樊小寶 丁通 孫燕 吳冰 王晶 杜鵬

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的常見并發(fā)癥之一，臨床特征以糖脂代謝紊亂、腎功能進(jìn)行性減退、持續(xù)性蛋白尿為主，致殘、致死率高，可導(dǎo)致終末期腎病，是引起糖尿病患者死亡的主要原因[1,2]。足細(xì)胞作為腎小球濾過屏障結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成部分，抑制腎內(nèi)足細(xì)胞病理損傷是改善DN臨床癥狀的關(guān)鍵[3]。PI3K/Akt/mTOR信號可調(diào)控細(xì)胞存活、凋亡及自噬、炎癥、氧化應(yīng)激等生理、病理過程，激活該通路可抑制炎性反應(yīng)，減輕神經(jīng)元凋亡，改善神經(jīng)功能[4]，并可減輕自噬相關(guān)炎癥，減輕腎小管上皮細(xì)胞凋亡，改善腎功能，保護(hù)腎組織免于損傷[5]。PI3K/Akt/mTOR信號可能是改善DN大鼠足細(xì)胞功能障礙的潛在治療靶點。石斛堿是我國傳統(tǒng)名貴中藥石斛的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎的功效，可滋陰益胃、清熱生津，對糖尿病具有較好療效[6]。研究發(fā)現(xiàn)，金釵石斛可抑制糖尿病大鼠腎組織TGF-β1表達(dá)，對腎臟發(fā)揮明顯的保護(hù)作用[7]，石斛合劑能下調(diào)TNF-α及IL-6的表達(dá)，減輕腎內(nèi)炎性反應(yīng)，緩解腎臟損傷，進(jìn)而延緩DN病情進(jìn)展[8]。但石斛堿是否可影響DN大鼠PI3K/Akt/mTOR信號通路表達(dá)及足細(xì)胞功能障礙，目前還不清楚，本文通過建立DN大鼠模型，進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF清潔級SD大鼠，廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，動物質(zhì)量合格證號44007200021086，生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2016-0002，雄性，體重200～240 g，飼養(yǎng)條件：溫度22～25℃，相對濕度50%～60%，12 h/12 h間斷照明，自由進(jìn)食、飲水，環(huán)境保持清潔、安靜、通風(fēng)良好，在本院動物房中飼養(yǎng)1周后用于實驗。

1.2 主要試劑及儀器 石斛堿，上海士鋒生物科技有限公司，貨號EB07670；鹽酸二甲雙胍片，中美上海施貴寶制藥有限公司，大鼠PCX ELISA試劑盒，路非凡生物科技公司，貨號：YDE04398；大鼠nephrin ELISA試劑盒，上海恒斐生物科技有限公司，貨號：CSB-E13957r-1；大鼠IL-6及TNF-α ELISA試劑盒、兔源GAPDH、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR及p-mTOR一抗、羊抗兔二抗，美國Abcam公司，貨號ab100772、ab100785、ab181602、ab151549、ab138364、ab179463、ab38449、ab2732、ab84400、ab150077；RIPA裂解液、BCA試劑盒、HE染色試劑盒，上海碧云天公司，貨號P0013K、P0011、C0105等。BX-4000全自動生化分析儀，南京新惠通生物科技有限公司；XElx800酶標(biāo)儀，美國 Perkin Elmer公司；RM2016病理切片機(jī)、EG1160包埋機(jī)、HI1220烤片機(jī)，上海徠卡儀器有限公司；NIKON ECLIPSE CI正置光學(xué)顯微鏡；1659001蛋白電泳儀、Trans-Blot Turbo轉(zhuǎn)膜儀，美國Bio-Rad公司；GIS-500凝膠成像儀，Miulab公司等。

1.3 方法

1.3.1 動物模型制備及分組給藥:參考文獻(xiàn)中方法[8]，SD大鼠腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉，摘除左腎，置于鼠籠中喂養(yǎng)1周，以60 mg/kg的劑量腹腔注射鏈脲佐菌素，72 h后隨機(jī)測量血糖，2次>16.7 mmol/L，于12周末測得24 h尿微量白蛋白量>30 mg時，表示糖尿病腎病大鼠模型建立成功，共建模64只，成功60只。隨機(jī)分為模型組、石斛堿低劑量組、石斛堿中劑量組、石斛堿高劑量組、二甲雙胍組5組，每組12只，另取12只SD大鼠于麻醉后僅做開腹處理，不摘除左腎，喂養(yǎng)1周后等劑量腹腔注射生理鹽水設(shè)為假手術(shù)組。參照文獻(xiàn)[9-11]，石斛堿、二甲雙胍片溶于生理鹽水配制為2、4、8 mg/ml石斛堿溶液、二甲雙胍[12]溶液，14 mg/ml的溶液，藥物處理組大鼠以10 ml/kg的劑量灌胃，假手術(shù)組與模型組大鼠以同劑量0.9%氯化鈉溶液灌胃，持續(xù)14 d。

