張煜，吳芬芳，張夢(mèng)，田海山，李校堃

溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035

近年來糖尿病已發(fā)展成為威脅人類健康的主要重大疾病[1-2]，而糖尿病性血管并發(fā)癥是該病最主要的致殘致死原因[3-5]，內(nèi)皮功能障礙是其發(fā)病的主要機(jī)制之一。持續(xù)的高血糖狀況導(dǎo)致心血管內(nèi)皮細(xì)胞代謝紊亂和氧化應(yīng)激，從而引起滲透性增加、內(nèi)皮舒張受損等，最終導(dǎo)致血管損傷[6]。因此，發(fā)現(xiàn)修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的候選藥物，研究其促血管修復(fù)作用的機(jī)制對(duì)糖尿病性血管并發(fā)癥的治療具有重要意義，并可能會(huì)揭示其新的潛在治療靶點(diǎn)。

成纖維細(xì)胞生長因子4（fibroblast growth factor 4，F(xiàn)GF4）是由hst-1原癌基因編碼的一種生長因子[7-8]。研究表明，F(xiàn)GF4蛋白在體內(nèi)外均具有顯著的促血管生成活性，并被證明在新生毛細(xì)血管的生長及在動(dòng)脈生成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。據(jù) 此，我們?cè)贕enBank中查找到人FGF4（hFGF4）的編碼基因，通過密碼子優(yōu)化在大腸桿菌中高效表達(dá)并純化，對(duì)高糖誘導(dǎo)損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）模型的修復(fù)及相關(guān)作用機(jī)制開展研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體及細(xì)胞：原核表達(dá)載體pET3d、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞和大腸桿菌BL21（DE3）PlysS宿主菌均由本實(shí)驗(yàn)室提供，原代HUVEC及NIH3T3細(xì)胞均由實(shí)驗(yàn)室自備。

1.1.2 主要試劑：質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、限制性核酸內(nèi)切酶NcoI和BamHI均購自英國BioLabs公司；Triton X-100購自北京索萊寶科技有限公司；氨芐霉素、氯霉素以及IPTG購自上海捷瑞生物工程有限公司；去氧膽酸鈉購自合肥Biosharp公司；DMEM低糖培養(yǎng)基和MCDB131培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；ECM培養(yǎng)基購自美國ScienCell公司；PMSF、丙二醛（methylene dioxyamphetamine，MDA）檢測試劑盒以及活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；p-JNK、JNK、p-p65、p65、p-p38、p38、β-actin等抗體均購自美國CST公司；rhFGF2（bFGF）蛋白由本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.1.3 HUVEC的原代分離及培養(yǎng)：無菌條件下，將人臍帶放入含預(yù)熱PBS的培養(yǎng)皿中，剪去血腫部分并擠出臍帶血。將平針頭注射器從一端插入臍靜脈，止血鉗固定，預(yù)熱的PBS沖洗血跡至完全干凈。隨后用0.1%膠原酶II灌注使其充盈。取出針頭，止血鉗夾住注入端，移入培養(yǎng)皿中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育30 min后收集臍靜脈內(nèi)的消化液。注入含10%胎牛血清的ECM培養(yǎng)液再次沖洗管腔，將消化液與沖洗液一并收集于離心管，1 000 r/min，5 min，棄上清液，加入ECM完全培養(yǎng)液，按1×106個(gè)/mL接種于培養(yǎng)瓶，使用ECM完全培養(yǎng)基于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)。當(dāng)長至80%左右，用含EDTA的胰酶消化傳代。給藥時(shí)使用含2% FBS和1%雙抗的MCDB131饑餓培養(yǎng)基。

