陳國(guó)雁 馮曉波 尚精娟 李敏虹 廖冰靈

結(jié)腸癌是普外科常見腫瘤，其發(fā)病率呈逐年增高的趨勢(shì)，其治療主要為手術(shù)治療。結(jié)腸癌早期患者手術(shù)治療預(yù)后較好，而晚期患者預(yù)后較差，故早期發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌是提高預(yù)后的重要因素[1,2]?，F(xiàn)有對(duì)結(jié)腸癌的診斷主要依靠臨床癥狀和體征，并依據(jù)CT和胃腸鏡檢查等確診，往往發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌屬于晚期，對(duì)預(yù)后產(chǎn)生較大的影響[3]。因此，學(xué)者們?nèi)栽趯ふ夷軌蛟绨l(fā)現(xiàn)和早診斷的方法，其中微小RNA(miRNA)在腫瘤的早期診斷方面具有一定的臨床價(jià)值[4]，是一類非編碼的RNA，在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)人體的生理過程起到重要的調(diào)控作用，最新的研究證實(shí)miRNA具有癌基因和抑癌基因類似的作用，并且在腫瘤診斷方面具有一定的臨床價(jià)值[5]。本組通過檢測(cè)結(jié)腸癌患者血清miR-224-3p和miR-4669的表達(dá)，觀察其在結(jié)腸癌診斷和預(yù)后中的臨床意義，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年1月至2016年12月在我院確診結(jié)腸癌的患者116例，為結(jié)腸癌組。其中男75例，女41例；年齡46～79歲，平均年齡(61.38±9.64)歲，TNM分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期31例，Ⅲ期36例，Ⅳ期31例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性68例，陰性48例。選擇同期在我院行腸息肉治療的患者75例，為結(jié)腸息肉組，其中男45例，女30例；年齡42～79歲，平均年齡(62.27±10)歲；同期在我院行健康體檢者45例為健康對(duì)照組，男29例，女16例；年齡38～79歲，平均年齡(61.95±7.28)歲。3組年齡和性別比等基線資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：患者均知情同意，簽署知情同意書，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過；結(jié)腸癌組和結(jié)腸息肉組均行病理確認(rèn)。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：其他類型的腫瘤；血液系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)疾?。灰缽男圆罨蛘咧橇φ系K者；心肝腎等重要臟器功能不全者。

1.3 方法

1.3.1 血清標(biāo)本留取和指標(biāo)的檢測(cè)：患者入院時(shí)和手術(shù)后1周抽取肘靜脈血10 ml。血液標(biāo)本采用離心機(jī)將血液離心，離心半徑15 cm，離心速度3 000 r/min，離心15 min，抽取上清液放置在除酶管內(nèi)，放置在-70℃冰箱中。血清CEA水平采用酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測(cè)。

1.3.2 qRT-PCR:總RNA的提?。含F(xiàn)血清200 μl中加入1 000 μl的溶解試劑，靜置在室溫下15 min，并根據(jù)試劑盒說明書提取血清中的中RNA，并用DEPC溶解總RNA。通過試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)試劑盒One Step Prime Script miRNA cDNA Synthesis Kit，將PCR參數(shù)設(shè)定為：37℃ 60 min，85℃ 5 s。RT-PCR：根據(jù)使用說明書配制20 μl的RT-PCR反應(yīng)體系，并根據(jù)熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR的擴(kuò)增。PCR引物的合成，根據(jù)設(shè)計(jì)軟件primer express 3.0合成qPCR檢測(cè)引物探針。miR-224-3p的引物上游引物：5’-GGTCCAAATGGTGCCCTAGTG-3’；下游引物5’-GGTCCAAAATGGTGCCCTAGTGAC-3’；miR-4669上游引物：5’-ATGCCTCCCTTCACTTCCTG-3’；下游引物5’-TTATGCCCTCCTCCACTTCC-3’；U6的上游引物：5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’；下游引物5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。根據(jù)試劑盒說明書，設(shè)計(jì)反應(yīng)條件：95℃進(jìn)行15 min的預(yù)變性，循環(huán)參數(shù)設(shè)置為94℃變性15 min，在55℃退火30 s，并在72℃延伸30 s，總共反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，根據(jù)溶解曲線設(shè)置熒光信號(hào)采集穩(wěn)定75℃。以U6為內(nèi)參，結(jié)果以2-ΔΔCT來(lái)表示表達(dá)相對(duì)值，其中ΔΔCt=(CT實(shí)驗(yàn)組目的基因-CT實(shí)驗(yàn)組U6)-(CT對(duì)照組目的基因-CT對(duì)照組U6)。

