章熙東 （南京外國(guó)語學(xué)校 江蘇南京 210008）

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，簡(jiǎn)稱PCR）是一種快速、特異性擴(kuò)增某特定片段DNA 的分子生物學(xué)技術(shù)，在生命科學(xué)研究中有廣泛的應(yīng)用，尤其在2020 年新型冠狀病毒檢測(cè)中以“快速、準(zhǔn)確、高效”的篩選出新型冠狀肺炎患者突顯PCR 的技術(shù)魅力[1]。在高中生物學(xué)教學(xué)中，PCR 屬于選擇性必修模塊3《生物技術(shù)與工程》中“基因工程”教學(xué)的一部分，可用于“提取目的基因和擴(kuò)增目的基因”，其理論基礎(chǔ)涉及必修2《遺傳與進(jìn)化》“DNA 結(jié)構(gòu)與復(fù)制”等內(nèi)容。《普通高中生物學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)（2017 年版）》明確指出，在幫助學(xué)生達(dá)成“基因工程賦予生物新的遺傳特性”大概念的理解時(shí)，應(yīng)通過開展“PCR 擴(kuò)增DNA 片段并完成電泳鑒定”，促進(jìn)學(xué)生生物學(xué)學(xué)科核心素養(yǎng)的提升。因此，高中階段開展PCR 實(shí)驗(yàn)，利于培養(yǎng)學(xué)生結(jié)構(gòu)與功能觀、物質(zhì)與能量觀等生命觀念，利于學(xué)生在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、操作實(shí)驗(yàn)中提升科學(xué)思維品質(zhì)和科學(xué)探究能力，利于在對(duì)新冠肺炎疫情等社會(huì)熱點(diǎn)議題討論中培養(yǎng)社會(huì)責(zé)任。但在實(shí)際教學(xué)中，由于儀器的缺乏，PCR 技術(shù)的教學(xué)還是浮于紙面。即使有PCR儀，由于實(shí)驗(yàn)成本較高，操作過程復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，往往僅讓學(xué)生參觀儀器，而讓PCR 儀成為擺設(shè)。“重理論，輕實(shí)踐；重解題，輕技術(shù)”的現(xiàn)象沒有得到改變。因此，將菌落PCR 引入高中課堂，能降低成本、縮短時(shí)間，讓PCR 實(shí)驗(yàn)真正走入高中課堂，讓學(xué)生親歷實(shí)驗(yàn)過程，掌握PCR 技術(shù)，發(fā)展生物學(xué)學(xué)科核心素養(yǎng)。

基于真實(shí)情境下的問題解決能力的培養(yǎng)更利于培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新精神，因此，面對(duì)“土壤磷元素缺乏，影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)”的世界性問題，提高土壤中有效磷元素的含量是科學(xué)家迫切想要解決的問題之一。土壤中難溶性磷的轉(zhuǎn)化依賴于一類解磷菌的微生物[2]（主要為細(xì)菌），因此，通過項(xiàng)目式學(xué)習(xí)，帶領(lǐng)學(xué)生分離純化并鑒定土壤中的解磷菌，具有重要的社會(huì)意義。同時(shí)，讓學(xué)生在問題解決中習(xí)得知識(shí)，掌握技術(shù)，培養(yǎng)能力，是新課程理念所倡導(dǎo)的教學(xué)方式。

1 菌落PCR

菌落PCR（colony PCR）可不必提取目的基因DNA，不必酶切鑒定，直接以菌體熱解后暴露的DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，省時(shí)省力，常應(yīng)用于快速鑒定菌落是否為含目的基因的陽性菌落。與普通DNA 的PCR 相比，菌落易獲得，少了提取目的基因步驟而省時(shí)，也因不必購買目的基因，一般中學(xué)實(shí)驗(yàn)室就可操作。而且，可與“微生物的分離與培養(yǎng)”實(shí)驗(yàn)專題相銜接，教學(xué)設(shè)計(jì)時(shí)可作為1 個(gè)單元的整體化設(shè)計(jì)。

2 實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果

2.1 菌落獲得 本實(shí)驗(yàn)采用的菌落為在“微生物的分離與培養(yǎng)”實(shí)驗(yàn)中，校園“尋找高效解磷菌，緩解土壤缺磷”的項(xiàng)目式學(xué)習(xí)的學(xué)生從校園土壤中所分離出的解磷菌菌落[3]。挑選了解磷圈較大較明顯的菌落（圖1），用于PCR 和菌種鑒定。