1.1.4 NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)：將凍存的NIH3T3細(xì)胞復(fù)蘇后，使用DMEM低糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中。長至80%左右，用含EDTA的胰酶消化傳代。給藥時(shí)使用含2% FBS和1%雙抗的DMEM低糖饑餓培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 pET3d-hFGF4重組質(zhì)粒的構(gòu)建：由蘇州GENEWIZ公司優(yōu)化并合成基因hFGF4（GenBank accession NO.NM_002007.3），將基因克隆至載體pUC57-Amp，含有NcoI和BamHI兩個(gè)酶切位點(diǎn)。用膠回收試劑盒提取由這兩種限制性核酸內(nèi)切酶切割得到的目的片段和pET3d表達(dá)載體，通過DNA連接酶連接，得到pET3d-hFGF4重組質(zhì)粒。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過雙酶切和基因測序進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.2 rhFGF4蛋白的表達(dá)：提取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21（DE3）PlysS宿主菌中，用含有雙抗（100 μg/mL的氨芐青霉素和34 μg/mL的氯霉素）的LB瓊脂平板篩選。將陽性克隆接種到含有雙抗的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min震蕩培養(yǎng)至A600達(dá)到0.8～1.2，加入IPTG（終濃度0.5 mmol/L）誘導(dǎo)表達(dá)4 h，Western blot進(jìn)行鑒別實(shí)驗(yàn)。SDS-PAGE檢測篩選出高表達(dá)單菌落并將其制備成甘油菌，超低溫冰箱保存。取制備的甘油菌以1:100（V/V）接種到含有雙抗的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行種子擴(kuò)增，以180 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)至A600達(dá)到3.0～4.0。再將該菌液以1:20的比例接種于新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā) 酵，以180 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)至A600達(dá)到0.8～1.2，加入IPTG（終濃度0.5 mmol/L）誘導(dǎo)4 h，4 ℃，9 000 r/min離心10 min后收菌并凍存于-80 ℃。

1.2.3 rhFGF4菌體破碎：稱取菌體懸浮于40倍量（g/mL）裂解液（10 mmol/L PB，0.1 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA-2Na，0.05% Tween-80，1 mmol/L PMSF，pH 7.4）中，充分?jǐn)噭?，冰浴條件下超聲破碎，至鏡檢下可見視野范圍內(nèi)無完整大腸桿菌。將破菌后的液體用高速冷凍離心機(jī)在4 ℃、20 000 r/min離心30 min。取上清液和沉淀，取樣進(jìn)行12% SDSPAGE電泳，鑒定rhFGF4蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)形式。

1.2.4 rhFGF4包涵體清洗及變性：可溶性分析結(jié)果示rhFGF4蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，因此先進(jìn)行多步包涵體洗滌操作去除膜蛋白、核酸及脂類等雜質(zhì)，再進(jìn)行變性溶解。取菌體破碎離心后的沉淀，加入40倍量（g/mL）洗滌緩沖液1（10 mmol/L PB，0.1 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA-2Na，1% Triton X-100，0.2%去氧膽酸鈉，pH 7.4），充分混勻后室溫下磁力攪拌洗滌2 h，4 ℃、20 000 r/min離心30 min，棄上清液留沉淀；稱取沉淀，加入40倍量（g/mL）洗滌緩沖液2（10 mmol/L PB，0.1 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA-2Na，1% Triton X-100，pH 7.4），充分混勻后室溫磁力攪拌洗滌2 h，4 ℃、 20 000 r/min離心30 min，棄上清液留沉淀。取沉淀，加入40倍量（g/mL）洗滌緩沖液3（10 mmol/L PB，0.1 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA-2Na，1% Triton X-100，2 mol/L脲，pH 7.4），充分混勻后室溫磁力攪拌洗滌2 h，4 ℃、20 000 r/min離心30 min，棄上清液得包涵體。以上每一步取沉淀和上清液進(jìn)行12% SDS-PAGE檢測。精密稱取包涵體，加入20倍量（g/mL）變性液（10 mmol/L PB，0.05 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA-2Na，8 mol/L脲，10 mmol/L DTT，pH 7.4），充分混勻后在磁力攪拌條件下低溫溶解過夜（8～10 ℃，12 h以上），8 ℃、20 000 r/min離心30 min，取上清液得到包涵體變性溶液。