1.4 觀察指標(biāo) 觀察3組血清miR-224-3p、miR-4669和CEA水平的變化，血清miR-224-3p和miR-4669表達(dá)，在診斷結(jié)腸癌，與臨床指標(biāo)的關(guān)系，及其在診斷3年內(nèi)出現(xiàn)死亡的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 3組血清miR-224-3p、miR-4669和CEA水平的變化 結(jié)腸癌組術(shù)前血清miR-224-3p和CEA水平高于結(jié)腸息肉組和健康對(duì)照組(P<0.01)，而結(jié)腸息肉組明顯高于健康對(duì)照組(P<0.01)，結(jié)腸癌患者手術(shù)后血清miR-224-3p和CEA水平較治療前明顯降低(P<0.01)；結(jié)腸癌組血清miR-4669水平明顯低于結(jié)腸息肉組和健康對(duì)照組(P<0.01)，結(jié)腸息肉組明顯低于健康對(duì)照組(P<0.01)，手術(shù)后結(jié)腸癌患者血清miR-4669水平較術(shù)前明顯提高(P<0.01)。見表1。

表1 3組血清miR-224-3p、miR-4669和CEA水平的變化

2.2 血清miR-224-3p和miR-4669表達(dá)在診斷結(jié)腸癌中的效能 血清miR-224-3p和miR-4669表達(dá)具有較高的靈敏度和特異性，其曲線面積(AUC)明顯高于CEA(P<0.05)，將miR-224-3p和miR-4669兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行二元回歸Logistics分析的方程1.72×XmiR-224-3p-2.36×XmiR-4669+2.98，聯(lián)合檢測(cè)(miR-224-3p+miR-4669)的靈敏度為94.8%，特異性為89.3%，其AUC為0.962，明顯高于單個(gè)指標(biāo)miR-224-3p(Z=3.889，P<0.01)和miR-4669(Z=2.264，P<0.05)，而miR-4669和miR-224-3p的AUC比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2，圖1。

表2 血清miR-224-3p和miR-4669表達(dá)在診斷結(jié)腸癌中的效能

圖1 血清miR-224-3p和miR-4669表達(dá)在診斷結(jié)腸癌中的效能

2.3 血清miR-224-3p和miR-4669表達(dá)與臨床指標(biāo)的關(guān)系 血清miR-224-3p和miR-4669表達(dá)水平與浸潤(rùn)深度、淋巴轉(zhuǎn)移、血管浸潤(rùn)、TNM分期和分化程度具有明顯相關(guān)性(P<0.01)，與年齡、性別、腫瘤部位和病理分型無(wú)明顯相關(guān)性(P<0.01)。見表3。

表3 血清miR-224-3p和miR-4669表達(dá)與臨床指標(biāo)的關(guān)系

2.4 血清miR-224-3p和miR-4669表達(dá)與3年內(nèi)出現(xiàn)死亡的相關(guān)性 結(jié)腸癌患者死亡組血清miR-224-3p表達(dá)水平明顯高于存活組(P<0.01)，血清miR-4669表達(dá)死亡組明顯低于存活組(P<0.01)。見表4。