1.3.2 大鼠生化指標(biāo)檢測及標(biāo)本收集:末次給藥結(jié)束后24 h，收集大鼠24 h尿液，混勻后取2 ml儲存在-80℃冰箱中備用。尾靜脈取血4 ml，靜置后離心，收集上清液，獲得血清，取其中一半置于全自動生化分析儀中，參照其說明書檢測大鼠生化指標(biāo)血糖、血脂、UMA水平，剩余血清儲存在-80℃冰箱中備用。將大鼠麻醉后處死，解剖取出腎臟，剪取約0.5 g腎組織儲存在液氮中備用，剩余組織以0.9%氯化鈉溶液漂洗干凈，置于4%多聚甲醛固定，以低濃度到高濃度的乙醚脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，最后以切片機(jī)做常規(guī)病理切片備用。

1.3.3 大鼠腎組織病理形態(tài)檢測:1.2.2中的切片，選取完好的進(jìn)行脫蠟、高濃度到低濃度酒精浸泡處理，參照HE試劑盒說明書進(jìn)行染色，經(jīng)0.9%氯化鈉溶液漂洗后，再次進(jìn)行脫水、透明處理后采用中性樹膠封片，以光學(xué)顯微鏡觀察腎組織病理形態(tài)并任選5個視野拍照。

1.3.4 大鼠尿液nephrin、PCX水平及血清IL-6、TNF-α水平檢測:取出1.2.2中的尿液、血清置于4℃冰箱中解凍，以ELISA試劑盒檢測其中nephrin、PCX、IL-6、TNF-α水平，具體步驟參照說明書進(jìn)行。

1.3.5 大鼠腎組織PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測:將1.2.2中的腎組織剪碎置于蛋白裂解液中，以勻漿機(jī)勻漿后制備為勻漿液，離心提取總蛋白，參照BCA試劑盒的說明書測定其總蛋白濃度，然后將其調(diào)整至各組樣品液濃度，取相同體積樣品液上樣，進(jìn)行電泳，分離蛋白后將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉2 h(室溫)，根據(jù)目的蛋白分子量截取蛋白條帶，以稀釋比例為1∶1 000的兔源GAPDH、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR及p-mTOR一抗孵育過夜(4℃)，以TBST溶液漂洗后以稀釋比例為1∶1 000的羊抗兔二抗孵育2 h(室溫)，最后經(jīng)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色后以凝膠成像系統(tǒng)拍照，以Quantity One軟件分析條帶，得出各組蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 石斛堿對糖尿病大鼠血糖、血脂、UMA水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血糖、血脂、UMA水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，石斛堿低、中、高劑量組及二甲雙胍組大鼠血糖、血脂、UMA水平降低(P<0.05)，且石斛堿各組呈劑量依賴性，石斛堿高劑量組與二甲雙胍組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 6組血糖、血脂、UMA 水平比較

2.2 石斛堿對糖尿病大鼠腎組織病理形態(tài)的影響 假手術(shù)組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常，足狀突起排列有序，清晰可見；模型組大鼠腎組織出現(xiàn)腎小球基底膜局部增厚，足狀突起排列紊亂呈帶狀結(jié)構(gòu)，局部突起融合、變平，貼敷于基底膜等病理損傷；與模型組相比，石斛堿低、中、高劑量組及二甲雙胍組大鼠腎組織病理損傷均不同程度地減輕，并呈劑量依賴性；石斛堿高劑量組與二甲雙胍組比較，腎組織病理損傷程度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

2.3 石斛堿對糖尿病大鼠尿中nephrin、PCX蛋白含量的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠尿中nephrin、PCX蛋白含量顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，石斛堿低、中、高劑量組及二甲雙胍組大鼠尿中nephrin、PCX蛋白含量降低(P<0.05)，且石斛堿各組呈劑量依賴性，石斛堿高劑量組與二甲雙胍組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 6組糖尿病大鼠尿中nephrin、PCX蛋白含量比較

2.4 石斛堿對糖尿病大鼠血清IL-6、TNF-α水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中IL-6、TNF-α水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，石斛堿低、中、高劑量組及二甲雙胍組大鼠血清中IL-6、TNF-α水平含量降低(P<0.05)，且石斛堿各組呈劑量依賴性，石斛堿高劑量組與二甲雙胍組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 6組大鼠血清IL-6、TNF-α水平比較