1.2.5 rhFGF4蛋白的純化：在蛋白純化設(shè)備（美國GE公司，AKTA pure）上，用10倍體積平衡液（10 mmol/L PB，0.05 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA-2Na， 8 mol/L脲，10 mmol/L DTT，pH 7.4）平衡肝素柱，流速1 mL/min；以0.5 mL/min上變性后的蛋白樣品，再用上述平衡液以流速0.5 mL/min充分平衡后開始進(jìn)行梯度復(fù)性。A液：10 mmol/L PB，0.05 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA-2Na，8 mol/L脲，10 mmol/L DTT，pH 7.4；B液：10 mmol/L PB，0.05 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA-2Na，10 mmol/L DTT，pH 7.4，梯度設(shè)置見表1。復(fù)性完全后，用含0.1、0.3、0.6、1.2、2.0 mol/L NaCl的洗脫液（10 mmol/L PB， 2 mmol/L EDTA-2Na，pH 7.4）進(jìn)行洗脫（10個(gè)柱體 積，1 mL/min），收集各階段的穿出峰，用12% SDSPAGE檢測。

表1 柱上復(fù)性梯度設(shè)置

1.2.6 MTT實(shí)驗(yàn)：計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，以4 000個(gè)/孔鋪于96孔板中。當(dāng)細(xì)胞貼壁后，去除完全培養(yǎng)基，加入饑餓培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h。為驗(yàn)證rhFGF4蛋白的促增殖作用，加入不同濃度梯度的rhFGF4蛋白，并以bFGF蛋白作為陽性對(duì)照組、PBS作為陰性對(duì)照組。為驗(yàn)證rhFGF4蛋白對(duì)高糖損傷的HUVEC有修復(fù)作用，加入葡萄糖溶液培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度梯度的rhFGF4蛋白作用24 h，加入MTT避光培養(yǎng)4 h。去除培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，測定490 nm處吸光度。

1.2.7 MDA的測定：將HUVEC細(xì)胞鋪于6孔板中，用葡萄糖溶液損傷24 h后，每孔加入不同濃度的rhFGF4蛋白，24 h后獲取總蛋白，用BCA試劑盒測定濃度，使用MDA檢測試劑盒測定其含量。

1.2.8 Western blot分析：提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒測定濃度，12% SDS-PAGE膠的上樣孔中每孔加入25 μg蛋白樣品，電泳結(jié)束后采用濕法轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂牛奶中封閉1 h，TBST清洗3次，每次 6 min，4 ℃搖床上過夜孵育抗體：p-JNK（1:1 000），JNK（1:1 000），p-p65（1:1 000），p65（1:1 000），p-p38（1:1 000），p38（1:1 000），β-actin（1:5 000）。TBST清洗3次，每次6 min，在室溫下孵育羊抗兔或鼠IgG二抗（1:8 000）1 h，TBST清洗3次，每次 6 min，用Western blot Luminol檢測條帶，并用Image lab軟件進(jìn)行定量。

1.2.9 流式細(xì)胞儀測定ROS含量：將HUVEC鋪于6孔板中，用35 mmol/L葡萄糖損傷24 h后，分別加入不同濃度梯度的rhFGF4蛋白，作用24 h，使用ROS檢測試劑盒處理細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測ROS含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以表示。使用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，Tukey進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將構(gòu)建于克隆載體pUC57上的hFGF4基因（542 bp）用NcoI和BamHI酶切并與pET3d表達(dá)載體（4 637 bp）連接，隨機(jī)挑選陽性菌株進(jìn)行雙酶切鑒定。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒酶切后表達(dá)載體與目的基因大小與理論值相符，表明成功構(gòu)建pET3d-hFGF4重組質(zhì)粒。見圖1。

