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        菌落PCR 在高中生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用*

        2021-07-01 03:37:46章熙東南京外國(guó)語學(xué)校江蘇南京210008
        生物學(xué)通報(bào) 2021年8期
        關(guān)鍵詞:解磷瓊脂糖電泳

        章熙東 (南京外國(guó)語學(xué)校 江蘇南京 210008)

        多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,簡(jiǎn)稱PCR)是一種快速、特異性擴(kuò)增某特定片段DNA 的分子生物學(xué)技術(shù),在生命科學(xué)研究中有廣泛的應(yīng)用,尤其在2020 年新型冠狀病毒檢測(cè)中以“快速、準(zhǔn)確、高效”的篩選出新型冠狀肺炎患者突顯PCR 的技術(shù)魅力[1]。在高中生物學(xué)教學(xué)中,PCR 屬于選擇性必修模塊3《生物技術(shù)與工程》中“基因工程”教學(xué)的一部分,可用于“提取目的基因和擴(kuò)增目的基因”,其理論基礎(chǔ)涉及必修2《遺傳與進(jìn)化》“DNA 結(jié)構(gòu)與復(fù)制”等內(nèi)容。《普通高中生物學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)(2017 年版)》明確指出,在幫助學(xué)生達(dá)成“基因工程賦予生物新的遺傳特性”大概念的理解時(shí),應(yīng)通過開展“PCR 擴(kuò)增DNA 片段并完成電泳鑒定”,促進(jìn)學(xué)生生物學(xué)學(xué)科核心素養(yǎng)的提升。因此,高中階段開展PCR 實(shí)驗(yàn),利于培養(yǎng)學(xué)生結(jié)構(gòu)與功能觀、物質(zhì)與能量觀等生命觀念,利于學(xué)生在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、操作實(shí)驗(yàn)中提升科學(xué)思維品質(zhì)和科學(xué)探究能力,利于在對(duì)新冠肺炎疫情等社會(huì)熱點(diǎn)議題討論中培養(yǎng)社會(huì)責(zé)任。但在實(shí)際教學(xué)中,由于儀器的缺乏,PCR 技術(shù)的教學(xué)還是浮于紙面。即使有PCR儀,由于實(shí)驗(yàn)成本較高,操作過程復(fù)雜,實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng),往往僅讓學(xué)生參觀儀器,而讓PCR 儀成為擺設(shè)。“重理論,輕實(shí)踐;重解題,輕技術(shù)”的現(xiàn)象沒有得到改變。因此,將菌落PCR 引入高中課堂,能降低成本、縮短時(shí)間,讓PCR 實(shí)驗(yàn)真正走入高中課堂,讓學(xué)生親歷實(shí)驗(yàn)過程,掌握PCR 技術(shù),發(fā)展生物學(xué)學(xué)科核心素養(yǎng)。

        基于真實(shí)情境下的問題解決能力的培養(yǎng)更利于培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新精神,因此,面對(duì)“土壤磷元素缺乏,影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)”的世界性問題,提高土壤中有效磷元素的含量是科學(xué)家迫切想要解決的問題之一。土壤中難溶性磷的轉(zhuǎn)化依賴于一類解磷菌的微生物[2](主要為細(xì)菌),因此,通過項(xiàng)目式學(xué)習(xí),帶領(lǐng)學(xué)生分離純化并鑒定土壤中的解磷菌,具有重要的社會(huì)意義。同時(shí),讓學(xué)生在問題解決中習(xí)得知識(shí),掌握技術(shù),培養(yǎng)能力,是新課程理念所倡導(dǎo)的教學(xué)方式。

        1 菌落PCR

        菌落PCR(colony PCR)可不必提取目的基因DNA,不必酶切鑒定,直接以菌體熱解后暴露的DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,省時(shí)省力,常應(yīng)用于快速鑒定菌落是否為含目的基因的陽性菌落。與普通DNA 的PCR 相比,菌落易獲得,少了提取目的基因步驟而省時(shí),也因不必購買目的基因,一般中學(xué)實(shí)驗(yàn)室就可操作。而且,可與“微生物的分離與培養(yǎng)”實(shí)驗(yàn)專題相銜接,教學(xué)設(shè)計(jì)時(shí)可作為1 個(gè)單元的整體化設(shè)計(jì)。

        2 實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果

        2.1 菌落獲得 本實(shí)驗(yàn)采用的菌落為在“微生物的分離與培養(yǎng)”實(shí)驗(yàn)中,校園“尋找高效解磷菌,緩解土壤缺磷”的項(xiàng)目式學(xué)習(xí)的學(xué)生從校園土壤中所分離出的解磷菌菌落[3]。挑選了解磷圈較大較明顯的菌落(圖1),用于PCR 和菌種鑒定。

