王 娟，曹龍奎,2,，魏春紅，王維浩,2，趙姝婷，劉德志，全志剛，王一飛，武云嬌，蘇有韜，張東杰,

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319）

小米作為我國(guó)的傳統(tǒng)谷物，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、易消化，且對(duì)人體胃腸疾病具有較強(qiáng)的調(diào)養(yǎng)作用[1]。膳食纖維作為小米中一種較強(qiáng)的功能性成分，具有助消化、抗脂肪肝、預(yù)防肥胖等功效[2]。根據(jù)美國(guó)谷物化學(xué)家協(xié)會(huì)的定義，膳食纖維是一種在人體小腸抗消化、吸收，在大腸完全或部分發(fā)酵的植物可食用組織或相似碳水化合物[3]。根據(jù)其溶解性，膳食纖維可分為水溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）和水不溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）[4]，其中SDF在促進(jìn)腸道蠕動(dòng)、減少肥胖、胃腸疾病預(yù)防等方面均優(yōu)于IDF[5-6]。但由于膳食纖維具有黏滯性、結(jié)合有機(jī)化合物的特點(diǎn)，因此若胃腸疾病患者不能掌握適當(dāng)?shù)臄z入量，則容易對(duì)腸黏膜產(chǎn)生不良刺激，引起腹脹，導(dǎo)致人體某些營(yíng)養(yǎng)素（如無(wú)機(jī)鹽中的鈣、鐵、鋅以及脂溶性維生素VA等）的不足甚至缺乏[7]，某些疾病例如糖尿病患者需適量補(bǔ)充膳食纖維[8]，但若患者胃腸功能較弱則不宜食用膳食纖維[9]。

相關(guān)研究表明，對(duì)多糖進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆肿有揎棔?huì)使多糖產(chǎn)生新的活性或者增強(qiáng)其原有的生物活性[10]。硒元素作為人體的必需微量元素，對(duì)人體健康起著重要的作用，具有抗氧化、抗衰老、提高機(jī)體免疫以及抗癌的能力[11]。適量地?cái)z入硒有益人體健康，但我國(guó)很多地區(qū)存在硒攝入不足的問(wèn)題，富硒食品的開發(fā)有益國(guó)民健康。自然界中的硒大多以無(wú)機(jī)硒存在，其對(duì)人體具有一定的毒副作用，且吸收率低，而有機(jī)硒毒性小、安全指數(shù)高、體內(nèi)轉(zhuǎn)化率高[12]，但有機(jī)硒種類少、含量低，且穩(wěn)定性差[13]。硒多糖作為一種良好的有機(jī)硒來(lái)源，可根據(jù)人體需求進(jìn)行動(dòng)態(tài)的儲(chǔ)存和緩釋，以達(dá)到機(jī)體補(bǔ)硒的目的[14]，但是天然硒多糖在自然界中存在較少，而且它的硒含量通常較低[15]，通過(guò)生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)硒多糖的方法又耗時(shí)較長(zhǎng)[16]。Huang Shiyu[17]和Kaleta[18]等研究發(fā)現(xiàn)硒元素與多糖的結(jié)合不僅可以降低無(wú)機(jī)硒的毒性，還可以增加多糖的生物活性，所以高效、高硒含量的硒多糖人工合成方法越來(lái)越受到矚目。

色氨酸作為人體必需氨基酸[19]，在各種生物過(guò)程中起著重要作用[20-21]。膳食纖維在胃腸道炎癥治療方面具有一定的作用效果[22]，有研究表明，色氨酸是炎癥和免疫的重要調(diào)節(jié)因子，同樣對(duì)炎癥性腸道疾病具有一定的治療作用[23-24]。Islam等[25]通過(guò)在飲食中添加色氨酸研究其是否對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎有保護(hù)作用，研究結(jié)果表明色氨酸可作為一種有前途的預(yù)防劑治療潰瘍性結(jié)腸炎。因?yàn)槿梭w不能自身合成色氨酸，主要通過(guò)膳食攝入或者藥物補(bǔ)充[26]，但膳食攝入所提供的色氨酸含量較低，藥物補(bǔ)充會(huì)產(chǎn)生一定的副作用[27]。色氨酸和膳食纖維均對(duì)炎癥性胃腸病有一定治療作用，故以膳食纖維為原料生產(chǎn)色氨酸或?qū)⑸攀忱w維與色氨酸聯(lián)合用于改善或治療炎癥性胃腸疾病具有一定的研究?jī)r(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)以小米為原料，對(duì)其中的SDF進(jìn)行研究，膳食纖維屬于多糖中的一種，可利用硝酸-亞硒酸鈉法對(duì)SDF進(jìn)行修飾，得到小米硒化水溶性膳食纖維（selenium modified soluble dietary fiber，Se-SDF），并對(duì)其修飾工藝進(jìn)行優(yōu)化；采用凝膠滲透色譜法、掃描電子顯微鏡、傅里葉變換紅外光譜儀、X射線衍射儀分別測(cè)定修飾前后分子質(zhì)量、顆粒形態(tài)、官能團(tuán)、結(jié)晶度的變化；以SDF、IDF、Se-SDF等為碳源進(jìn)行體外發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，考察其促進(jìn)腸道菌群產(chǎn)色氨酸的能力及修飾前后SDF的體外抗氧化活性，為今后的工業(yè)生產(chǎn)及功能性食品的研究開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料與試劑