圖1 pET3d-hFGF4重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.2 rhFGF4蛋白的表達(dá)與純化 選取不同單菌落培養(yǎng)誘導(dǎo)，通過SDS-PAGE檢測篩選出高表達(dá)菌株并將其制備成甘油菌。取甘油菌培養(yǎng)后誘導(dǎo)4 h，SDSPAGE結(jié)果見圖2A，Western blot鑒定結(jié)果呈陽性反應(yīng)，見圖2B，表明制備的重組質(zhì)粒穩(wěn)定表達(dá)rhFGF4蛋白。常溫（37 ℃）誘導(dǎo)目的蛋白大部分以包涵體形式表達(dá)，低溫（20 ℃）誘導(dǎo)亦不能促進(jìn)其可溶性表達(dá)量，表明在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中rhFGF4蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，見圖2C和2D。將包涵體清洗后，用含8 mol/L脲的變性液溶解過夜，大部分目的蛋白可溶解于變性溶液中，見圖2E。將蛋白在變性條件下進(jìn)行肝素親和柱層析，用A液平衡后與復(fù)性液B進(jìn)行梯度復(fù)性。復(fù)性完全后，再利用目的蛋白、雜質(zhì)與肝素的親和力不同，通過調(diào)節(jié)NaCl濃度進(jìn)行洗脫，獲得純度＞95%的rhFGF4蛋白，見圖2F。

圖2 rhFGF4蛋白的表達(dá)與純化

2.3 rhFGF4蛋白促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞及HUVEC增殖 MTT法檢測rhFGF4蛋白對(duì)NIH3T3細(xì)胞和HUVEC的促增殖作用，以bFGF蛋白作為陽性對(duì)照。圖3A顯示，不同濃度下的rhFGF4蛋白均能促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞的增殖，并在0～320.0 ng/mL內(nèi)呈劑量依賴性，表明純化的蛋白具有良好的生物學(xué)活性。圖3B顯示，rhFGF4蛋白能促進(jìn)HUVEC的增殖，以濃度為80 ng/mL 及以上的促增殖作用最為顯著。

圖3 rhFGF4蛋白對(duì)NIH3T3細(xì)胞和HUVEC的促增殖活性

2.4 rhFGF4對(duì)高糖損傷的HUVEC具有修復(fù)作用 HUVEC鋪于6孔板中，用不同濃度葡萄糖溶液損傷24 h，MTT法測量吸光度值。結(jié)果顯示，葡萄糖溶液濃度為35 mmol/L時(shí)細(xì)胞死亡率約為50%，選擇該濃度建立HUVEC損傷模型，見圖4。HUVEC損傷24 h后，更換含有不同rhFGF4蛋白濃度的饑餓培養(yǎng)基作用24 h，并以bFGF蛋白作為陽性對(duì)照，MTT法測量吸光度值。結(jié)果顯示，rhFGF4蛋白對(duì)葡萄糖溶液損傷的HUVEC具有顯著的保護(hù)作用，并呈現(xiàn)劑量依賴性，見圖5。

圖4 不同濃度葡萄糖對(duì)HUVEC活力的影響

圖5 不同濃度rhFGF4蛋白對(duì)高糖損傷的HUVEC的促增殖作用

2.5 rhFGF4蛋白減少高糖損傷的HUVEC的MDA含量 高糖損傷HUVEC 24 h后，加入不同濃度rhFGF4蛋白作用24 h，收集蛋白測定MDA含量，結(jié)果顯示，與高糖損傷組（HG組）相比，不同濃度的rhFGF4蛋白均能顯著降低細(xì)胞內(nèi)MDA含量，并呈現(xiàn)劑量依賴性，見圖6。

圖6 不同濃度rhFGF4蛋白對(duì)HUVEC中MDA含量的影響

2.6 rhFGF4蛋白減少高糖誘導(dǎo)的JNK、p38 MAPK以及NF-κB磷酸化的表達(dá) 結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)增加p-JNK、p-p38以及p-NF-κB的磷酸化水平，而rhFGF4蛋白可以顯著抑制高糖誘導(dǎo)下的上述蛋白的過表達(dá)，見圖7。

圖7 rhFGF4蛋白對(duì)高糖誘導(dǎo)的JNK、NF-κB以及p38 MAPK磷酸化的影響

2.7 rhFGF4減少高糖損傷的HUVEC中ROS含量 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，高糖損傷HUVEC導(dǎo)致ROS含量增加（P＜0.05），見圖8A。高糖損傷24 h后，加入rhFGF4培養(yǎng)24 h，結(jié)果顯示，不同濃度的rhFGF4蛋白均能顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS含量（P＜0.05），見圖8B。