        圖1 出現(xiàn)解磷圈的菌落

        2.2 菌落PCR

        1)制備菌懸液:用高壓蒸汽滅菌過的無菌牙簽挑取解磷菌的單個(gè)菌落,置于20μL ddH2O 中攪拌,將裝有20μL ddH2O 的PCR 管在100 ℃下煮2 min,冷卻后成為菌懸液。

        2)設(shè)計(jì)引物:采用細(xì)菌16S rRNA 基因通用引物進(jìn)行菌落PCR,引物序列為27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')。

        3)擴(kuò)增體系:擴(kuò)增體系20 μL,F(xiàn)ast PCR Master Mix 體系(TaKaRa)10μL,引物27F 與引物1492R 各1μL,菌懸液1μL,ddH2O 7μL(菌懸液與ddH2O 加入量視菌懸液濃度及時(shí)調(diào)整)。

        4)菌落PCR 反應(yīng)條件設(shè)定:94℃預(yù)變性1 min;98℃變性5 s,55℃退火5s,72℃延伸20 s,變性退火延伸共30 個(gè)循環(huán);循環(huán)結(jié)束后,72℃保溫10 min(使延伸更充分)(圖2);4 ℃保存。

        圖2 PCR 參數(shù)設(shè)置

        5)PCR儀器擴(kuò)增。Bio-Rad PCR儀T100,96孔。

        2.3 凝膠電泳 電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過程。DNA 分子帶有負(fù)電,在電場(chǎng)的作用下,DNA 分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。利用DNA 樣品分子本身的大小,使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度,從而實(shí)現(xiàn)不同大小DNA 分子的分離。瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)可用于對(duì)PCR 擴(kuò)增成功與否進(jìn)行鑒定,從而為后續(xù)的基因測(cè)序提供保證。

        1)制膠:PCR 擴(kuò)增期間,配制1%瓊脂糖凝膠。稱取1 g 瓊脂糖加入至100 mL 1×TAE 緩沖液中,微波加熱溶解;溶解后加入GelRed 核酸染料,倒入制膠板中,置于室溫下待凝固(約20 min)。

        2)點(diǎn)樣:取5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物與上樣緩沖液混合,將混合液點(diǎn)樣至1%瓊脂糖凝膠中。

        3)電泳:120 V 電壓下電泳15 min。

        4)觀察:將電泳后的瓊脂糖凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行PCR 產(chǎn)物檢測(cè),確認(rèn)條帶并拍照(圖3)。將剩余PCR 產(chǎn)物送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。

        2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 電泳結(jié)果顯示,所有菌落擴(kuò)增后在1 465 bp 處均出現(xiàn)單一條帶(圖3),說明在所取菌落中都能擴(kuò)增出作為細(xì)菌身份的16S rRNA 基因,后續(xù)選擇清晰明顯條帶所對(duì)應(yīng)的PCR 產(chǎn)物送至基因公司進(jìn)行測(cè)序,根據(jù)結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,確定所分離出的菌落各屬于何種細(xì)菌。

        圖3 菌落PCR 電泳圖

        3 實(shí)驗(yàn)時(shí)間分配

        本實(shí)驗(yàn)利用連續(xù)2 節(jié)課的時(shí)間(約80 min),完成PCR 和電泳實(shí)驗(yàn)。具體時(shí)間分配見表1。實(shí)驗(yàn)操作約55 min,其他時(shí)間用于理論指導(dǎo)、結(jié)果觀察、課堂小結(jié)等。

        表1 時(shí)間安排

        4 教學(xué)反思

        4.1 重時(shí)間有效管理,助實(shí)驗(yàn)有序進(jìn)行 利用儀器進(jìn)行PCR 的時(shí)間進(jìn)行制膠。在儀器配置上,PCR 儀選擇96 孔為宜,且較好品牌儀器升、降溫速度較快,節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間。選用生物公司專門用于進(jìn)行菌落PCR 的試劑盒(Fast PCR Master Mix),其包含的Taq 酶高效(延伸速度為10 s/kb),可縮短PCR 中各階段的反應(yīng)時(shí)間,在30 min 內(nèi)完成PCR 擴(kuò)增,與普通PCR 相比,所用時(shí)間縮短一半。制膠板選擇雙排,一排25 孔,總共可上50 個(gè)樣,保證讓每個(gè)學(xué)生能進(jìn)行點(diǎn)樣操作。優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn),能在55 min 內(nèi)完成PCR 和電泳實(shí)驗(yàn)。

