趙 艷 程澤琦 羅來朋 龐久寅

（北華大學(xué)，吉林省吉林市 132013）

木聚糖具有抑菌性強(qiáng)、綠色無毒等特點(diǎn)［1-3］，是一種天然生物防腐劑，主要存在于自然界植物細(xì)胞的半纖維素中，占植物細(xì)胞干重的35%，是由木糖經(jīng)β-1,4糖苷件連接而成的高分子物質(zhì)。通過前期研究發(fā)現(xiàn)，納米木聚糖的粒徑較小，更容易滲入到木材孔隙中，抗流失性好，在木材中可以更好地分散和滲透，在常壓下浸泡木材就能獲得較好的防腐效果［4-6］。相比傳統(tǒng)木材防腐劑，其原料范圍廣，可從玉米芯、麩皮、甘蔗渣、玉米秸稈、花生殼、棉籽殼等農(nóng)林廢棄物提取獲得，無毒無害，并可自然降解，不會(huì)對(duì)人體及環(huán)境產(chǎn)生不利影響。目前，木聚糖主要應(yīng)用于制藥、污水處理、造紙助劑、熱塑性材料、食品添加劑等領(lǐng)域，在木質(zhì)材料防腐中的應(yīng)用還鮮有研究［7-8］。本文主要以彩絨革蓋菌和密粘褶菌為供試菌種，從呼吸作用、電導(dǎo)率、蛋白質(zhì)滲出率等方面入手，研究納米木聚糖對(duì)木腐菌生理生化機(jī)制的影響，探討其對(duì)木腐菌的抑菌效果，為開發(fā)新型高效木材天然生物防腐劑提供參考［9-13］。

1 材料與方法

1.1 材料

麥芽糖馬鈴薯培養(yǎng)基；考馬斯亮藍(lán)試劑盒，分析純，Solarbio；BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白（5 mg/mL），分析純，考馬斯亮藍(lán)試劑盒中配備；葡萄糖，食品級(jí)，汕頭市未來食品有限公司；乙醇、硫酸、氫氧化鈉，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；彩絨革蓋菌（Coriolus versicolor）、密粘褶菌（Gloeophyllum trabeum）,阿壩州分部研究所。

1.2 設(shè)備

TP200精密微差壓差計(jì)，北京昶信科技發(fā)展有限公司；BBS-V800超凈工作臺(tái)，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；電熱恒溫浴鍋，電動(dòng)攪拌器，ET-60恒溫孵育器，金壇市富華儀器有限公司；TG328A分析天平，上海天平儀器廠；高速離心機(jī)，立式蒸汽滅菌器，細(xì)菌培養(yǎng)箱，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；3173R電導(dǎo)率儀，南京海納儀器設(shè)備有限公司；LP-5118多功能酶標(biāo)分析儀，山東桑澤儀器儀表有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 木聚糖提取工藝

選擇干燥、無蟲蛀、無霉變的玉米芯，先用錘子敲碎成小塊，然后置于粉碎機(jī)中粉碎，過40 目篩，備用［8-9］。準(zhǔn)確稱取玉米芯 10 g，在電爐上煮沸，4 h后濾去多余水分后裝入三口瓶中，加入 250 mL 濃度為25%的NaOH溶液，94 ℃攪拌浸提 3 h，離心，取上清液、過濾，并向過濾液體中加入體積比為1∶3 的95%的乙醇，濾去液體，并利用高速離心機(jī)在8 000 r/min下離心10 min即可得到木聚糖粗制品［14-16］。

1.3.2 納米木聚糖提取工藝

將1 g木聚糖加入100 mL 的2% NaOH溶液，在60 ℃溫度下溶解，用稀酸調(diào)節(jié)pH值至5.5，加入3倍體積的乙醇進(jìn)行沉淀，抽慮后進(jìn)行冷凍干燥，制得納米木聚糖。