2.5 石斛堿對糖尿病大鼠腎組織PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，石斛堿低、中、高劑量組及二甲雙胍組大鼠腎組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR升高(P<0.05)，且石斛堿各組呈劑量依賴性，石斛堿高劑量組與二甲雙胍組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2，表4。

圖2 免疫印跡檢測各組大鼠腎組織中PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表達(dá);A 假手術(shù)組；B 模型組；C 石斛堿低劑量組；D 石斛堿低劑量組；E 石斛堿低劑量組；F 二甲雙胍組

表4 6組大鼠腎組織PI3K/Akt/mTOR通路蛋白相對表達(dá)比較

3 討論

DN是糖尿病的主要并發(fā)癥，足細(xì)胞損傷是其超微觀病理變化，也是蛋白尿持續(xù)發(fā)生、DN病情進(jìn)展的主要病理基礎(chǔ)。足細(xì)胞為附著于腎小球基底膜外側(cè)的上皮細(xì)胞，與腎小球基底膜、內(nèi)皮細(xì)胞共同構(gòu)成腎小球濾過屏障，因糖尿病腎臟足細(xì)胞長期處于高糖環(huán)境中，其細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成增多[11]，誘導(dǎo)促炎因子IL-6、TNF-α大量合成釋放[12]，引發(fā)嚴(yán)重的炎性反應(yīng)，造成足細(xì)胞凋亡，其標(biāo)志蛋白nephrin、PCX[15]進(jìn)入尿液中，導(dǎo)致蛋白尿產(chǎn)生。本文以腹腔注射鏈脲佐菌素的方法建立DN大鼠模型，結(jié)果顯示，建模大鼠腎組織呈現(xiàn)腎小球基底膜局部增厚，足狀突起排列紊亂呈帶狀結(jié)構(gòu)，局部突起融合、變平，貼敷于基底膜等病理損傷，大鼠血糖、血脂、UMA、TNF-α及IL-6水平、尿中nephrin、PCX蛋白含量顯著升高，表明鏈脲佐菌素可破壞大鼠正常的糖脂代謝，引發(fā)腎組織嚴(yán)重的炎性反應(yīng)，造成足細(xì)胞凋亡，引發(fā)蛋白尿，提示模型建立成功。

石斛為《神農(nóng)本草經(jīng)》中的上品藥物，具有清熱、滋陰、益胃、生津的功效，是治療糖尿病的重要藥物，石斛堿是其最主要的有效成分，可促使糖脂代謝恢復(fù)正常，抑制腎內(nèi)炎癥發(fā)生發(fā)展，減輕腎臟損傷[6-8,15,16]。本研究以石斛堿處理DN模型大鼠，結(jié)果顯示，石斛堿可減輕DN大鼠腎組織足細(xì)胞病理損傷，降低血糖、血脂、UMA、TNF-α及IL-6水平、尿中nephrin、PCX蛋白含量，且呈劑量依賴性，表明石斛堿可恢復(fù)DN大鼠正常糖脂代謝，減輕腎臟炎癥，緩解蛋白尿癥狀，改善足細(xì)胞功能障礙，并隨劑量升高而作用增強(qiáng)。

PI3K/AKT/mTOR作為機(jī)體調(diào)控氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等多種生理病理過程的信號，在DN發(fā)生發(fā)展過程中起到重要調(diào)控作用。PI3K/AKT/mTOR信號是DN的治療靶點之一，激活該通路提高其磷酸化水平，可抑制腎組織炎性反應(yīng)，抑制足細(xì)胞凋亡，減輕蛋白尿癥狀[5,17]。但石斛堿是否可影響DN大鼠PI3K/Akt/mTOR信號傳導(dǎo)，目前還不清楚。本文對此進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，DN模型大鼠腎組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR顯著降低，表明PI3K/AKT/mTOR信號參與介導(dǎo)DN大鼠足細(xì)胞功能障礙。經(jīng)石斛堿處理后，DN大鼠腎組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR升高，且石斛堿各組呈劑量依賴性，表明石斛堿可激活PI3K/AKT/mTOR信號，可能通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，改善DN大鼠足細(xì)胞功能障礙，減輕腎臟損傷。

綜上所述，石斛堿可促進(jìn)PI3K/AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白磷酸化，調(diào)節(jié)糖脂代謝恢復(fù)正常，降低炎性因子表達(dá)，阻止腎臟炎性反應(yīng)發(fā)生發(fā)展，抑制足細(xì)胞凋亡，修復(fù)受損足細(xì)胞功能，激活PI3K/Akt/mTOR通路可能是其藥理機(jī)制，但本文只做了初步研究，未曾使用PI3K/Akt/mTOR通路抑制劑及激動劑進(jìn)行對照驗證，存在一定不足，關(guān)于石斛堿治療DN大鼠的確切作用機(jī)制還有待后續(xù)深入研究。