圖1 出現(xiàn)解磷圈的菌落

2.2 菌落PCR

1）制備菌懸液：用高壓蒸汽滅菌過的無菌牙簽挑取解磷菌的單個(gè)菌落，置于20μL ddH2O 中攪拌，將裝有20μL ddH2O 的PCR 管在100 ℃下煮2 min，冷卻后成為菌懸液。

2）設(shè)計(jì)引物：采用細(xì)菌16S rRNA 基因通用引物進(jìn)行菌落PCR，引物序列為27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。

3）擴(kuò)增體系：擴(kuò)增體系20 μL，F(xiàn)ast PCR Master Mix 體系（TaKaRa）10μL，引物27F 與引物1492R 各1μL，菌懸液1μL，ddH2O 7μL（菌懸液與ddH2O 加入量視菌懸液濃度及時(shí)調(diào)整）。

4）菌落PCR 反應(yīng)條件設(shè)定：94℃預(yù)變性1 min；98℃變性5 s，55℃退火5s，72℃延伸20 s，變性退火延伸共30 個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，72℃保溫10 min（使延伸更充分）（圖2）；4 ℃保存。

圖2 PCR 參數(shù)設(shè)置

5）PCR儀器擴(kuò)增。Bio-Rad PCR儀T100，96孔。

2.3 凝膠電泳 電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過程。DNA 分子帶有負(fù)電，在電場(chǎng)的作用下，DNA 分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。利用DNA 樣品分子本身的大小，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)不同大小DNA 分子的分離。瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)可用于對(duì)PCR 擴(kuò)增成功與否進(jìn)行鑒定，從而為后續(xù)的基因測(cè)序提供保證。

1）制膠：PCR 擴(kuò)增期間，配制1%瓊脂糖凝膠。稱取1 g 瓊脂糖加入至100 mL 1×TAE 緩沖液中，微波加熱溶解；溶解后加入GelRed 核酸染料，倒入制膠板中，置于室溫下待凝固（約20 min）。

2）點(diǎn)樣：取5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物與上樣緩沖液混合，將混合液點(diǎn)樣至1%瓊脂糖凝膠中。

3）電泳：120 V 電壓下電泳15 min。

4）觀察：將電泳后的瓊脂糖凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行PCR 產(chǎn)物檢測(cè)，確認(rèn)條帶并拍照（圖3）。將剩余PCR 產(chǎn)物送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。

2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 電泳結(jié)果顯示，所有菌落擴(kuò)增后在1 465 bp 處均出現(xiàn)單一條帶（圖3），說明在所取菌落中都能擴(kuò)增出作為細(xì)菌身份的16S rRNA 基因，后續(xù)選擇清晰明顯條帶所對(duì)應(yīng)的PCR 產(chǎn)物送至基因公司進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定所分離出的菌落各屬于何種細(xì)菌。

圖3 菌落PCR 電泳圖

3 實(shí)驗(yàn)時(shí)間分配

本實(shí)驗(yàn)利用連續(xù)2 節(jié)課的時(shí)間（約80 min），完成PCR 和電泳實(shí)驗(yàn)。具體時(shí)間分配見表1。實(shí)驗(yàn)操作約55 min，其他時(shí)間用于理論指導(dǎo)、結(jié)果觀察、課堂小結(jié)等。

表1 時(shí)間安排

4 教學(xué)反思

4.1 重時(shí)間有效管理，助實(shí)驗(yàn)有序進(jìn)行 利用儀器進(jìn)行PCR 的時(shí)間進(jìn)行制膠。在儀器配置上，PCR 儀選擇96 孔為宜，且較好品牌儀器升、降溫速度較快，節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間。選用生物公司專門用于進(jìn)行菌落PCR 的試劑盒（Fast PCR Master Mix），其包含的Taq 酶高效（延伸速度為10 s/kb），可縮短PCR 中各階段的反應(yīng)時(shí)間，在30 min 內(nèi)完成PCR 擴(kuò)增，與普通PCR 相比，所用時(shí)間縮短一半。制膠板選擇雙排，一排25 孔，總共可上50 個(gè)樣，保證讓每個(gè)學(xué)生能進(jìn)行點(diǎn)樣操作。優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)，能在55 min 內(nèi)完成PCR 和電泳實(shí)驗(yàn)。