1.3.3 麥芽糖馬鈴薯培養(yǎng)基的配制

稱取100 g新鮮馬鈴薯，去皮，切成小塊，放在500 mL細(xì)口錐形瓶?jī)?nèi)，加水后煮沸。待煮沸30 min后，濾去土豆塊，加水補(bǔ)足至300 mL，并向其中加入6 g葡萄糖，即為麥芽糖馬鈴薯培養(yǎng)基。

1.3.4 納米木聚糖對(duì)木腐菌有氧呼吸試驗(yàn)

高濃度的氫氧化鈉溶液可以吸收木腐菌有氧呼吸所產(chǎn)生的CO2，通過精密微差壓差計(jì)測(cè)定系統(tǒng)中的氣壓變化來判斷木腐菌的呼吸量［17-18］。試驗(yàn)所用裝置如圖1所示。

圖1 木腐菌有氧呼吸測(cè)定裝置Fig.1 Device of respiration determination

在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行試驗(yàn)，首先取容量為100 mL的三口瓶，用無菌槍頭向其中加入20 mL含納米木聚糖的麥芽糖培養(yǎng)基，納米木聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、5%、10%。然后向錐形瓶?jī)?nèi)加入2 g菌絲，輕輕打散。將10% NaOH浸濕的紗布加塞在瓶口處，并在瓶塞傳感器的連接處和瓶塞與瓶身連接處均涂抹凡士林，以確保氣密性檢測(cè)無問題，將連接好的裝置從超凈工作臺(tái)中取出，放入28 ℃恒溫孵育箱中，在錐形瓶底部放置磁力攪拌器，開啟磁力攪拌器輕輕攪拌。每隔10 min，用精密微差壓差計(jì)記錄氣壓變化值，測(cè)定時(shí)長(zhǎng)為120 min。

1.3.5 納米木聚糖對(duì)木腐菌胞內(nèi)蛋白滲出量試驗(yàn)

考馬斯亮藍(lán)法是一種測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的方法。考馬斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，吸光值為488 nm，與蛋白質(zhì)結(jié)合后會(huì)變?yōu)榍嗌庵禐?95 nm。吸光值的大小與蛋白質(zhì)濃度成正比，具體濃度可通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算獲得［19-21］。

首先將5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白分別配制為0、20、40、60、80、100、160、200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。然后稱取2種木腐菌各1 g，并用1%、2%、5%、8%、10%不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的納米木聚糖20 mL處理24 h。

試驗(yàn)用96孔板進(jìn)行，每項(xiàng)做3個(gè)副孔。在分配并標(biāo)記好96孔板后，用移液槍取20 μL蒸餾水和180 μL考馬斯亮藍(lán)，加入到96孔板內(nèi)，記為對(duì)照空白孔。用移液槍分別取20 μL標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（0、20、40、60、80、100、160、200 μg/mL）和180 μL考馬斯亮藍(lán)，加入到96孔板內(nèi)，記為標(biāo)準(zhǔn)蛋白孔；用移液槍分別取20 μL不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)納米木聚糖處理過的木腐菌液和180 μL考馬斯亮藍(lán)，加入到96孔板內(nèi)，記為測(cè)定孔。

全部孔加完后，在室溫下靜置10 min后，用酶標(biāo)儀在595 nm下測(cè)定各個(gè)孔的吸光度，記錄并計(jì)算蛋白濃度。用標(biāo)準(zhǔn)蛋白孔的吸光值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以確定其余孔中的蛋白質(zhì)濃度，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

圖2 BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of BSA protein

1.3.6 納米木聚糖對(duì)木腐菌細(xì)胞通透性試驗(yàn)

通過測(cè)定溶液電導(dǎo)率的變化確定納米木聚糖對(duì)木腐菌細(xì)胞膜通透性的影響，電導(dǎo)率增加越快，細(xì)胞膜通透性越大［22-24］。

