楊玉宇 阮巍山 徐莉 陳東鋒

炎癥性腸病為非特異性腸道疾病，其發(fā)病機制及發(fā)病原因均未明確，具有反復(fù)發(fā)作性、慢性遷延性特征，且并發(fā)癥較多，腸纖維化即為其中較為多見的一種并發(fā)癥[1]。腸纖維化發(fā)生機制為：基于易感基因，導(dǎo)致腸黏膜組織出現(xiàn)免疫失衡，并且與腸菌抗原產(chǎn)生相互作用，引起炎性細胞浸潤，并且釋放出大量生長因子及炎性因子，對腸道間質(zhì)細胞組織產(chǎn)生激活作用，形成大量膠原等細胞外間質(zhì)，于腸壁內(nèi)大量沉積，從而引起疾病[2,3]。腸壁纖維化需要經(jīng)過較長的過程，而于炎癥性腸病的發(fā)展進程中，其腸壁纖維化臨床機制尚未明確，多認(rèn)為是腸道間質(zhì)細胞組織、局部細胞因子、炎性細胞組織與慢性炎癥進行相互作用后引起[4,5]。TL1A為腫瘤壞死因子家族中的一個成員，于淋巴細胞組織、骨髓細胞組織中均有表達，能增加腸道趨化因子C-C家族趨化因子受體9(C-C chemokine receptor 9,CCR9)與受體CCR10，導(dǎo)致Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞組織數(shù)量增多，不僅會使輔助性T細胞1活性增加，而且持續(xù)高表達還可能對黏膜組織炎性反應(yīng)產(chǎn)生促進作用，并且引起腸壁纖維化[6,7]。為分析TL1A表達對炎癥性腸病相關(guān)腸纖維化的意義，本次以右旋葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)建立的炎癥性腸病相關(guān)腸纖維化小鼠模型為對象展開研究，以期為炎癥性腸病、腸纖維化臨床治療工作的展開提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 C57BL/6野生型小鼠，9～12周，平均(10.61±0.17)周；體重20～24 g，平均(22.50±0.19)g；清潔級，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，合格證編號：11400700208619；淋系細胞高表達TL1A轉(zhuǎn)基因型小鼠，8～12周，平均(10.57±0.20)周；體重19～25 g，平均(22.61±0.23)g；清潔級，種鼠為美國Cedars-Sinai醫(yī)學(xué)中心IBD 與免疫生物學(xué)研究中心提供，經(jīng)我方飼養(yǎng)及繁殖后進行篩選、鑒定。此次試驗嚴(yán)格參照《中華人民共和國實驗動物管理條例》中的規(guī)定流程展開，且符合倫理要求。

1.2 實驗儀器 凝膠成像分析儀購于江蘇金壇市宏華儀器(MmlIT IMAGE型)，光鏡顯微照相器購于日本株式會社尼康，組織切片機購于德國徠卡(HM-315型)，高速臺式離心機購于德國Hettich ENTRIFVGEN(UNIVERSAL-16R型)，脫色搖床購于江蘇麒麟醫(yī)用器械廠(TS-1型)，Image-Pro plus V.6.0 圖像分析軟件購于Media Cybernetics公司。

1.3 實驗試劑 右旋葡聚糖硫酸購于MP Biomedicals，乙二胺四乙酸購于華美生物工程公司，氫氧化鈉購于河南海韻環(huán)?？萍加邢薰?，三(羥甲基)氨基甲烷購于上?；瘜W(xué)試劑公司，脫氧核糖核苷三磷酸購于上海兆維科技發(fā)展有限公司，taq酶購于上海桑尼生物科技有限公司，瓊脂糖凝膠購于Spain Oxoid，碘伏購于天津永大試劑有限公司，磷酸緩沖鹽溶液購于南京森貝伽生物科技有限公司，4%多聚甲醛購于北京索萊寶科技有限公司，二甲苯購于武漢欣欣佳麗生物科技有限公司，梯度乙醇購于北京諾博萊德科技有限公司，酸性麗春紅品紅染色液購于百奧萊博，1%磷鉬酸購于北京雷根生物技術(shù)有限公司，2%苯胺藍購于上海榕柏生物技術(shù)有限公司，中性樹膠購于上海恪敏生物科技有限公司，天青石藍購于上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司，天狼星紅飽和苦昧酸染液購于北京吉美生物技術(shù)有限公司，枸櫞酸鹽緩沖液購于上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司，過氧化氫購于廣東恒健制藥有限公司，山羊血清封閉液購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，生物素化二抗工作液購于深圳欣博盛生物科技有限公司，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液購于武漢純度生物科技有限公司，二氨基聯(lián)苯胺購于蘇州亞科科技股份有限公司，1%鹽酸乙醇購于上海榕柏生物技術(shù)有限公司，1%氨水購于上海滬震實業(yè)有限公司。其他試劑為國產(chǎn)或者進口分析純。