小鼠為5～6 周齡、體質(zhì)量18～20 g的SPF級(jí)雌性昆明小鼠，由長(zhǎng)春易思實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供。

小米為‘東方亮'，由山西省東方亮生命科技有限公司提供，其顆粒飽滿均勻、色金黃、無(wú)霉?fàn)€碎米。

中性蛋白酶（水解酶類，活力6×104U/mL）、耐高溫α-淀粉酶（水解酶類，活力4×104U/mL）、淀粉葡萄糖苷酶（水解酶類，活力10×104U/mL） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品 上海楚定分析儀器有限公司；透析袋 天津市大茂化學(xué)試劑廠；抗壞血酸（分析純） 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為分析純；羥自由基測(cè)定試劑盒、總抗氧化能力試劑盒、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

GDE-CSF6膳食纖維測(cè)定儀 意大利VELP公司；Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)Thermo Fisher公司；LC20+RID20A凝膠滲透色譜儀 日本島津公司；D8 ADVANCE X射線粉末衍射儀 德國(guó)布魯克公司；SU8020場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本日立公司；Specord 210 plus紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 德國(guó)DeChem-Tech.GmbH公司；DB-1A數(shù)顯恒溫電熱板 常州市英格爾儀器制造有限公司；真空冷凍干燥機(jī) 基因有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小米SDF的制備

稱取10 g的小米，經(jīng)粉碎后過(guò)60 目篩，得到小米粉。用濾紙將小米粉包成小藥包，用100 mL石油醚于60 ℃條件下冷凝回流4 h進(jìn)行脫脂處理，脫脂結(jié)束后放入通風(fēng)櫥自然干燥，得到脫脂小米粉，備用。

稱取5 g脫脂小米粉加入125 mL蒸餾水、250 mL磷酸鹽緩沖液（pH 6、0.08 mol/L），依次經(jīng)耐高溫α-淀粉酶（95 ℃、30 min）、中性蛋白酶（60 ℃、30 min）、淀粉葡萄糖苷酶（60 ℃、30 min）進(jìn)行酶解，滅酶（100 ℃、20 min），過(guò)濾，濾渣為小米IDF，得到的濾液濃縮后，用4 倍體積的95%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液醇沉、離心、干燥得粗小米SDF。

1.3.2 粗小米SDF的純化

采用Sevag法去除蛋白，按照V（正丁醇）∶V（三氯甲烷）＝1∶5配制Sevag試劑。準(zhǔn)確稱取粗小米SDF 0.50 g，加蒸餾水溶解、定容至100 mL，加入20 mL Sevag試劑，振搖10 min，離心（5 000 r/min、10 min），收集水相。向水相中加入20 mL Sevag試劑，再次進(jìn)行上述振搖、離心、收集水相操作，上述步驟反復(fù)10 次以上。將最后一次收集的水相用體積分?jǐn)?shù)5%的氨水調(diào)節(jié)pH值8.5左右，加入50 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%雙氧水，40 ℃保溫60 min脫色，然后60 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)試劑，得到約20 mL小米SDF溶液。將小米SDF溶液裝入截留分子質(zhì)量為3 500 Da透析袋，自來(lái)水透析48 h，蒸餾水透析24 h。透析后，將溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原溶液體積的1/3，加入4 倍體積的體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液，于4 ℃冰箱中醇沉過(guò)夜，棄去上清液，再離心分離（5 000 r/min、10 min），沉淀依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚各洗滌兩次，冷凍干燥至恒質(zhì)量，即得小米SDF，備用[28]。