表4 血清miR-224-3p和miR-4669表達(dá)與3年內(nèi)出現(xiàn)死亡的相關(guān)性

2.5 血清miR-224-3p和miR-4669表達(dá)在預(yù)測(cè)3年內(nèi)出現(xiàn)死亡的效能 血清miR-224-3p和miR-4669表達(dá)在診斷3年內(nèi)出現(xiàn)結(jié)腸癌死亡具有較高的靈敏度和特異性，兩指標(biāo)進(jìn)行二元方程回歸得方程1.72×XmiR-224-2.36×XmiR-4669+2.98，聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度為86.0%，特異性為90.4%，AUC為0.945明顯高于單個(gè)指標(biāo)miR-224-3p(Z=2.656，P<0.01)和miR-4669(Z=3.502，P<0.01)的AUC，而兩者miR-224-3p和miR-4669間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5，圖2。

圖2 血清miR-224-3p和miR-4669表達(dá)預(yù)測(cè)2年內(nèi)結(jié)腸癌患者出現(xiàn)死亡的靈敏度和特異性

表5 血清miR-224-3p和miR-4669表達(dá)在診斷結(jié)腸癌出現(xiàn)3年內(nèi)死亡的效能

3 討論

早期結(jié)腸癌手術(shù)后預(yù)后較好，晚期結(jié)腸癌預(yù)后較差，故結(jié)腸癌若能夠早期診斷和治療，能夠明顯提高患者的預(yù)后。現(xiàn)有診斷結(jié)腸癌的指標(biāo)主要有CEA，但其缺乏靈敏度和特異性，對(duì)早期診斷結(jié)腸癌的臨床意義有限[6]。miRNA是一類非編碼RNA，長(zhǎng)度一般18～26個(gè)核苷酸，在多種腫瘤中表達(dá)出現(xiàn)明顯的改變，并且證實(shí)參與了腫瘤增殖、遷移和轉(zhuǎn)移，并且參與了人體多種病理和生理過程[7]。近年來(lái)在結(jié)腸癌組織中發(fā)現(xiàn)多種miRNA表達(dá)出現(xiàn)異常，對(duì)結(jié)腸癌的早期診斷具有一定的臨床價(jià)值，但由于標(biāo)本組織獲取過程較為復(fù)雜，操作困難，患者的依從性較差等缺點(diǎn)，一定程度限制了在臨床的推廣運(yùn)用[8]。而外周血中的miRNA存在比較穩(wěn)定，在酸性或者堿性條件下均能穩(wěn)定存在，并且在惡性腫瘤病理學(xué)特征，臨床診斷和預(yù)后方面具有較高的臨床價(jià)值[9]。故miRNA被認(rèn)為是一種非常有前途的腫瘤標(biāo)記物，為腫瘤的早期診斷和預(yù)后的判定提高了新的思路。

