栗曉東 高仲軍 何敬 翟浩 田亮

在頭頸部惡性腫瘤中，喉癌發(fā)病率約占20%，且其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。目前，喉癌發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但普遍認(rèn)為腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲是涉及多個(gè)基因和多條信號(hào)通路的復(fù)雜調(diào)控過(guò)程[2,3]。三甲散加減由三棱、穿山甲、鱉甲、莪術(shù)等制成的中藥制劑，具有抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等作用[4,5]。本研究對(duì)晚期喉癌患者在同步放化療基礎(chǔ)上加用三甲散加減治療，觀(guān)察其對(duì)病灶組織增殖、凋亡和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，并以Wnt/β-catenin、PI3K/Akt信號(hào)通路為靶點(diǎn)探討其作用機(jī)制，旨在為晚期喉癌的治療提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年10月至2020年10月張家口市第一醫(yī)院和蔚縣人民醫(yī)院收治的晚期喉癌患者70例為研究對(duì)象，隨機(jī)分為對(duì)照組和聯(lián)合組，每組35例。對(duì)照組男20例，女15例；年齡38～72歲，平均年齡(56.66±9.45)歲；聯(lián)合組男22例，女13例；年齡41～75歲，平均年齡(58.40±9.31)歲。2組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn):①符合晚期喉癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)病理檢查確診；②未接受過(guò)放化療或其他治療；③預(yù)計(jì)生存時(shí)間>3個(gè)月；④患者及家屬簽署知情同意書(shū)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn):①重要臟器功能障礙者；②臨床資料不完整；③對(duì)本研究藥物過(guò)敏者；④合并其他惡性腫瘤者；⑤意識(shí)障礙、精神疾病患者。

1.3 治療方法 (1)對(duì)照組采用TPF方案(多西他賽注射液75 mg/m2,第1天靜脈滴注；順鉑40 mg/m2，第1～3天靜脈滴注；5-Fu 750 mg/m2，第1～5天靜脈滴注)?；?個(gè)周期后行放療。采用 6 MV 直線(xiàn)加速器X線(xiàn)照射頸后區(qū)，劑量為2.0 Gy/d，5次/周。(2)聯(lián)合組在對(duì)照組基礎(chǔ)上給予三甲散加減治療。組方：三棱10 g、穿山甲15 g、鱉甲15 g、莪術(shù)10 g、海藻10 g、昆布10 g、落得打10 g、桃仁5 g、蟬衣5 g、紅花5 g，1劑/d，水煎成400 ml藥液，1劑/d，分早晚2次服用，連續(xù)治療8周。

1.4 觀(guān)察指標(biāo) 采用Western blot測(cè)定喉癌組織增殖相關(guān)蛋白(STAT3、CyclinD1、c-myc)、凋亡相關(guān)蛋白(Bax、Bcl-2、Caspase-3)、EMT相關(guān)蛋白(N-cadherin、Vimentin、E-cadherin)、侵襲相關(guān)蛋白(CD44v6、COX-2、MMP-9)、Wnt/β-catenin和PI3K/Akt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 2組增殖相關(guān)蛋白表達(dá)比較 2組治療前STAT3、CyclinD1、c-myc蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2組治療后STAT3、CyclinD1、c-myc蛋白表達(dá)均較治療前顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且聯(lián)合組治療后STAT3、CyclinD1、c-myc蛋白表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2組增殖相關(guān)蛋白表達(dá)比較

2.2 2組凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 2組治療前Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2組治療后Bcl-2蛋白表達(dá)均較治療前顯著降低，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)均較治療前顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且聯(lián)合組治療后Bcl-2蛋白表達(dá)低于對(duì)照組，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 2組凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

2.3 2組EMT相關(guān)蛋白表達(dá)比較 2組治療前N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2組治療后N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)均較治療前顯著降低，E-cadherin蛋白表達(dá)均較治療前顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且聯(lián)合組治療后N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)低于對(duì)照組，E-cadherin蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 2組EMT相關(guān)蛋白表達(dá)比較

2.4 2組侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)比較 2組治療前CD44v6、COX-2、MMP-9蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2組治療后CD44v6、COX-2、MMP-9蛋白表達(dá)均較治療前顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且聯(lián)合組治療后CD44v6、COX-2、MMP-9蛋白表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 2組侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)比較

