劉麗麗 嚴佳棟 許曉東 徐志英 曹鶯

肝癌的發(fā)病率在全球癌癥中排名第5位，在癌癥導致的死亡率中排名第二[1]。在世界范圍內(nèi)，中國的肝癌發(fā)病率最高，每10萬人口中，約有25.7人新診斷為肝癌[2]。肝癌的治療手段包括化療、肝切除術(shù)、肝移植和免疫治療等。隨著科技的發(fā)展，盡管對肝癌的研究取得了很多進展，但是在發(fā)展中國家，肝癌的治愈率很低。這就需要尋找新的、療效更好、更低的藥物來治療肝癌。小檗胺是從小檗等中草藥中分離得到的一種雙芐基異喹啉類生物堿。鹽酸小檗胺片在臨床上用于治療白細胞減少癥，且無明顯的不良反應[3]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)小檗胺擁有抗腫瘤活性，能夠抑制肺癌細胞的增殖[4]、抑制乳腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移[5]、誘導肝癌細胞的凋亡[6]。然而，小檗胺在體內(nèi)對肝癌的作用目前還沒有研究。卵巢腫瘤相關(guān)蛋酶B1(OTU domain-containing ubiquitin aldehyde-binding protein B1，OTUB1)隸屬于去泛素化酶(DeUbiquitinating Enzymes，DUB)超家族，在人類肝、腎、腦等組織中廣泛表達。研究表明，OTUB1在非小細胞肺癌及肝癌細胞中表達上調(diào)[7,8]，在肝癌患者中，OTUB1的表達量與肝癌的TNM分期、轉(zhuǎn)移性明顯相關(guān)，OTUB1表達量越高，TNM分期值越大，肝癌患者越容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的預后越差。另外，研究表明OTUB1能夠抑制抗凋亡蛋白p53的表達[9]，p53是抑癌基因，在維持細胞完整性和防止細胞癌變中發(fā)揮重要作用。但是截至目前，還沒有研究表明小檗胺抑制肝癌的作用與OTUB1有關(guān)。我們假設小檗胺能夠在體內(nèi)外抑制肝癌細胞系SMMC-7721的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移，并且這種作用可能是通過調(diào)節(jié)OTUB1的表達來實現(xiàn)的。

1 材料與方法

1.1 試劑 小檗胺購自上海詩丹德生物技術(shù)有限公司(批號：1895，純度>98%)。制備成濃度為100 mmol/L的儲存液，在每次試驗中用細胞培養(yǎng)液稀釋到所需濃度。環(huán)磷酰胺(貨號：PHR1404)購自Sigma。胎牛血清(FBS，批號：SV30087.02-NZJ1221)購自Hyclone，RPMI培養(yǎng)液(貨號：2141287)購自Gibco?？贵wp53(批號：GR136120-36)購自Abcam，OTUB1(批號：A1618)、caspase-3(貨號：sc-7272)、Bcl-2(貨號：sc-578)、Bax(貨號：sc-7480)和β-actin(貨號：sc-8432)購自 Santa Cruz Biotechnology。Western相關(guān)試劑如裂解液BCA試劑盒(貨號：P0012)、蛋白酶抑制劑(PMSF，貨號：ST506)、電泳液(貨號：P1004D)、轉(zhuǎn)膜液(貨號：P0021B)來自于碧云天，ECL發(fā)光試劑盒(貨號：WBKLS0500)購自milippore。

1.2 儀器 高速離心機(型號：Heraeus fresco 17，Thermo，美國)，二氧化碳培養(yǎng)箱(型號：SHELLAB 3517/21，Thermo，美國)，熒光倒置顯微鏡(序列號：SN409396，徠卡，德國)，多功能酶標儀(序列號：SN3001-2228，Thermo，美國)，ECL發(fā)光儀(序列號：SN7218R11306，Bio-Rad，美國)，電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(型號：MP4，Bio-rad，美國)，-80℃冰箱(型號：MDF-U3386S，三洋，日本)。

1.3 方法

1.3.1 細胞株:肝癌細胞株SMMC-7721，購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。置于RPMI 1640培養(yǎng)基(含10% FBS，1%青鏈霉素)中，于37℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天傳代換液1次，選用對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3.2 實驗動物:BALB/c裸鼠，雄性，6周齡，購自江蘇集萃藥康生物技術(shù)有限公司[合格證號：SCXK (蘇)2018-0008]。飼養(yǎng)于SPF級動物房內(nèi)。