1.4 方法

1.4.1 轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定方法:C56BL/6野生小鼠與基因型小鼠進行交配，于小鼠達到3周齡，取尾尖5 mm，放置于Eppendorf(EP)管內(nèi)，將500 mmol/L乙二胺四乙酸(pH值=8)及25 mmol/L氫氧化鈉混合液共150 μl 加入其中，予以95℃水浴，約30 min后，將40 mmol/L三(羥甲基)氨基甲烷(pH值=6)共150 μl加入其中，予以渦旋震蕩，5 min后行12 000 r/min×8 min離心，取上清液置入新EP管，予以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測，反應(yīng)體系：5×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液3 μl，2 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸1 μl，待測DNA 3 μl，10 mmol/L上游引物5’-GACTAACAAAGATGCCTGCCTGTGG-3’1 μl，10 mmol/L下游引物5’-GCCATCCTTCTGCTGTCTTGGAGA-3’1 μl，蒸餾水38 μl，taq酶0.5 μl。反應(yīng)條件：94℃ 3 min及45 s，56℃ 30 s，72℃ 45 s及4 min，4℃ 10 min，反應(yīng)時，2～4步重復(fù)進行24個循環(huán)。待反應(yīng)完成后，提取聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物5 μl 及16×上樣緩沖液1 μl，予以混合，以瓊脂糖凝膠(1.5%)電泳，再用凝膠成像分析儀進行鑒定，LCK-TL1A目的基因的位置是192 bp。

1.4.2 小鼠模型建立方法與分組方法:以右旋葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)建立炎癥性腸病相關(guān)腸纖維化小鼠模型，采取隨機法將C56BL/6野生小鼠及基因型小鼠隨機分作研究組與對照組，每組10只。對照組予以飲用蒸餾水，研究組予以間斷性飲用2%右旋葡聚糖硫酸鈉水，共4周。研究組右旋葡聚糖硫酸鈉水飲用時間為：d1～5，d8～12，d15～19，d22～26，其余時間均飲用蒸餾水。

1.4.3 小鼠取材:給予小鼠麻醉，首先碘伏消毒，將皮膚組織切開后進入至腹腔，對末端回腸進行迅速分離處理，至直腸止。以4℃磷酸緩沖鹽溶液將其沖洗3次后，取腸組織3 cm，用以提取細胞組織，再取腸組織5 mm，以4%多聚甲醛予以固定12～24 h后，進行石蠟包埋切片，并對腸系膜淋巴結(jié)組織、脾臟進行分離。

