馬媛媛 鐘斌 黃冬平 徐建鋒 王偉光 李文成 邱桂霞

支氣管哮喘是一種兒童時(shí)期常見的以氣道炎癥、氣道阻塞、氣流受限、氣道高反應(yīng)等為主要特征的慢性氣道疾病。近年來由于遺傳、對疾病認(rèn)知不足、過敏性疾病史等因素影響，我國兒童支氣管哮喘發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。有研究表明，輔助性T細(xì)胞亞型1(T helper 1 cells，Th1)/輔助性T細(xì)胞亞型2(T helper 2 cells，Th2)比例失衡可能通過促進(jìn)免疫球蛋白E(Immunoglobulin E，IgE)分泌增多誘導(dǎo)嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞增殖，進(jìn)而促進(jìn)炎性因子生成和氣道高反應(yīng)發(fā)生并引發(fā)哮喘[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，支氣管肺發(fā)育不良嬰兒血漿微小核糖核酸-29b(Micro Ribonucleic Acid 29b，miR-29b)表達(dá)水平降低，與患病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，miR-29b表達(dá)上調(diào)可通過調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)改善肺泡形成[3]。Chi等[4]研究報(bào)道，miR-29b在慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織中表達(dá)下調(diào)，可能介導(dǎo)Th1/Th2分化、相關(guān)炎性因子和氣道上皮重構(gòu)調(diào)節(jié)。本研究通過檢測支氣管哮喘患兒血清中miR-29b表達(dá)水平，分析與Th1/Th2失衡及相關(guān)炎性因子、患兒肺功能水平關(guān)系，探究miR-29b在兒童支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展中的意義，為臨床評估病情及治療提供一定的理論依據(jù)，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年5月至2019年5月廣東省婦幼保健院和清遠(yuǎn)市婦幼保健院收治的支氣管哮喘患兒104例為研究對象，其中男56例，女48例；年齡4～12歲，平均年齡(8.16±2.53)歲。根據(jù)患兒臨床病情進(jìn)展[5]分為急性發(fā)作組51例，臨床緩解組53例。另選取同期在本院體檢健康兒童48例為健康對照組，其中男29例，女19例；年齡(5～12)歲，平均年齡(8.39±2.76)歲。研究組和健康對照組年齡及性別比比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。受試者家屬均已對本研究知情并簽署知情同意書，本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組制定的《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[5]，確診為支氣管哮喘；②臨床資料完整；③能積極配合本研究。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并患有過敏性鼻炎、喘息性疾病者；②合并患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病等自身免疫性疾??；③ 3個(gè)月內(nèi)使用過糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑治療。

1.3 主要儀器 實(shí)時(shí)熒光定量(Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)儀(型號(hào)：7900，美國Applied Biosystems公司)、流式細(xì)胞儀(型號(hào)：FACSCalibu，美國Becton Dickinson公司)、肺功能檢測儀(型號(hào)MasterScreen，德國Jaeger公司)、qRT-PCR試劑盒(貨號(hào)：3914001，德國Roche公司)、總RNA提取試劑盒(貨號(hào)：73404，德國Qiagen公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：205311，德國Qiagen公司)、酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(批號(hào)：ab178013，美國Abcam公司)。

1.4 方法

1.4.1 樣本采集:入組哮喘患兒于入院后第2天清晨(健康對照組于體檢時(shí))空腹采集外周靜脈血5 ml，其中2 ml經(jīng)離心后分離上清液于-80℃保存，用于qRT-PCR及ELISA實(shí)驗(yàn)；另外3 ml使用EDTA抗凝，F(xiàn)icoll梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，用于Th1、Th2細(xì)胞檢測。常規(guī)收集所有受試兒童體重、血清總IgE、外周血嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及肺功能指標(biāo)1 s量(forced expired volume，F(xiàn)EV1)、用力肺活量(forced Vital Capacity，F(xiàn)VC)、最高呼吸氣流(peak expiratory flow，PEF)等一般資料。

1.4.2 血清miR-29b表達(dá)水平檢測:采用qRT-PCR法檢測血清miR-29b表達(dá)水平。Trizol法提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后用于qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系(20 μl)如下：Mix 10 μl，ROX 0.4 μl，cDNA 2 μl，6.0 μl ddH2O，上游引物0.8 μl，下游引物0.8 μl。反應(yīng)步驟如下：95℃、5 min，1循環(huán)；95℃、15 s，62℃、1 min，以上40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計(jì)算miR-29b相對表達(dá)量。見表1。

表1 qRT-PCR引物

1.4.3 外周血Th1、Th2細(xì)胞水平檢測:采用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血Th1、Th2細(xì)胞水平。設(shè)置對照管和檢測管后分別加入FITC-CD4、IgG、PE-干擾素-γ(interferon γ，IFN-γ)、PE-白介素-4(interleukin 4，IL-4)。以CD4、IFN-γ雙陽性為Th1細(xì)胞，CD4、IL-4雙陽性為Th2細(xì)胞。