1.3.3 MTT試驗:取對數(shù)期的SMMC-7721細胞加入96孔板(1×104個細胞/孔)中過夜，輕輕把培養(yǎng)液吸去，每孔加入不同濃度的小檗胺(溶劑對照、1.25 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L和80 μmol/L)的培養(yǎng)液180 μl，將細胞置于37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，然后每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)在37℃孵育4 h，小心吸去上清，每孔加入150 μl DMSO，脫色震蕩10 min，用酶標儀在560 nm波長處檢測OD值。

1.3.4 劃痕試驗:將SMMC-7721細胞(1×105個細胞/孔)種于6孔板中培養(yǎng)。當細胞鋪到80%滿的時候，用200 μl的槍頭在單層細胞上劃一條直線，用PBS輕輕地洗去漂浮的細胞，加入含不同濃度小檗胺(溶劑對照、10 μmol/L、20 μmol/L和40 μmol/L)和陽性藥(環(huán)磷酰胺30 μmol/L)的完全培養(yǎng)液，將細胞置于37℃培養(yǎng)箱中孵育。在劃線后的0 h和24 h，用倒置顯微鏡拍照。用NIH Image J軟件計算劃痕愈合率。劃痕愈合率=(0 h劃痕-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積。為了排除細胞增殖對實驗的影響，在加入藥物時，每孔細胞中加入絲裂霉素(1.0 μg/ml)。

1.3.5 體內(nèi)實驗:用BALB/c裸鼠建立皮下移植腫瘤模型。按照《實驗動物管理條例》有關(guān)規(guī)定，在SPF級動物房內(nèi)飼養(yǎng)裸鼠。待裸鼠適應環(huán)境1周后，取對數(shù)期的SMMC-7721細胞(1×107個)注射于裸鼠的右后側(cè)皮下。接種3 d后，每天用游標卡尺測量腫瘤的長(L)和寬(W)，計算腫瘤體積(V)，V = W2×L/2。腫瘤體積長到150 mm3時，將動物隨機分成溶劑對照組、陽性藥組(環(huán)磷酰胺，50 mg/kg)和小檗胺組(20 mg/kg)，通過腹腔注射的方式給藥，每隔1 d記錄裸鼠體重、腫瘤體積。連續(xù)記錄20 d。在末次給藥后，將動物處死，剝離腫瘤組織用于western試驗。

1.3.6 Western Blot試驗:將SMMC-7721細胞和動物腫瘤組織用裂解液(含1 mmol/L PMSF)裂解，提取總蛋白。將裂解后的蛋白用BCA試劑盒進行蛋白定量。將總蛋白(20 μg)在10%的SDS-PAGE膠上進行分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，再用含5 %脫脂牛奶的TBST溶液室溫封閉2 h，然后孵一抗OTUB1(1∶1 000稀釋)、p53(1∶1 000稀釋)、caspase-3(1∶1 000稀釋)、Bcl-2(1∶500稀釋)、Bax(1∶1 000稀釋)和β-actin(1∶2 000稀釋)4℃過夜，用TBST洗滌3次，室溫孵二抗(1∶10 000稀釋)2 h，再用TBST洗滌3次，用ECL發(fā)光儀檢測顯影，ECL發(fā)光儀采集圖像，用NIH Image J軟件計算灰度值。

2 結(jié)果

2.1 小檗胺抑制SMMC-7721細胞的增殖 小檗胺以濃度依賴和時間依賴的方式抑制SMMC-7721細胞的增殖，小檗胺處理細胞的時間越長，對細胞發(fā)揮增殖抑制的濃度越低，用小檗胺處理SMMC-7721細胞24 h、 48 h和72 h時，與對照組比較，小檗胺明顯抑制SMMC-7721細胞增殖的最低濃度分別是20 μmol/L(P<0.05)、10 μmol/L(P<0.05)和1.25 μmol/L(P<0.05)。小檗胺處理SMMC-7721細胞72 h時，抑制細胞增殖的IC50為17.4 μmol/L。見表1，圖1。