2.5 2組Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)比較 2組治療前Wnt、β-catenin蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2組治療后Wnt、β-catenin蛋白表達(dá)均較治療前顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且聯(lián)合組治療后Wnt、β-catenin蛋白表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 2組Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)比較

2.6 2組PI3K/Akt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)比較 2組治療前PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2組治療后PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)均較治療前顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且聯(lián)合組治療后PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表6。

表6 2組PI3K/Akt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)比較

3 討論

增殖異常和凋亡受限是腫瘤細(xì)胞的基本特征，也是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵原因。STAT3是STAT家族的重要成員，持續(xù)激活的STAT3進(jìn)入細(xì)胞核后通過(guò)調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)[6,7]。資料顯示，活化的STAT3能夠上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白(CyclinD1、CyclinB、c-myc等)表達(dá)，從而加速細(xì)胞周期進(jìn)程及細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，而阻斷STAT3活化能夠下調(diào)CyclinD1表達(dá)并上調(diào)促凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)[8]。Caspase-3是Caspase-3家族成員，其過(guò)度活化能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]。Bcl-2蛋白家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其中促凋亡蛋白Bax通過(guò)增加線(xiàn)粒體膜通透性和細(xì)胞色素C釋放促進(jìn)細(xì)胞凋亡；抗凋亡蛋白Bcl-2能夠抑制Caspase-3激活，從而抑制細(xì)胞凋亡[10,11]。本研究結(jié)果顯示，2組治療前STAT3、CyclinD1、c-myc、Bcl、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2組治療后STAT3、CyclinD1、c-myc、Bcl-2蛋白表達(dá)均較治療前顯著降低，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)均較治療前顯著升高(P<0.05)，且聯(lián)合組治療后STAT3、CyclinD1、c-myc、Bcl-2蛋白表達(dá)低于對(duì)照組，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)。說(shuō)明在常規(guī)放化療基礎(chǔ)上聯(lián)用三甲散加減治療晚期喉癌能夠調(diào)控增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)，EMT是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲能力并轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處臟器的主要原因[12,13]。EMT相關(guān)分子標(biāo)志物包括E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等，EMT發(fā)生時(shí)E-cadherin表達(dá)降低，而N-cadherin、Vimentin表達(dá)增高[14]。CD44v6是一種細(xì)胞表面黏附分子，通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與基底膜結(jié)合參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移；COX-2是與腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲密切相關(guān)的細(xì)胞因子，其表達(dá)增高可導(dǎo)致腫瘤耐藥，可作為評(píng)估預(yù)后的重要指標(biāo)[15]；MMP-9是MMPs家族成員，通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜成分為腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移提供條件[16]。本研究結(jié)果說(shuō)明在常規(guī)放化療基礎(chǔ)上聯(lián)用三甲散加減治療晚期喉癌能夠調(diào)控EMT進(jìn)程，從而抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。

研究證實(shí)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的持續(xù)活化可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖，并抑制其凋亡，在細(xì)胞癌變過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究證實(shí)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路與宮頸癌、胃癌、肺癌、喉癌等多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[17,18]。另外，PI3K/Akt信號(hào)通路是體內(nèi)調(diào)控細(xì)胞分化和代謝的重要通路。既往研究證實(shí)，卵巢癌、甲狀腺癌、鼻咽癌等惡性腫瘤組織存在PI3K/Akt信號(hào)通路的異常激活，可通過(guò)調(diào)控Bcl-2、VEGF等蛋白表達(dá)參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程[19,20]。但是，三甲散加減能夠通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin、PI3K/Akt信號(hào)通路影響喉癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果說(shuō)明三甲散加減聯(lián)合同步放化療治療晚期喉癌能夠抑制Wnt/β-catenin、PI3K/Akt信號(hào)通路的持續(xù)活化，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲，并促進(jìn)其凋亡。

綜上所述，在常規(guī)放化療基礎(chǔ)上聯(lián)用三甲散加減治療晚期喉癌通過(guò)調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲，并促進(jìn)其凋亡，機(jī)制與抑制Wnt/β-catenin、PI3K/Akt信號(hào)通路活化有關(guān)。