1.4.4 檢測方法:①以Masson(MT)染色與天狼猩紅染色法定量分析腸組織纖維化程度。AMT染色法。對包埋結(jié)腸組織連續(xù)切片，厚度控制4 μm，再予以染色：二甲苯脫蠟后，梯度乙醇持續(xù)脫蠟至水，以自來水進行1 min沖洗，蘇木精4 min后，水洗，酸性麗春紅品紅染色液10 min后，水洗，1%磷鉬酸3 min后，2%苯胺藍1 min，再0.2%冰醋酸片刻，并以梯度乙醇進行脫水，用二甲苯透明處理，中性樹膠進行封片。于光鏡鏡頭下對腸組織纖維化程度進行觀察，倍數(shù)選擇200×，再以Image-Pro plus V.6.0 圖像分析軟件展開定量分析。B天狼猩紅(Picrosirius Red )染色法。對包埋結(jié)腸組織連續(xù)切片，厚度控制4 μm，再予以染色：二甲苯脫蠟后，梯度乙醇持續(xù)脫蠟至水，以自來水進行1 min沖洗，天青石藍5 min后，以蒸餾水沖洗，予以天狼星紅飽和苦昧酸染液10 min，再用蒸餾水沖洗，并以梯度乙醇進行脫水，用二甲苯透明處理，中性樹膠進行封片。結(jié)果定量分析方法與MT染色同。②以免疫組織化學(xué)法對結(jié)腸組織內(nèi)Ⅰ、Ⅲ型膠原、TGF-β1及Smad3表達進行測定。對包埋結(jié)腸組織連續(xù)切片，厚度控制3 μm，再予以染色：二甲苯脫蠟后，梯度乙醇持續(xù)脫蠟至水，以蒸餾水進行1 min沖洗，用枸櫞酸鹽緩沖液進行高壓修復(fù)，過氧化氫15 min后，磷酸緩沖鹽溶液3次×3 min，山羊血清封閉液20 min后，予以一抗過夜，磷酸緩沖鹽溶液3次×3 min，生物素化二抗工作液，磷酸緩沖鹽溶液3次×3 min，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，磷酸緩沖鹽溶液3次×3 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精染色約5 min后，水洗，1%鹽酸乙醇持續(xù)2 s，自來水進行1 min沖洗，1%氨水持續(xù)30 s，自來水進行1 min沖洗，并以梯度乙醇進行脫水，用二甲苯透明處理，中性樹膠進行封片。于光鏡鏡頭下對腸組織中的陽性表達情況進行觀察，依據(jù)抗體指標(biāo)不同效價選擇相應(yīng)的稀釋比例，Ⅰ、Ⅲ型膠原稀釋比例均是1∶50，TGF-β1及Smad3均為1∶100。選擇磷酸緩沖鹽溶液替代一抗展開以上染色步驟，倍數(shù)選擇200×，再以Image-Pro plus V.6.0圖像分析軟件展開定量分析。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定結(jié)果 以LCK-CD2-TL1A-GFP引物序列對小鼠DNA進行測定，于192 bp處，野生小鼠無目的基因檢出，而轉(zhuǎn)基因小鼠則可見目的基因成像，以此可鑒定出轉(zhuǎn)基因小鼠。見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定結(jié)果圖

2.2 TL1A表達對炎癥性腸病小鼠結(jié)腸膠原的作用 健康結(jié)腸黏膜組織中有少量膠原蛋白沉積，予以MT染色后，呈現(xiàn)出輕微藍色；予以天狼猩紅染色后，呈現(xiàn)出紅色，且于纖維化進程中，黏膜組織及黏膜組織下層膠原蛋白的沉積量逐漸增加，染色程度、染色面積也隨之增加。通過軟件分析，其累積陽性光密度值表明，野生小鼠中，研究組結(jié)腸纖維化程度加重比對照組更高；轉(zhuǎn)基因小鼠中，研究組結(jié)腸纖維化程度加重同樣比對照組更高，且轉(zhuǎn)基因小鼠結(jié)腸纖維化程度比野生小鼠高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1，圖2。

表1 不同染色后小鼠結(jié)腸纖維化程度比較

2.3 小鼠結(jié)腸組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原表達 免疫組織化學(xué)染色后，發(fā)現(xiàn)胞漿呈現(xiàn)出棕色顆粒陽性表達，通過軟件分析，其累積陽性光密度值表明，野生小鼠中，研究組小鼠的Ⅰ、Ⅲ型膠原表達均比對照組高；轉(zhuǎn)基因小鼠中，研究組小鼠的Ⅰ、Ⅲ型膠原表達比對照組更高，且轉(zhuǎn)基因小鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原表達比野生小鼠高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3，表2。

表2 小鼠結(jié)腸組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原表達比較

2.4 小鼠結(jié)腸組織中TGF-β1及Smad3表達 通過Image-Pro plus V.6.0軟件分析，其累積陽性光密度值表明，野生小鼠中，研究組小鼠的TGF-β1及Smad3表達均比對照組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；轉(zhuǎn)基因小鼠中，研究組小鼠的TGF-β1及Smad3表達同樣比對照組更高(P<0.01)，且轉(zhuǎn)基因小鼠結(jié)腸組織中TGF-β1及Smad3表達比野生小鼠高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖4，表3。

表3 小鼠結(jié)腸組織中TGF-β1及Smad3表達比較

3 討論

腸道成纖維細胞在腸道纖維化進程中發(fā)揮重要作用，為其效應(yīng)細胞，腸道成纖維細胞效應(yīng)變化、活化過程中，TGF-β/Smads信號傳導(dǎo)均起著重要作用[8]。研究表明，腸道炎癥的發(fā)生以及進展中，Ⅰ、Ⅲ型膠原沉積以及TGF-β1表達均會上調(diào)，并且伴隨著Smad3表達上調(diào)[9]。炎癥性腸病的一種易感基因即為TL1A，TL1A及受體均會對腸黏膜T細胞組織增殖與活化產(chǎn)生影響，并對Th細胞極化進行誘導(dǎo)，促使腸黏膜免疫系統(tǒng)的耐受機制出現(xiàn)紊亂，引起炎癥性腸病[10]。腸纖維化出現(xiàn)的首要因素之一即慢性炎性反應(yīng)，且慢性炎性反應(yīng)還會對腸成纖維細胞組織活化產(chǎn)生激活作用，導(dǎo)致大量細胞外間質(zhì)形成，引起腸纖維化[11]。