1.4.4 血清Th1、Th2相關(guān)細(xì)胞因子水平檢測:采用ELISA法檢測血清IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IFN-γ水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 急性發(fā)作組、臨床緩解組及健康對照組一般資料比較 急性發(fā)作組、臨床緩解組及健康對照組年齡、性別比、體重比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。健康對照組、臨床緩解組、急性發(fā)作組患兒外周血嗜酸性粒細(xì)胞、血清總IgE水平依次顯著升高(P<0.05)，肺功能指標(biāo)FEV1、FVC、PEF水平依次顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 急性發(fā)作組、臨床緩解組及健康對照組一般資料比較

2.2 急性發(fā)作組、臨床緩解組及健康對照組血清miR-29b、外周血Th1、Th2水平比較 急性發(fā)作組患兒血清miR-29b、外周血Th1、Th1/Th2水平明顯低于臨床緩解組患兒及健康對照組(P<0.05)，外周血Th2水平明顯高于臨床緩解組患兒及健康對照組(P<0.05)。臨床緩解組患兒血清miR-29b、外周血Th1、Th1/Th2水平明顯低于健康對照組(P<0.05)，外周血Th2水平明顯高于健康對照組(P<0.05)。見表3。

表3 急性發(fā)作組、臨床緩解組及健康對照組血清miR-29b與外周血Th1、Th2水平比較

2.3 急性發(fā)作組、臨床緩解組及健康對照組血清相關(guān)細(xì)胞因子水平比較 健康對照組、臨床緩解組、急性發(fā)作組血清IL-2、IFN-γ水平依次顯著降低(P<0.05)，血清IL-4、IL-5、IL-6、IL-10水平依次顯著升高(P<0.05)。見表4。

表4 急性發(fā)作組、臨床緩解組及健康對照組血清相關(guān)細(xì)胞因子水平比較

2.4 哮喘患兒血清miR-29b與外周血Th1/Th2水平相關(guān)性 急性發(fā)作期及臨床緩解期哮喘患兒血清miR-29b與外周血Th1/Th2水平均呈正相關(guān)(r=0.421，P=0.000；r=0.441，P=0.001)。見圖1、2。

圖1 急性發(fā)作期哮喘患兒血清miR-29b與Th1/Th2水平相關(guān)性

2.5 哮喘患兒血清miR-29b與相關(guān)炎性指標(biāo)及細(xì)胞因子水平相關(guān)性 哮喘患兒血清miR-29b與外周血嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清總IgE、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與血清IL-2、IFN-γ水平呈正相關(guān)(P<0.05)。血清miR-29b與哮喘患兒肺功能指標(biāo)FEV1、FVC、PEF水平呈正相關(guān)(P<0.05)。見表5、6。

圖2 臨床緩解期哮喘患兒血清miR-29b與Th1/Th2水平相關(guān)性

表5 哮喘患兒血清miR-29b與相關(guān)炎性指標(biāo)及細(xì)胞因子水平相關(guān)性

表6 哮喘患兒血清miR-29b與肺功能指標(biāo)相關(guān)性

3 討論

兒童期支氣管哮喘癥狀以胸悶、氣急、喘息、咳嗽為主，患兒常出現(xiàn)上呼吸道感染、肺功能變化明顯，嚴(yán)重影響患兒身心健康。研究認(rèn)為，樹突狀細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等參與的機(jī)體免疫失衡和炎性反應(yīng)發(fā)生在支氣管哮喘發(fā)病調(diào)控中有重要作用[6]。

Tang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，慢性阻塞性肺疾病患者血漿中miR-29b表達(dá)下調(diào)，可能通過調(diào)控炎性細(xì)胞因子表達(dá)參與患者氣道炎癥，與慢性阻塞性肺疾病嚴(yán)重程度有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，健康對照組、臨床緩解組、急性發(fā)作組哮喘患兒血清miR-29b表達(dá)水平依次顯著降低，提示miR-29b表達(dá)水平降低可能預(yù)示哮喘發(fā)生發(fā)展。Apolline等[12]研究報(bào)道，自身免疫性糖尿病小鼠模型中miR-29b低水平，與自身免疫引起的炎性反應(yīng)發(fā)生有關(guān)。Suzanne等[13]研究表明，癌癥放療過程中引起的血管疾病與慢性炎癥激活有關(guān)，miR-29b過表達(dá)可通過下調(diào)炎性因子表達(dá)抑制血管炎性反應(yīng)，提示miR-29b低表達(dá)可能與哮喘進(jìn)展中炎性反應(yīng)發(fā)生有關(guān)。

綜上所述，健康對照組、臨床緩解組、急性發(fā)作組血清miR-29b水平依次顯著降低，miR-29b低表達(dá)可能通過調(diào)控Th1/Th2比例失衡，影響相關(guān)炎性細(xì)胞因子變化，促進(jìn)哮喘發(fā)生發(fā)展。但由于本研究方法較為簡單，尚需通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究相關(guān)機(jī)制。