表1 小檗胺對SMMC-7721細胞增殖能力的影響

2.2 小檗胺抑制SMMC-7721細胞的遷移 用劃痕試驗評價小檗胺對SMMC-7721細胞遷移的影響，在劃痕后24 h，與對照組比較，陽性藥能夠明顯降低SMMC-7721細胞的劃痕愈合率(P<0.01)，對照組24 h的劃痕愈合率為(74.1±10.3)%，陽性藥組24 h的劃痕愈合率為(9.5±2.1)%，10 μmol/L的小檗胺、20 μmol/L的小檗胺和40 μmol/L的小檗胺能夠明顯抑制SMMC-7721細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，10 μmol/L小檗胺組、20 μmol/L小檗胺組和40 μmol/L小檗胺組24 h的劃痕愈合率分別為(60.4±6.9)%(P<0.05)，(21.4±5.2)%(P<0.01)和(8.7±1.8)%(P<0.001)。見圖1，表2。

表2 小檗胺對SMMC-7721細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響

圖1 小檗胺對SMMC-7721細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響，用劃痕試驗檢測小檗胺對SMMC-7721細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響(拔=100 μm)

2.3 小檗胺對SMMC-7721細胞中OTUB1等蛋白表達的影響 用western blot試驗用來檢測小檗胺對SMMC-7721細胞OTUB1等蛋白表達的影響。試驗結(jié)果顯示，與對照組比較，20 μmol/L和40 μmol/L的小檗胺能夠明顯下調(diào)OTUB1的表達，下調(diào)率分別為(39.4±4.3)%(P<0.01)和(65.6±2.4)%(P<0.001)。10 μmol/L、20 μmol/L和40 μmol/L的小檗胺能夠明顯下調(diào)Bcl-2/Bax的表達(P<0.01)，下調(diào)率分別為(29.1±10.2)%(P<0.05)、(40.8±4.4)%(P<0.01)和(79.9±2.3)%(P<0.01)。與對照組比較，20 μmol/L和40 μmol/L的小檗胺能夠上調(diào)p53的表達，上調(diào)率分別為(60.9±17.9)%(P<0.05)和(105.2±18.7)%(P<0.05)。10 μmol/L、20 μmol/L和40 μmol/L的小檗胺能夠明顯上調(diào)cleaved-caspase-3/caspase-3的表達，上調(diào)率為(57.6±12.3)%(P<0.05)、(96.7±8.3)%(P<0.01)和(123.6±7.1)%(P<0.001)。見圖2。

圖2 小檗胺對SMMC-7721細胞OTUB1等蛋白表達的影響。用western blot試驗來檢測p53、OTUB1、Bcl-2/Bax、和cleaved-caspase-3/caspase-3的表達

表3 小檗胺對SMMC-7721細胞OTUB1等蛋白表達的影響

2.4 小檗胺在體內(nèi)對腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的影響 用皮內(nèi)移植腫瘤模型評價小檗胺對SMMC-7721細胞移植腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移的影響。試驗結(jié)果表明，與對照組比較，在給藥12 d后，陽性藥環(huán)磷酰胺組動物的腫瘤體積明顯小于對照組(P<0.01)，給藥16 d后，小檗胺組動物的腫瘤體積明顯小于對照組(P<0.05)。直到試驗結(jié)束，各組裸鼠的體重差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。給藥20 d后，將動物處死，剝離腫瘤組織和肝臟組織，與對照組比較，陽性藥環(huán)磷酰胺組和小檗胺組的腫瘤重量明顯小于對照組(P<0.05)。對照組肝表面節(jié)點數(shù)較多，而小檗胺組和陽性藥環(huán)磷酰胺組肝臟上的節(jié)點數(shù)相較于對照組明顯減少(P<0.05)。見圖3，表4～6。

圖3 小檗胺在體內(nèi)對腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移的影響；A 小檗胺對裸鼠腫瘤生長的影響；B 小檗胺對肝臟表面結(jié)節(jié)數(shù)的影響(箭頭所指為肝臟表面結(jié)節(jié))

表4 小檗胺對腫瘤體積的影響

表5 小檗胺對肝裸鼠體重的影響

表6 小檗胺對腫瘤重量及轉(zhuǎn)移的影響

2.5 小檗胺對腫瘤組織中OTUB1等蛋白表達的影響 用western blot試驗檢測小檗胺對腫瘤組織中OTUB、p53等蛋白表達的影響。試驗結(jié)果顯示，與對照組比較，小檗胺能夠明顯下調(diào)OTUB1(P<0.01)和Bcl-2/Bax(P<0.01)的表達，下調(diào)率分別為(56.3±6.8)%和(50.1±8.3)%。小檗胺能夠顯著上調(diào)p53(P<0.05)和cleaved-caspase-3/caspase-3(P<0.01)的表達，上調(diào)率分別為(99.1±30.3)%和(83.1±16.2)%。見圖4，表7。