1.3.3 小米Se-SDF的制備

1.3.3 .1 單因素試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[29]進(jìn)行小米Se-SDF的制備。稱取500 mg小米SDF加入三角瓶中，緩慢滴加50 mL體積分?jǐn)?shù)0.5%的HNO3溶液，邊加邊攪拌，使之完全溶解。加入不同質(zhì)量（0.5、0.65、0.75、0.9、1.2、1.5 g）氯化鋇，滴加不同體積（2、4、6、8、10 mL）5 mg/mL亞硒酸鈉溶液，于不同溫度（20、30、50、70、90 ℃）下攪拌反應(yīng)不同時(shí)間（2、4、6、8、10 h）。反應(yīng)液冷卻后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至5～6，加入一定量硫酸鈉固體粉末除去鋇離子，5 000 r/min離心10 min，取上清液用流水透析除去亞硒酸鈉。每6 h取少量透析液，加入抗壞血酸固體粉末檢測(cè)游離亞硒酸鈉殘留量，無(wú)紅色時(shí)停止透析。將透析袋內(nèi)溶液減壓蒸餾至10～20 mL，用蒸餾水透析24 h除鹽，透析液經(jīng)真空冷凍干燥得小米Se-SDF，并測(cè)定Se-SDF得率和硒含量。進(jìn)行單因素試驗(yàn)時(shí)，固定的條件為：氯化鋇質(zhì)量0.65 g、亞硒酸鈉溶液體積4 mL、反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)時(shí)間6 h。

1.3.3 .2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選擇不同反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、5 mg/mL亞硒酸鈉溶液添加量、氯化鋇添加量這4 個(gè)因素進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，每個(gè)因素選取3個(gè)水平進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)如表1所示。以Se-SDF得率和硒含量為指標(biāo)，每組試驗(yàn)重復(fù)3 次。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Code and level of independent variables used for orthogonal array design

1.3.4 小米Se-SDF中硒含量的測(cè)定

1.3.4 .1 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考文獻(xiàn)[30-31]，精確量取100 μg/mL硒標(biāo)準(zhǔn)溶液（Se單質(zhì)溶液）0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL于10 mL離心管中，每管均加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37%的濃鹽酸1 mL，定容至10 mL，混勻。取2 mL待測(cè)溶液，加入6 mL蒸餾水，用1.0 mol/L鹽酸溶液調(diào)至pH值2～3，然后加入4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的鄰苯二胺溶液，放置暗處反應(yīng)20 min；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaOH溶液調(diào)節(jié)至中性，加入5 mL甲苯振蕩2 min，靜置分層，吸取甲苯層測(cè)定其在334 nm處吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y＝0.043 6x+0.006 2，R2＝0.994 5，y為標(biāo)準(zhǔn)溶液在334 nm處吸光度，x為硒質(zhì)量濃度/（μg/mL）。

1.3.4 .2 小米Se-SDF硒含量的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[32]，進(jìn)行小米Se-SDF硒含量的測(cè)定。稱取50 mg小米Se-SDF放入三角瓶中，加入3 mL混合酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)68%濃硝酸和質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%高氯酸體積比為4∶1）浸泡12 h，然后用電熱板加熱消解至消化液出現(xiàn)淺棕色，冷卻至室溫；加入0.50 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的雙氧水，加熱至出現(xiàn)白煙后，冷卻至室溫；加入10 mL蒸餾水沖洗瓶壁，加熱溶液至剩余體積為1～2 mL，再用混酸（6 mol/L的硝酸和質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%高氯酸體積比為4∶1）定容至10 mL待測(cè)。取2 mL待測(cè)溶液，加入6 mL蒸餾水，用1.0 mol/L鹽酸溶液調(diào)至pH值2～3，然后加入4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的鄰苯二胺溶液，放置暗處反應(yīng)20 min；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaOH溶液調(diào)節(jié)至中性，加入5 mL甲苯振蕩2 min，靜置分層，吸取甲苯層測(cè)定其在334 nm波長(zhǎng)處的吸光度，按照1.3.4.1中標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算甲苯層中硒的質(zhì)量濃度，按公式（1）計(jì)算樣品中硒含量。

式中：ρ為甲苯層中硒的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V1為定容后待測(cè)溶液體積（10 mL）；V2為甲苯層的總體積（5 mL）；V3為用于絡(luò)合反應(yīng)的待測(cè)溶液體積（2 mL）；m為準(zhǔn)確稱取的小米Se-SDF質(zhì)量/g。