本組研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌患者血清miR-224-3p表達(dá)水平明顯高于結(jié)腸息肉組和健康對(duì)照組，并且發(fā)現(xiàn)結(jié)腸息肉組明顯高于健康對(duì)照組，手術(shù)后患者血清miR-224-3p表達(dá)水平出現(xiàn)明顯下降，說明miR-224-3p參與了結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程，血清miR-224-3p表達(dá)與結(jié)腸癌具有明顯相關(guān)性?，F(xiàn)已知miR-224-3p多種惡性腫瘤如宮頸癌，乳腺癌和結(jié)腸腸癌均出現(xiàn)表達(dá)升高，并認(rèn)為參與了腫瘤的多種病理生理過程如腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥等[9]。本組研究還發(fā)現(xiàn)血清miR-224-3p表達(dá)水平與浸潤(rùn)深度、淋巴轉(zhuǎn)移、血管浸潤(rùn)、TNM分期和分化程度具有明顯相關(guān)性，說明血清miR-224-3p表達(dá)與腫瘤的惡性程度和分期具有明顯相關(guān)性。在3年的隨訪中發(fā)現(xiàn)存活組的血清miR-224-3p表達(dá)水平明顯低于死亡組，說明術(shù)前血清miR-224-3p表達(dá)水平的高低與術(shù)后3年死亡存在一定的聯(lián)系。本組研究還顯示在結(jié)腸癌患者中血清miR-4669表達(dá)明顯低于結(jié)腸息肉組和健康對(duì)照組，手術(shù)后結(jié)腸癌患者血miR-4669表達(dá)明顯高于術(shù)前，說明miR-4669表達(dá)是結(jié)腸癌的保護(hù)因子，并且與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展具有密切相關(guān)，相當(dāng)于抑癌基因的作用。miR-4669在結(jié)腸癌方面研究很少，在多個(gè)基因芯片的研究中發(fā)現(xiàn)血清miR-4669表達(dá)，可能成為診斷結(jié)腸癌和預(yù)后判斷的重要指標(biāo)[14-16]。本組研究還發(fā)現(xiàn)血清miR-4669表達(dá)與浸潤(rùn)深度、淋巴轉(zhuǎn)移、血管浸潤(rùn)、TNM分期和分化程度具有明顯相關(guān)性，并且發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌術(shù)后患者3年存活患者血清miR-4669表達(dá)水平明顯高于死亡患者，說明miR-4669是結(jié)腸癌存活的保護(hù)因子。

本組研究發(fā)現(xiàn)血清miR-224-3p和miR-4669表達(dá)在診斷結(jié)腸癌具有較高診斷效能，當(dāng)血清miR-224-3p水平>1.82時(shí)，其靈敏度為75.%，特異性為96.0%；而當(dāng)血清miR-4669表達(dá)水平≤2.50時(shí)，其靈敏度為94.8%，特異性為81.3%。傳統(tǒng)指標(biāo)CEA>14.9 ng/ml，其診斷結(jié)腸癌的靈敏度和特異性分別為62.1%和98.7%，故其靈敏度較差。同時(shí)血清miR-224-3p和miR-4669的AUC明顯高于CEA，說明兩者在診斷結(jié)腸癌的診斷效能明顯優(yōu)于CEA。將miR-224-3p和miR-4669兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行二元回歸發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測(cè)(miR-224-3p+miR-4669)的靈敏度為94.8%，特異性為89.3%，其AUC為0.962，明顯高于單個(gè)指標(biāo)miR-224-3p和miR-4669，而miR-4669和miR-224-3p的AUC比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明聯(lián)合檢測(cè)能夠明顯提高診斷結(jié)腸癌的診斷效能。在預(yù)測(cè)3年內(nèi)出現(xiàn)死亡的診斷效能方面，發(fā)現(xiàn)當(dāng)血清miR-224-3p表達(dá)水平>2.38時(shí)，其靈敏度為93.0%，特異性為68.5%，AUC為0.876，而當(dāng)血清miR-4669水平≤1.46時(shí)，其靈敏度為88.4%，特異性為71.2%，AUC為0.825；2組聯(lián)合檢測(cè)AUC為0.845，明顯高于miR-224-3p和miR-4669指標(biāo)，說明miR-224-3p和miR-4669聯(lián)合檢測(cè)能夠提高預(yù)測(cè)3年內(nèi)出現(xiàn)死亡的靈敏度和特異性。本組研究說明血清miR-224-3p和miR-4669在診斷結(jié)腸癌和預(yù)測(cè)3年內(nèi)出現(xiàn)死亡具有較高的靈敏度和特異性，優(yōu)于常規(guī)指標(biāo)CEA，2個(gè)指標(biāo)具有某種互補(bǔ)性，其具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

總之，miR-224-3p和miR-4669參與了結(jié)腸癌疾病的發(fā)生發(fā)展過程，在結(jié)腸癌診斷和預(yù)后判斷具有重要的臨床價(jià)值。