        4.2 重關(guān)鍵能力培養(yǎng),促學(xué)科素養(yǎng)提升 在進(jìn)行菌落PCR 的實(shí)驗(yàn)中,培養(yǎng)學(xué)生的分子生物學(xué)中的關(guān)鍵能力,符合“教學(xué)過程重實(shí)踐”的新課程理念。在PCR 教學(xué)中,不只追求學(xué)會(huì)操作儀器,更應(yīng)注重學(xué)生思維品質(zhì)的提升,引發(fā)學(xué)生對(duì)“為什么要進(jìn)行PCR、如何進(jìn)行PCR、如何解讀PCR 結(jié)果”等問題的深度思考。

        1)為什么要進(jìn)行PCR?在本實(shí)驗(yàn)中,基于“分離出高效解磷菌以解決土壤有效磷含量低”的現(xiàn)實(shí)問題情境,通過技術(shù)手段分離出高效解磷菌形成菌落后,需對(duì)其進(jìn)行種屬的分子鑒定以確定其系統(tǒng)發(fā)育地位,勢(shì)必要對(duì)解磷菌的DNA 進(jìn)行測(cè)序。由于Sanger 測(cè)序需要足夠濃度的DNA,因此,在測(cè)序前會(huì)先進(jìn)行PCR 擴(kuò)增目的基因。如果只需要做定性檢測(cè),菌落PCR 能得到與常規(guī)PCR 相同的結(jié)果,且可節(jié)省大量的人力、物力和財(cái)力,因此,本實(shí)驗(yàn)選用菌落PCR。

        2)如何進(jìn)行PCR?PCR 過程由PCR 儀器完成,難點(diǎn)在于需實(shí)驗(yàn)者構(gòu)建PCR 反應(yīng)體系。例如,模板的選擇、引物的設(shè)計(jì)、溫度的控制等,都是技術(shù)要點(diǎn)。

        模板的選擇:在本實(shí)驗(yàn)中,細(xì)菌主要存在3 種核糖體RNA(5S、16S、23S rRNA),因16S rRNA 基因有一段高度保守的序列,并且中間的高變區(qū)序列是每種細(xì)菌獨(dú)一無二的標(biāo)記,因而設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增16S rRNA 基因這一段高度保守的序列。即“16S rRNA 基因”相當(dāng)于細(xì)菌的“身份證”,必須先拿到身份證才能進(jìn)行進(jìn)一步的鑒別,所以應(yīng)先將其擴(kuò)增再進(jìn)行序列的比對(duì)。

        引物的設(shè)計(jì):PCR 的成功與否與引物的選擇有關(guān),設(shè)計(jì)引物的能力體現(xiàn)學(xué)生掌握PCR 的技術(shù)素養(yǎng)。針對(duì)引物的設(shè)計(jì),如果所要擴(kuò)增的目的基因在文獻(xiàn)中沒有報(bào)道研究,則需要研究者利用引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站自行設(shè)計(jì)引物,常用的引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站有Primer blast、Primer Premier 5.0、Primer 3 Plus 等。如果該目的基因在文獻(xiàn)中已有報(bào)道研究,則可從文獻(xiàn)查到該目的基因成熟的引物序列。本研究中學(xué)生通過查找閱讀大量文獻(xiàn),選擇16S rRNA 基因的通用引物[4]。

        體系的構(gòu)建:反應(yīng)體系的量根據(jù)需求而定。本實(shí)驗(yàn)選用20 μL 的總反應(yīng)體系,使用商品化的Fast PCR Master Mix(其中包含Taq 酶、dNTP 和緩沖液),其用量及PCR 儀器參數(shù)的設(shè)置參照說明書;在20 μL 的總反應(yīng)體系中加入上、下游引物各1 μL;本實(shí)驗(yàn)中加入1 μL 菌液作為模板。

        3)PCR 電泳結(jié)果的解讀:PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),在凝膠上點(diǎn)樣已知條帶大小的標(biāo)準(zhǔn)樣(DNA Marker),方便比對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大小。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果選擇條帶較亮(產(chǎn)物較多)的樣品送去測(cè)序。最終將測(cè)序結(jié)果與Genebank 數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行比對(duì),確定菌種的系統(tǒng)發(fā)育位置。

        以實(shí)踐活動(dòng)為學(xué)習(xí)起點(diǎn),以問題解決為終點(diǎn),學(xué)生從學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)原理,到進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作,感受解決問題的快樂,從中提升綜合能力。

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