1.3.4 .3 小米Se-SDF得率的計(jì)算

按公式（2）計(jì)算小米Se-SDF得率。

式中：m1為小米Se-SDF質(zhì)量/g；m2為小米SDF質(zhì)量/g。

1.3.5 硒化修飾前后小米SDF結(jié)構(gòu)的測(cè)定

1.3.5 .1 傅里葉變換紅外光譜測(cè)定

參照張艷榮等[33]的方法進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜測(cè)定。稱取2 mg干燥樣品與200 mg KBr粉末于研缽中，充分混勻，研磨，制片。在4 000～500 cm－1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.3.5 .2 微觀結(jié)構(gòu)的觀察

參照Park等[34]的方法，采用SEM觀察微觀硒化修飾前后小米SDF微觀結(jié)構(gòu)。將樣品干燥至恒質(zhì)量，取適量進(jìn)行黏臺(tái)、鍍金后進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)觀察。

1.3.5 .3 相對(duì)分子質(zhì)量分布的測(cè)定

采用LC20+RID20A凝膠滲透色譜儀進(jìn)行硒化修飾前后小米SDF相對(duì)分子質(zhì)量分布的測(cè)定，用島津Lab solution GPC色譜工作站進(jìn)行分析計(jì)算。將樣品用流動(dòng)相溶解得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的溶液。色譜條件：TOSOH TSKGEL GMPWXL凝膠色譜柱（7.8 mm×300 mm，13 μm）；流動(dòng)相：含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.06%疊氮化鈉的0.1 mol/L硝酸鈉水溶液；流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.5 .4 X射線衍射圖譜測(cè)定

參考文獻(xiàn)[35]，取適量干燥后的SDF于樣品槽中用玻璃板壓平，將其置于自動(dòng)X射線衍射儀中。參數(shù)設(shè)置：波長(zhǎng)λ＝0.156、管壓36 kV、管流20 mA、Cu靶、掃描速率2（°）/min、衍射角度2θ掃描范圍2°～40°、步寬0.02°。

1.3.6 硒化修飾前后小米SDF的體外抗氧化活性的測(cè)定

1.3.6.1 羥自由基清除能力測(cè)定

羥自由基清除能力采用羥自由基測(cè)定試劑盒測(cè)定。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.6 .2 DPPH自由基清除率測(cè)定

參考文獻(xiàn)[36]，取3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%樣品溶液于試管中，加入3 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液（用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液配制），振蕩混合后，在26 ℃下避光放置30 min，然后在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A1）；同時(shí)用3 mL蒸餾水替代樣品溶液，測(cè)定混合溶液的吸光度（A0），用3 mL 95%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液代替DPPH溶液，測(cè)定混合溶液的吸光度（A1）。平行測(cè)定3 次。按公式（3）計(jì)算DPPH自由基清除率。

1.3.6 .3 總抗氧化能力測(cè)定

總抗氧化能力采用總抗氧化能力試劑盒測(cè)定。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.7 小米Se-SDF體外發(fā)酵液色氨酸質(zhì)量濃度的測(cè)定

1.3.7 .1 色氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考文獻(xiàn)[37-38]，配制100 mL質(zhì)量濃度1 g/L的色氨酸母液，再分別用蒸餾水稀釋成20、40、80、100、120、150 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)液。分別量取1 mL色氨酸系列標(biāo)準(zhǔn)液和4 mL質(zhì)量濃度3 g/L的對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液（用9 mol/L的硫酸溶液溶解）于比色管中，60 ℃水浴20 min，然后加入30 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的亞硝酸鈉溶液混勻，繼續(xù)水浴5 min，取出冷卻，測(cè)定590 nm處測(cè)吸光度（以9 mol/L的硫酸溶液作空白對(duì)照）。色氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y＝0.013x+0.003 6，R2＝0.999 6（y為吸光度，x為色氨酸質(zhì)量濃度/（μg/mL））。

1.3.7 .2 小鼠糞便稀釋液體外發(fā)酵液中色氨酸質(zhì)量濃度的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[39]，選取5 只健康小鼠糞便作為菌種源，為了防止糞便污染，小鼠糞便利用代謝籠每天上午9點(diǎn)鐘進(jìn)行收集，將小鼠糞便放入滅菌環(huán)氧樹脂管，立即用1 mol/L pH 7磷酸鹽緩沖液按照體積比1∶9稀釋。分別以質(zhì)量濃度1.55 g/L的小米SDF（2 mL）、小米IDF（2 mL）、小米Se-SDF（低、中、高3 個(gè)劑量組分別為1、2、3 mL）和質(zhì)量濃度9.15 mg/L的亞硒酸鈉（2 mL）作為碳源（空白為2 mL蒸餾水），加入10 mL糞便稀釋液進(jìn)行體外發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。將樣品混勻后在37 ℃厭氧工作站中發(fā)酵，并在發(fā)酵的0、6、12、24 h取樣測(cè)定色氨酸的質(zhì)量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 組平行，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 22軟件及Excel 2019軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05表示差異顯著，用Origin 8.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒化修飾小米SDF條件的單因素試驗(yàn)結(jié)果