圖4 小檗胺對腫瘤組織中OTUB1等蛋白表達的影響；用western blot試驗來檢測p53、OTUB1、Bcl-2/Bax、和cleaved-caspase-3/caspase-3的表達

表7 小檗胺對腫瘤組織中OTUB1等蛋白表達的影響

3 討論

肝癌在全球?qū)е滤劳龅陌┌Y中處于第二位，每年有80萬患者確診為肝癌[10]，大多數(shù)患者在腫瘤已經(jīng)發(fā)展到晚期時才得到診斷，常見的治療手段包括手術(shù)切除、原位肝移植或局部肝移植等治療方法。肝癌的進展受細胞外因子和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路的控制[11]。因此，闡明肝癌的發(fā)生發(fā)展機制，開發(fā)新的治療肝癌的藥物會為肝癌提供新的治療方法。

泛素化酶通過改變蛋白底物的泛素化狀態(tài)來調(diào)節(jié)多種生物學過程，其中許多生物學過程與癌癥的發(fā)展緊密相關(guān)。OTUB1是去泛素化酶家族的一員，它通過調(diào)控多種癌癥相關(guān)信號通路，包括MAPK、ERa、EMT、RHOa、mTORC1、FOXM1和P53等促進腫瘤細胞存活、增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和治療抵抗性等[12]。OTUB1在多種腫瘤類型包括肺癌、乳腺、卵巢、膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌和胃癌中高表達[13-16]。研究顯示，骨髓瘤細胞的凋亡增加與OTUB1的表達下調(diào)密切相關(guān)[17]，miR-542-3p通過抑制OTUB1來抑制結(jié)腸癌細胞的增殖與侵襲轉(zhuǎn)移[18]，另外，OTUB1能夠促進卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移[16]。此次研究結(jié)果顯示小檗胺在體外能顯著抑制SMMC-7721細胞的增殖與侵襲轉(zhuǎn)移(P<0.05)。在體內(nèi)，下檗胺能夠明顯抑制SMMC-7721細胞移植生成的腫瘤的生長(P<0.05)，而且小檗胺能夠使肝臟表面的結(jié)節(jié)數(shù)減少，降低腫瘤的重量，此外，western的實驗結(jié)果小檗胺在體內(nèi)與體外實驗中均能使SMMC-7721細胞及腫瘤組織中OTUB1的表達下調(diào)，這與文獻的研究結(jié)果一致。結(jié)合參考文獻，我們可以得出小檗胺在體內(nèi)外均能抑制肝癌SMMC-7721細胞的增殖與侵襲轉(zhuǎn)移，這種作用可能是通過調(diào)控OTUB1的表達來實現(xiàn)的。抑癌基因p53可以抑制腫瘤細胞的生長與增殖，它通過轉(zhuǎn)錄激活或抑制很多目標基因的靶蛋白，從而導致細胞周期停滯，細胞死亡和衰老等，也可以直接觸發(fā)線粒體介導的細胞凋亡。p53可以直接與促生存家族Bcl-2結(jié)合，釋放出Bax，Bax根據(jù)Bax應激狀態(tài)發(fā)揮促凋亡或抗侵襲轉(zhuǎn)移功能[19]。研究表明在結(jié)腸癌細胞中，OTUB1的抑制會導致p53的表達上調(diào)[19]，我們的研究顯示小檗胺能夠抑制肝癌SMMC-7721細胞的增殖與侵襲轉(zhuǎn)移，能夠下調(diào)OTUB1的表達與Bcl-2/Bax的比例，上調(diào)p53的表達，這與文獻報道一致。此外，caspase3在細胞調(diào)亡與增殖中發(fā)揮重要作用[19]，因此，我們檢測了caspase-3的表達，western的試驗結(jié)果顯示cleaved-caspase3/caspase3的比例上調(diào)，說明小檗胺可能通過調(diào)控caspase-3的表達來抑制細胞的增殖、誘導細胞的凋亡。綜上，小檗胺可能是通過抑制OTUB1的表達，進一步調(diào)控p53、Bcl-2/Bax的比例來來抑制SMMC-7721細胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移。以及調(diào)控cleaved-caspase3/caspase3的比例來影響促進凋亡，進而抑制細胞增殖。

小檗胺能夠抑制肝細胞SMMC-7721的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移，這種作用可能是通過調(diào)控OTUB1的表達，進一步調(diào)控p53、Bcl-2/Bax和caspase的表達來實現(xiàn)的。