4.2 重關(guān)鍵能力培養(yǎng)，促學(xué)科素養(yǎng)提升 在進(jìn)行菌落PCR 的實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)學(xué)生的分子生物學(xué)中的關(guān)鍵能力，符合“教學(xué)過程重實(shí)踐”的新課程理念。在PCR 教學(xué)中，不只追求學(xué)會(huì)操作儀器，更應(yīng)注重學(xué)生思維品質(zhì)的提升，引發(fā)學(xué)生對(duì)“為什么要進(jìn)行PCR、如何進(jìn)行PCR、如何解讀PCR 結(jié)果”等問題的深度思考。

1）為什么要進(jìn)行PCR？在本實(shí)驗(yàn)中，基于“分離出高效解磷菌以解決土壤有效磷含量低”的現(xiàn)實(shí)問題情境，通過技術(shù)手段分離出高效解磷菌形成菌落后，需對(duì)其進(jìn)行種屬的分子鑒定以確定其系統(tǒng)發(fā)育地位，勢(shì)必要對(duì)解磷菌的DNA 進(jìn)行測(cè)序。由于Sanger 測(cè)序需要足夠濃度的DNA，因此，在測(cè)序前會(huì)先進(jìn)行PCR 擴(kuò)增目的基因。如果只需要做定性檢測(cè)，菌落PCR 能得到與常規(guī)PCR 相同的結(jié)果，且可節(jié)省大量的人力、物力和財(cái)力，因此，本實(shí)驗(yàn)選用菌落PCR。

2）如何進(jìn)行PCR？PCR 過程由PCR 儀器完成，難點(diǎn)在于需實(shí)驗(yàn)者構(gòu)建PCR 反應(yīng)體系。例如，模板的選擇、引物的設(shè)計(jì)、溫度的控制等，都是技術(shù)要點(diǎn)。

模板的選擇：在本實(shí)驗(yàn)中，細(xì)菌主要存在3 種核糖體RNA（5S、16S、23S rRNA），因16S rRNA 基因有一段高度保守的序列，并且中間的高變區(qū)序列是每種細(xì)菌獨(dú)一無二的標(biāo)記，因而設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增16S rRNA 基因這一段高度保守的序列。即“16S rRNA 基因”相當(dāng)于細(xì)菌的“身份證”，必須先拿到身份證才能進(jìn)行進(jìn)一步的鑒別，所以應(yīng)先將其擴(kuò)增再進(jìn)行序列的比對(duì)。

引物的設(shè)計(jì)：PCR 的成功與否與引物的選擇有關(guān)，設(shè)計(jì)引物的能力體現(xiàn)學(xué)生掌握PCR 的技術(shù)素養(yǎng)。針對(duì)引物的設(shè)計(jì)，如果所要擴(kuò)增的目的基因在文獻(xiàn)中沒有報(bào)道研究，則需要研究者利用引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站自行設(shè)計(jì)引物，常用的引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站有Primer blast、Primer Premier 5.0、Primer 3 Plus 等。如果該目的基因在文獻(xiàn)中已有報(bào)道研究，則可從文獻(xiàn)查到該目的基因成熟的引物序列。本研究中學(xué)生通過查找閱讀大量文獻(xiàn)，選擇16S rRNA 基因的通用引物[4]。

體系的構(gòu)建：反應(yīng)體系的量根據(jù)需求而定。本實(shí)驗(yàn)選用20 μL 的總反應(yīng)體系，使用商品化的Fast PCR Master Mix（其中包含Taq 酶、dNTP 和緩沖液），其用量及PCR 儀器參數(shù)的設(shè)置參照說明書；在20 μL 的總反應(yīng)體系中加入上、下游引物各1 μL；本實(shí)驗(yàn)中加入1 μL 菌液作為模板。

3）PCR 電泳結(jié)果的解讀：PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，在凝膠上點(diǎn)樣已知條帶大小的標(biāo)準(zhǔn)樣（DNA Marker），方便比對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大小。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果選擇條帶較亮（產(chǎn)物較多）的樣品送去測(cè)序。最終將測(cè)序結(jié)果與Genebank 數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行比對(duì)，確定菌種的系統(tǒng)發(fā)育位置。

以實(shí)踐活動(dòng)為學(xué)習(xí)起點(diǎn)，以問題解決為終點(diǎn)，學(xué)生從學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)原理，到進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，感受解決問題的快樂，從中提升綜合能力。