如圖1A所示，隨著反應(yīng)溫度的升高，小米Se-SDF得率及硒含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，兩者在50 ℃達(dá)到峰值，此時(shí)小米Se-SDF得率為14.85%，硒含量為2.07 mg/g；隨著反應(yīng)溫度進(jìn)一步升高，小米Se-SDF得率及硒含量迅速降低，這可能是由于溫度對(duì)SDF結(jié)構(gòu)造成一定程度的破壞，使其發(fā)生降解，導(dǎo)致硒不能與SDF很好地結(jié)合，因而降低了Se-SDF得率和硒含量。任廣明[40]研究發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)溫度達(dá)到60 ℃以上時(shí)會(huì)使硒化修飾過(guò)程中香菇多糖硒含量及硒結(jié)合力明顯降低，并分析這是由于反應(yīng)液溫度過(guò)高時(shí)，反應(yīng)溶液中的多糖分子運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)，離子振動(dòng)劇烈，阻礙了香菇多糖與硒之間的結(jié)合。

圖1 反應(yīng)溫度（A）、時(shí)間（B）、亞硒酸鈉溶液添加量（C）、氯化鋇添加量（D）對(duì)小米SDF硒化修飾的影響Fig.1 Effect of reaction temperature (A), time (B), amount of sodium selenite solution (C) and amount of barium chloride (D) on the selenium modification of millet SDF

反應(yīng)時(shí)間對(duì)硒化修飾結(jié)果的影響如圖1B所示。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，小米Se-SDF得率及硒含量呈現(xiàn)上升后下降的趨勢(shì)，在反應(yīng)時(shí)間為6 h時(shí)，小米Se-SDF得率及硒含量達(dá)到最大，分別為15.1%、2.07 mg/g；實(shí)驗(yàn)開始時(shí)反應(yīng)時(shí)間太短而導(dǎo)致SDF與亞硒酸鈉反應(yīng)不充分，兩者不能有效結(jié)合，所以得率及硒含量較低；而在反應(yīng)6 h后，隨著反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，SDF在高溫、強(qiáng)酸條件下產(chǎn)生降解，導(dǎo)致小米Se-SDF得率降低[41]。

如圖1C所示，5 mg/mL亞硒酸鈉溶液添加量為4 mL時(shí)小米Se-SDF得率及硒含量達(dá)到最大，分別為14.56%、2.07 mg/g。當(dāng)繼續(xù)增加亞硒酸鈉溶液添加量時(shí)，小米Se-SDF得率降低，硒含量降低，這與任廣明[40]的研究結(jié)果一致。這可能是由于溶液中硒的結(jié)合位點(diǎn)有限，當(dāng)亞硒酸鈉溶液添加量不斷增加時(shí)，亞硒酸根離子之間的競(jìng)爭(zhēng)增加，而催化劑含量不足，催化作用降低，從而降低了反應(yīng)效率，導(dǎo)致硒結(jié)合率下降，使得小米Se-SDF得率、硒含量降低。

如圖1D所示，氯化鋇添加量為0.75 g時(shí)小米Se-SDF得率達(dá)到最大，為12.53%，此時(shí)硒含量也達(dá)到峰值，為2.41 mg/g；當(dāng)氯化鋇添加量大于0.75 g時(shí)，小米Se-SDF得率和SDF的硒結(jié)合量均降低。這可能是因?yàn)殡S著氯化鋇添加量的增加，其對(duì)亞硒酸鈉和小米SDF的反應(yīng)起到催化作用，所以兩者的結(jié)合能力增強(qiáng)，但當(dāng)繼續(xù)加入時(shí)，氯化鋇阻礙了硒與SDF之間的結(jié)合，因而導(dǎo)致小米Se-SDF得率和硒含量降低[41]。

2.2 硒化修飾小米SDF正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

表4 以硒化修飾小米粉SDF硒含量為指標(biāo)的正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance for selenium content of Se-SDF