Sebastian Zundler等[12]研究表明，炎癥性腸病患者腸黏膜免疫反應(yīng)存在失調(diào)問題，以炎性細胞浸潤為主要表現(xiàn)，不僅會釋放出炎性細胞因子，而且還會使結(jié)腸黏膜組織受損，從而導(dǎo)致腸道出現(xiàn)慢性炎癥。在炎性細胞因子受損因素作用下，炎癥性腸病患者腸道長時間維持修復(fù)與受損并存狀態(tài)中，易引起嚴(yán)重性并發(fā)癥，例如腸纖維化、腸梗阻以及腸道腸狹窄等，需及時進行專業(yè)治療，以促進疾病轉(zhuǎn)歸[13]。纖維化進程中的細胞外間質(zhì)即Ⅰ、Ⅲ型膠原，來源于成纖維細胞組織的合成，于腸道中大量分泌及沉積[14]。

本次實驗通過右旋葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)建立炎癥性腸病相關(guān)腸纖維化小鼠模型，并予以MT染色以及天狼猩紅染色，以評定炎癥性腸病相關(guān)腸纖維化小鼠腸道膠原纖維組織的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C56BL/6野生小鼠及轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)間斷性飲用2%右旋葡聚糖硫酸鈉水后，其結(jié)腸纖維化程度加重均比飲用蒸餾水的小鼠更高，并且轉(zhuǎn)基因小鼠結(jié)腸纖維化程度加重比野生小鼠高，同時免疫組織化學(xué)染色后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原表達比野生小鼠高，轉(zhuǎn)基因小鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原表達比野生小鼠高，表明炎癥性腸病相關(guān)腸纖維化小鼠結(jié)腸出現(xiàn)炎性改變，黏膜組織及其下層存在膠原蛋白成分沉積，導(dǎo)致膠原染色面積異常增加。不僅如此，轉(zhuǎn)基因小鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原沉積量還明顯高于野生小鼠，可見炎癥性腸病相關(guān)腸纖維化小鼠不僅存在結(jié)腸炎癥，而且還會有膠原合成量增加、過度沉積等情況出現(xiàn)。

TGF-β1為促纖維化因子之一，來源于T細胞組織、腸道上皮細胞組織、成纖維細胞組織的分泌及合成，且于上述細胞中均可表達，健康的結(jié)腸組織中，TGF-β1及Smad3表達較少，當(dāng)腸組織被破壞，則于腸道各層中均有表達，以免疫組織化學(xué)染色法進行檢測，可發(fā)現(xiàn)細胞膜組織以及細胞漿中均有棕色顆粒出現(xiàn)[15,16]。Jie等[17]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1于生理狀態(tài)中時無活性，若被活化，可表現(xiàn)出促進組織修復(fù)、對細胞分化進行調(diào)節(jié)、使腸道屏障加強、對細胞增殖進行抑制等功效。處于炎癥初期階段時，TGF-β1存在抗炎功效，隨著炎癥加重與進展，TGF-β1調(diào)節(jié)功能、分泌量均會出現(xiàn)變化，以促炎作用、促纖維化作用為主要表現(xiàn)[18,19]。TGF-β1促腸纖維化的途徑是介導(dǎo)Smads信號，已成為腸纖維化關(guān)鍵性因子之一[20]。本次實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠結(jié)腸組織中TGF-β1及Smad3表達比野生小鼠高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明炎癥性腸病相關(guān)長纖維化發(fā)生與腸道炎性癥狀發(fā)生呈現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系。

綜上所述，TL1A對腸成纖維細胞組織活化及增殖起著促進作用，通過促使Ⅰ、Ⅲ型膠原大量合成，使炎癥性腸病相關(guān)腸纖維化的程度加重，同時TL1A還能使炎癥性腸病相關(guān)腸纖維化進一步發(fā)展，TL1A表達對炎癥性腸病相關(guān)腸纖維化的作用機制之一即促進TGF-β1及Smad3表達上調(diào)。