圖8 rhFGF4對(duì)高糖損傷的HUVEC中ROS含量的影響

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞是襯于血管內(nèi)表面的單層扁平上皮細(xì)胞，是血液與組織之間的重要屏障[10]。糖尿病患者長期且持續(xù)的高血糖可降低血管內(nèi)皮細(xì)胞DNA含量，影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的更新，進(jìn)而加速內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，最終導(dǎo)致血管損傷，引發(fā)心腦血管、下肢血管等的病變[11]。因此，研究高糖條件下對(duì)血管損傷的保護(hù)和修復(fù)，具有重要的臨床意義。

已有文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)GF4蛋白作為重要的血管生長因子，通過MAPK途徑參與調(diào)控細(xì)胞分化[12]，并以自分泌的方式誘導(dǎo)VEGF分泌，間接促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從而加速新生血管的形成[13]。由拜耳先靈制藥公司開發(fā)的Alferminogene tadenovec是一種可編碼人FGF4基因進(jìn)而促進(jìn)血管形成的基因治療藥物，主要用于心臟微血管缺陷導(dǎo)致的心肌缺血和慢性心絞痛患者[14-15]。但是，在高糖條件下FGF4蛋白是否仍對(duì)血管損傷具有保護(hù)和修復(fù)作用，目前尚未見相關(guān)研究報(bào)道。

為探討rhFGF4蛋白對(duì)血管的作用，本研究提取原代HUVEC作為檢測細(xì)胞株，陽性對(duì)照選擇FGFs中具有強(qiáng)促血管生成作用的bFGF蛋白[16-17]，結(jié)果表明，HUVEC活力下降是由高糖而非高滲引起，實(shí)驗(yàn)組rhFGF4蛋白顯著促進(jìn)HUVEC增殖，并在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性，與bFGF蛋白促增殖作用相仿。建立高糖誘導(dǎo)損傷HUVEC模型，進(jìn)一步探究rhFGF4蛋白對(duì)其保護(hù)作用，結(jié)果表明，rhFGF4蛋白顯著促進(jìn)受損的HUVEC細(xì)胞增殖，并呈劑量依賴性，其中80 ng/mL 為最適宜濃度，其作用效果優(yōu)于對(duì)照組bFGF蛋白。

研究表明，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致糖尿病性血管病變的重要機(jī)制[18]。本研究通過檢測高糖誘導(dǎo)損傷HUVEC模型檢測細(xì)胞中的ROS、MDA指標(biāo)的變化，探討rhFGF4蛋白改善血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的可能作用機(jī)制，結(jié)果顯示，與正常葡萄糖的環(huán)境相比，在高葡萄糖環(huán)境中HUVEC ROS、MDA含量顯著增加，而給予rhFGF4蛋白可以顯著降低高糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS、MDA含量。此外，p-38和JNK調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路，參與氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，氧自由基的形成會(huì)導(dǎo)致NF-κB的激活從而引起細(xì)胞凋亡[19-21]。通過檢測與氧化應(yīng)激相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵蛋白p-38、JNK以及NF-κB發(fā)現(xiàn)，rhFGF4蛋白在高糖損傷的HUVEC中可以抑制以上三個(gè)蛋白的磷酸化，從而保護(hù)HUVEC。實(shí)驗(yàn)中原代HUVEC過于脆弱，在饑餓過程中會(huì)產(chǎn)生些許損傷，所以Western blot結(jié)果示意圖中，空白對(duì)照組的磷酸化程度也略有提高。

綜上，本研究提示rhFGF4蛋白可能通過改善氧化應(yīng)激水平從而對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVEC起保護(hù)作用。后續(xù)需要進(jìn)一步通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，rhFGF4蛋白在高糖條件下對(duì)血管的保護(hù)和生成作用及機(jī)制，為臨床藥物的開發(fā)提供依據(jù)。