由表2～4可知，反應(yīng)溫度對(duì)小米SDF硒化結(jié)果影響最為顯著（P＜0.01），由表2可知，各因素對(duì)小米Se-SDF得率的影響大小為：反應(yīng)溫度＞氯化鋇添加量＞反應(yīng)時(shí)間＞亞硒酸鈉溶液添加量；各因素對(duì)產(chǎn)物中硒含量的影響大小為：反應(yīng)溫度＞反應(yīng)時(shí)間＞亞硒酸鈉溶液添加量＞氯化鋇添加量。由表3、4可知，亞硒酸鈉溶液添加量對(duì)硒化結(jié)果影響不顯著，結(jié)合表2結(jié)果得到最優(yōu)組合為：反應(yīng)溫度40 ℃、反應(yīng)時(shí)間6 h、質(zhì)量濃度5 mg/mL亞硒酸鈉溶液添加量3 mL、氯化鋇添加量0.65 g，通過(guò)最優(yōu)組合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得小米Se-SDF的得率為10.56%，硒含量為2.69 mg/g。后續(xù)實(shí)驗(yàn)在最優(yōu)組合下進(jìn)行。

表2 硒化修飾小米SDF條件正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal experiments on the condition of selenochemically modified millet

表3 以硒化修飾小米粉SDF得率為指標(biāo)的正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for Se-SDF yield

2.3 硒化修飾前后小米SDF的結(jié)構(gòu)

2.3.1 硒化修飾前后小米SDF的傅里葉變換紅外光譜

如圖2所示，硒化修飾前后小米SDF的主體結(jié)構(gòu)并未改變，但硒化修飾后出現(xiàn)了新的特征吸收峰（1 434、1 297、886、832、695、600 cm－1）。相關(guān)研究表明，1 434 cm－1處為糖環(huán)上與Se＝O相鄰的C－H的特征吸收峰[28]；1 297 cm－1處為C－H的彎曲振動(dòng)峰[41]，也可能是O－Se－O的拉伸振動(dòng)引起的[42]；886 cm－1處為Se＝O鍵的特征吸收峰[43]；832 cm－1處為Se＝O鍵的特征吸收峰[41]；695、600 cm－1處出現(xiàn)的吸收峰分別為Se－OH、Se－O－C的特征吸收峰[44-45]。硒化修飾前后小米SDF的傅里葉變換紅外光譜表明，硒與SDF的結(jié)合是通過(guò)O－Se－O、Se－OH、Se－O－C和Se＝O鍵完成的。

圖2 硒化修飾前后小米SDF的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.2 Fourier transform infrared spectra of millet SDF before and after modification

2.3.2 硒化修飾前后小米SDF微觀結(jié)構(gòu)

由圖3可以清晰地看出修飾前后小米SDF微觀形態(tài)的差異。小米Se-SDF表面多孔且孔徑較大，呈蜂窩狀，而未經(jīng)修飾的小米SDF為不規(guī)則片狀，且結(jié)構(gòu)致密，這與曹龍奎等[46]的研究結(jié)果一致。小米SDF表面顆粒較聚集，可能是因?yàn)槠浞肿娱g相互作用力強(qiáng)，使分子間產(chǎn)生強(qiáng)烈的吸引力；而小米Se-SDF表面多孔，聚合度小，這種變化可能是由于硒與SDF之間的相互作用改變了分子間的相互作用及范德華力的作用[47]。

圖3 修飾前后小米SDF的SEM圖Fig.3 SEM images of millet SDF before and after modification

2.3.3 硒化修飾前后小米SDF相對(duì)分子質(zhì)量分布

圖4為硒化修飾前后小米SDF的凝膠滲透色譜圖，可以看出硒化修飾前后小米SDF各有兩個(gè)組分，相對(duì)分子質(zhì)量分別為0.57×104～33.25×104、0.05×104～0.56×104和2.75×104～686.79×104、157～20.98×104。如表5和圖4所示，小米SDF重均相對(duì)分子質(zhì)量Mw＝2.67×104，數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量Mn＝1.32×104，分散系數(shù)為2.02，相對(duì)分子質(zhì)量20×104～30×104、10×104～20×104、1×104～10×104、小于1×104的分布占比分別為1.202 0%、14.187 7%、55.348 5%、29.261 8%；小米Se-SDF重均相對(duì)分子質(zhì)量Mw＝1.09×104，數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量Mn＝2.72×103，分散系數(shù)為4，相對(duì)分子質(zhì)量在100×104～750×104、50×104～100×104、10×104～50×104、1×104～10×104、小于1×104的分布占比分別為75.256 2%、10.010 2%、2.791 5%、8.684 9%、3.257 2%，兩種SDF分散系數(shù)均小于10，說(shuō)明樣品純度較高[48]。由以上數(shù)據(jù)知，硒化修飾后小米SDF重均相對(duì)分子質(zhì)量下降，分散范圍較廣，推測(cè)這可能是因?yàn)樗嵝詶l件使得SDF發(fā)生降解，這與圖3所測(cè)得的結(jié)果一致。

