì)胞中Nrf2易位入核并增加其下游抗氧化蛋白HO-1的表達(dá)

2.6 干擾Nrf2的表達(dá)抑制了L2H24對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化受損心肌細(xì)胞的保護(hù)作用 運(yùn)用Nrf2-si-RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，心肌細(xì)胞中Nrf2表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，L2H24可明顯提高對(duì)照si-RNA組（NC）中氧化受損細(xì)胞的存活率（P＜0.05），促進(jìn)NC組中H2O2損傷細(xì)胞的集落形成，降低細(xì)胞中脂質(zhì)過(guò)氧化水平（P＜0.05），改善心肌細(xì)胞焦亡，而在si-Nrf2組細(xì)胞中，L2H24并未顯現(xiàn)出相同的細(xì)胞保護(hù)活性。見圖7。

圖7 干擾Nrf2的表達(dá)抑制了L2H24對(duì)氧化受損心肌細(xì)胞的保護(hù)作用

3 討論

查耳酮類化合物廣泛分布于蔬菜、水果、茶葉和其他植物中[13]，近年來(lái)，因其具多樣的生物活性如抗菌、抗癌、抗炎、抗病毒、抗氧化和抗?jié)兊榷鹑藗兊膹V泛關(guān)注[14]。報(bào)道顯示，查耳酮類化合物在高血壓、心律失常、心肌梗死和心力衰竭等多種心血管疾病的治療中發(fā)揮重要作用[15]。已有研究發(fā)現(xiàn)某些查耳酮類化合物可通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平來(lái)減輕心肌組織損傷，如天然抗氧化劑異甘草素能通過(guò)激活A(yù)MPK/ERK信號(hào)通路改善缺氧心肌細(xì)胞的收縮功能障礙[16]，還能通過(guò)抑制高血糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激減輕糖尿病性心肌病[17]；玉郎傘查耳酮能通過(guò)激活JAK2/STAT3通路減輕大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷[18]；Aza白藜蘆醇-查耳酮衍生物6b通過(guò)減輕炎癥和氧化應(yīng)激改善小鼠糖尿病性心肌病[19]?；谝陨蠄?bào)道，本研究旨在探討查耳酮衍生物L(fēng)2H24在氧化應(yīng)激相關(guān)的心肌細(xì)胞損傷中的保護(hù)作用及其分子機(jī)制。

H2O2作為一種內(nèi)源性細(xì)胞信號(hào)分子，可以在較短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生自由基，氧化DNA、蛋白質(zhì)和核酸，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞氧化損傷模型中[20]。本研究采用H2O2刺激大鼠心肌H9c2細(xì)胞建立心肌氧化應(yīng)激損傷模型來(lái)模擬體內(nèi)氧化應(yīng)激病理過(guò)程，發(fā)現(xiàn)500 μmol/L濃度的H2O2嚴(yán)重抑制了H9c2細(xì)胞的集落形成，顯著上調(diào)了細(xì)胞氧化損傷后產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA的水平。查耳酮衍生物L(fēng)2H24能夠呈劑量依賴性地增加H2O2損傷的H9c2細(xì)胞的存活率，促進(jìn)細(xì)胞集落形成，同時(shí)顯著減少細(xì)胞中MDA的水平，對(duì)氧化損傷的心肌細(xì)胞具有良好的保護(hù)作用。

細(xì)胞焦亡是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)并證實(shí)的一種新的程序性細(xì)胞死亡，又稱細(xì)胞炎性壞死，表現(xiàn)為細(xì)胞不斷脹大直至細(xì)胞膜破裂，導(dǎo)致大量促炎因子釋放進(jìn)而激活強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[21]。促炎Caspase亞家族中的Caspase-1可通過(guò)激活典型的炎癥小體途徑，介導(dǎo)焦亡的發(fā)生[22]。Caspase-1又被稱為IL-1β的加工酶，能介導(dǎo)產(chǎn)生成熟的IL-1β，這是一種重要的促炎細(xì)胞因子，參與多種人類疾病進(jìn)程[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2刺激能誘導(dǎo)心肌H9c2細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹膨大，并產(chǎn)生有許多氣泡狀突出物，發(fā)生嚴(yán)重的細(xì)胞焦亡現(xiàn)象，而查耳酮衍生物L(fēng)2H24能夠明顯改善氧化損傷細(xì)胞的焦亡現(xiàn)象。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，L2H24能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的Caspase-1/IL-1β活化。

核因子相關(guān)因子2，又稱NFE2L2或Nrf2，是調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)和細(xì)胞保護(hù)基因的關(guān)鍵分子[25-26]。Nrf2在肝臟、心臟、大腦、腎臟、血管和肌肉等多種耗氧器官中均有表達(dá)[27]。正常情況下Nrf2的表達(dá)僅限于細(xì)胞質(zhì)，并以非活性形式存在。內(nèi)源性抑制劑Keap1與Nrf2的相互作用促進(jìn)了Nrf2的蛋白酶體降解[28]。然而，在氧化應(yīng)激條件下，產(chǎn)生的ROS破壞了Keap1與Nrf2的相互作用，Nrf2被釋放入細(xì)胞核，并與ARE結(jié)合，激活其下游基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而翻譯出一系列相關(guān)蛋白，發(fā)揮生理功能[29]，HO-1就是其下游一個(gè)重要的抗氧化蛋白[30]，故L2H24是否通過(guò)影響Nrf2/HO-1信號(hào)通路對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞起保護(hù)作用值得被探討。本研究結(jié)果表明，L2H24能促進(jìn)Nrf2易位入核并顯著上調(diào)H9c2細(xì)胞中其下游抗氧化的HO-1蛋白的表達(dá)水平。為了進(jìn)一步確證化合物L(fēng)2H24是否通過(guò)靶向Nrf2信號(hào)通路對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的心肌細(xì)胞起保護(hù)作用，我們運(yùn)用小分子RNA技術(shù)干擾了H9c2細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)，結(jié)果顯示，沉默Nrf2抑制了L2H24對(duì)H2O2氧化損傷細(xì)胞的保護(hù)作用，說(shuō)明L2H24可能通過(guò)激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路，從而對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的心肌H9c2細(xì)胞起到保護(hù)作用。

新近研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激與細(xì)胞焦亡的發(fā)生息息相關(guān)，過(guò)量ROS可激活NLRP3炎癥小體并參與細(xì)胞焦亡途徑[12]，鐵激活的ROS通過(guò)ROS-Tom20-Caspase-3-GSDME信號(hào)通路誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞焦 亡[31]，線粒體ROS通過(guò)誘導(dǎo)GSDMD氧化促使巨噬細(xì)胞焦亡[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，小分子RNA技術(shù)干擾Nrf2的表達(dá)抑制了L2H24對(duì)H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞焦亡的保護(hù)作用，側(cè)面證實(shí)了氧化應(yīng)激與細(xì)胞焦亡的發(fā)生有關(guān)，這與文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果一致。研究結(jié)果表明，L2H24可能通過(guò)激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路，從而對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌H9c2細(xì)胞焦亡起到保護(hù)作用。

綜上所述，L2H24對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的心肌細(xì)胞具有良好的保護(hù)作用，其可能是通過(guò)激活Nrf2/HO-1抗氧化信號(hào)通路來(lái)改善細(xì)胞氧化應(yīng)激及焦亡。本研究初步證明了L2H24對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的心肌細(xì)胞的抗氧化和抗焦亡保護(hù)作用及其相關(guān)分子機(jī)制，為心肌氧化損傷的治療提供新的候選抗氧化劑。