圖4 硒化修飾前后小米SDF的凝膠滲透色譜圖Fig.4 Gel permeation chromatograms of millet SDF before and after modification

表5 硒化修飾前后小米SDF的相對(duì)分子質(zhì)量Table 5 Relative molecular masses of native and selenized millet SDF

2.3.4 硒化修飾前后小米SDF的X射線衍射圖譜

由圖5可知，小米SDF在2θ為21.840 29°處出現(xiàn)較弱的結(jié)晶衍射峰，衍射峰較寬，說(shuō)明小米SDF為不規(guī)則且無(wú)定型態(tài)[49]，與SEM圖觀察到的結(jié)果一致；小米Se-SDF在21.684 37 °處有明顯的結(jié)晶衍射峰，這說(shuō)明硒化修飾在一定程度上會(huì)使小米SDF結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)微晶態(tài)[40]，通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)修飾對(duì)SDF的XRD衍射峰位置無(wú)明顯影響，因此認(rèn)為硒化修飾并未使其結(jié)晶結(jié)構(gòu)類型發(fā)生改變[50]。根據(jù)Segal[51]的計(jì)算方法，可計(jì)算得到小米SDF的結(jié)晶指數(shù)為11.23%，小米Se-SDF的結(jié)晶指數(shù)為9.51%，說(shuō)明硒化修飾使小米SDF結(jié)晶度降低，結(jié)晶區(qū)域變小[52]，或是由于物理結(jié)構(gòu)的破壞和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的暴露，促進(jìn)了結(jié)晶中酶解的增強(qiáng)，導(dǎo)致結(jié)晶度降低[53]。

圖5 修飾前后小米SDF的X射線衍射圖譜Fig.5 X-ray diffraction spectra of millet SDF before and after modification

2.4 小米Se-SDF體外抗氧化活性

如表6所示，與小米SDF相比，小米Se-SDF羥自由基清除能力提高了2.20%，DPPH自由基清除率提高了130.18%，總抗氧化能力提高了52.40%。羅敏等[54]研究發(fā)現(xiàn)，硒化前后米胚多糖對(duì)O2－?、?OH、DPPH自由基均有不同程度的清除能力，且硒化的米胚多糖效果更佳顯著。Xiao Heng等[55]通過(guò)比較馬尾藻多糖硒化前后抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)硒化的多糖表現(xiàn)出更高的活性。膳食纖維是一種非淀粉多糖，其抗氧化活性與其分子質(zhì)量、糖醛酸含量等有關(guān)[56]。有研究表明，多糖清除自由基的能力與其羥基的供氫能力呈正相關(guān)[55-57]。由圖2可知，小米Se-SDF在1 459 cm－1附近的吸收峰顯示羥基的存在，這可能是其抗氧化能力較強(qiáng)的原因。此外，糖醛酸含量較高的多糖容易解離出氫原子，抗氧化活性更強(qiáng)[58]，由圖2可知，小米Se-SDF在1707 cm－1附近的吸收峰顯示醛基或羧基的存在，說(shuō)明小米Se-SDF中富含糖醛酸，這可能是其抗氧化能力較強(qiáng)的另一個(gè)原因。多糖中硒基或硒酸酯基的存在也能激活異位碳[59]的氫原子，這也與圖2的結(jié)果相一致。修飾前后小米SDF的體外抗氧化活性測(cè)定結(jié)果表明，硒化修飾在提高SDF的抗氧化活性方面發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，與Lee等[60]報(bào)道的結(jié)果一致。

表6 硒化修飾前后小米SDF的體外抗氧化活性測(cè)定結(jié)果Table 6 In vitro antioxidant activity of millet SDF before and after modification

2.5 小鼠糞便稀釋液體外發(fā)酵液中色氨酸質(zhì)量濃度的變化

由圖6可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液中色氨酸質(zhì)量濃度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。在發(fā)酵6 h時(shí)，各組發(fā)酵液中色氨酸質(zhì)量濃度達(dá)到峰值，這可能是因?yàn)楫?dāng)各種碳源加入到發(fā)酵液中后，為發(fā)酵液中菌類提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)源，發(fā)酵液中有一部分菌類利用這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生色氨酸，從而增加了發(fā)酵液中色氨酸質(zhì)量濃度[61]；隨著發(fā)酵時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，色氨酸質(zhì)量濃度降低，這可能是因?yàn)樘荚幢焕脤?dǎo)致發(fā)酵液葡萄糖濃度增高，進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)酵液黏度增大，造成溶氧量下降，使菌體的生長(zhǎng)代謝受到影響，產(chǎn)色氨酸能力下降[62]，而色氨酸代謝反應(yīng)仍在進(jìn)行，所以導(dǎo)致色氨酸質(zhì)量濃度降低。不同時(shí)間不同碳源發(fā)酵液中色氨酸質(zhì)量濃度均低于空白組，這可能是因?yàn)樘荚吹募尤敫淖兞税l(fā)酵液中微生物數(shù)量及種類，增加了可以利用色氨酸的微生物數(shù)量，也可能是由于微生物對(duì)碳源選擇的差異性，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)組中色氨酸質(zhì)量濃度更較空白組低。從圖6中可知，反應(yīng)6 h后，亞硒酸鈉發(fā)酵液中色氨酸質(zhì)量濃度最高，這可能是因?yàn)閬單徕c發(fā)酵液中產(chǎn)色氨酸的微生物較活躍，而利用色氨酸的微生物部分被抑制，而被抑制的原因可能是亞硒酸鈉對(duì)利用色氨酸微生物具有一定的毒副作用。反應(yīng)6 h后，以小米Se-SDF為碳源的發(fā)酵液中色氨酸質(zhì)量濃度均高于以小米SDF（9.61 μg/mL）和小米IDF（10.11 μg/mL）為碳源的發(fā)酵液中色氨酸質(zhì)量濃度，中劑量的小米Se-SDF組發(fā)酵液中色氨酸質(zhì)量濃度最高，為12.01 μg/mL，說(shuō)明小米Se-SDF可以很好地被微生物利用，這可能是因?yàn)樾∶譙DF經(jīng)過(guò)硒化修飾后，其自身生物活性得到提高，而且硒的毒性也在一定程度上被降低，所以使其產(chǎn)色氨酸的能力增強(qiáng)。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，以中劑量小米Se-SDF為碳源的小鼠糞便稀釋液體外發(fā)酵液產(chǎn)色氨酸的效果最佳。Park等[22]證明膳食纖維可以通過(guò)腸道菌群對(duì)胃腸疾病有改善的作用，但Gibson等[63]的研究表明SDF與部分結(jié)腸炎癥狀如腹痛、腹脹、腹瀉的發(fā)生或惡化有關(guān)，而相關(guān)研究指出胃腸道炎癥患者攝入色氨酸可以緩解炎癥[23-24]，修飾后的水溶性膳食纖維在微生物的作用下可以產(chǎn)生一定量的色氨酸，因此，小米Se-SDF可能比小米SDF更適合胃腸功能較弱的人群食用。

圖6 小鼠糞便稀釋液體外發(fā)酵液中色氨酸質(zhì)量濃度的變化Fig.6 Changes in tryptophan content in fermentation broth of mouse intestinal flora utilizing different carbon sources

3 結(jié) 論

在最佳硒化修飾條件下，小米Se-SDF得率為10.56%，硒含量為2.69 mg/g；修飾后小米Se-SDF分子質(zhì)量增加，表面多孔且孔徑較大，呈蜂窩狀，聚合度降低，出現(xiàn)Se＝O、Se－OH、Se－O－C等官能團(tuán)，結(jié)晶結(jié)構(gòu)類型無(wú)明顯變化，結(jié)晶指數(shù)降低，且修飾后小米Se-SDF抗氧化活性得到提高，促腸道菌群產(chǎn)色氨酸能力增強(qiáng)。目前，缺硒人數(shù)逐年升高，體外補(bǔ)硒引起廣泛關(guān)注，本研究不僅為SDF與亞硒酸鈉生產(chǎn)有機(jī)硒食品提供理論依據(jù)，還可為后續(xù)小米在功能性食品加工領(lǐng)域中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。小米SDF具有一定的保健功效，本研究?jī)H對(duì)小米Se-SDF的體外抗氧化活性進(jìn)行檢測(cè)，未進(jìn)行體內(nèi)的功能性研究，后續(xù)可通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究小米Se-SDF的功能特性，為開發(fā)富硒食品提供理論依據(jù)。