稱取彩絨革蓋菌和密粘褶菌菌絲各3 g，分別放入1%、5%、10%不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的納米木聚糖中，使用電導(dǎo)率儀測(cè)定其電導(dǎo)率變化，并用含同量吐溫-80的蒸餾水作為對(duì)照組。根據(jù)電導(dǎo)率變化判斷納米木聚糖對(duì)木腐菌菌絲細(xì)胞膜通透性的影響［25］。校正電導(dǎo)率=實(shí)際電導(dǎo)率-對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米木聚糖對(duì)木腐菌有氧呼吸的影響

根據(jù)木腐菌有氧呼吸程度，分析研究納米木聚糖對(duì)2種木腐菌新陳代謝的影響。浸有10% NaOH的紗布條可以吸收木腐菌呼出的CO2，從而使密閉裝置中的氣壓略為下降。通過精密微差壓差計(jì)觀測(cè)密閉裝置的氣壓變化，結(jié)果如圖3所示。

圖3 納米木聚糖對(duì)木腐菌有氧呼吸的影響Fig.3 Effects of nano-xylan on aerobic respiration of wood-rot fungi

從圖3中可以看出，納米木聚糖對(duì)白腐菌彩絨革蓋菌的有氧呼吸具有一定的抑制作用。隨著時(shí)間的增加，精密微差壓差計(jì)測(cè)得的值逐漸變小，并趨向于穩(wěn)定，說明彩絨革蓋菌的有氧呼吸越來越弱。隨著納米木聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，對(duì)彩絨革蓋菌的有氧呼吸抑制性越強(qiáng)，90 min時(shí)，彩絨革蓋菌的呼吸作用趨于穩(wěn)定。對(duì)于褐腐菌密粘褶菌的有氧呼吸抑制性則較弱，當(dāng)時(shí)間到達(dá)120 min時(shí)，密粘褶菌的氣壓仍處于下降趨勢(shì)，并未趨于平穩(wěn)，這說明密粘褶菌的有氧呼吸依舊在繼續(xù)。

試驗(yàn)表明，納米木聚糖對(duì)彩絨革蓋菌的有氧呼吸有抑制作用，隨著納米木聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)額提升，對(duì)彩絨革蓋菌的有氧呼吸抑制性越強(qiáng)。但納米木聚糖對(duì)密粘褶菌的有氧呼吸抑制性有限。

2.2 納米木聚糖對(duì)木腐菌胞內(nèi)蛋白滲出量的影響

從圖4可以看出，隨著納米木聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提升，白腐菌彩絨革蓋菌和褐腐菌密粘褶菌的蛋白滲出量均呈上升趨勢(shì)，納米木聚糖可以作用于木腐菌的細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜的通透性增加。但相較而言，彩絨革蓋菌的蛋白滲出量要多于密粘褶菌。

圖4 納米木聚糖對(duì)木腐菌蛋白滲出量的影響Fig.4 Effect of nano xylan on protein exudation of wood rot fungus

2.3 納米木聚糖對(duì)木腐菌細(xì)胞通透性的影響

由圖5可知，與對(duì)照樣相比，納米木聚糖能夠提升彩絨革蓋菌的菌絲電導(dǎo)率，且質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高電導(dǎo)率也越高，在10 min時(shí)基本趨于穩(wěn)定。這說明納米木聚糖可以增加彩絨革蓋菌的通透性。如圖6所示，與對(duì)照樣相比，納米木聚糖使密粘褶菌的電導(dǎo)率上升，并隨著納米木聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，密粘褶菌的電導(dǎo)率增加，總體上升幅度較小。這說明納米木聚糖可以增加密粘褶菌的通透性，但是效果有限。

圖5 納米木聚糖對(duì)彩絨革蓋菌電導(dǎo)率的影響Fig.5 The effect of nanoxylan on the cells conductivityof Coriolus versicolor

圖6 納米木聚糖對(duì)密粘褶菌電導(dǎo)率的影響Fig.6 The effect of nanoxylan on the cells conductivity of Gloeophyllum trabeum

3 結(jié)論

1）納米木聚糖對(duì)白腐菌彩絨革蓋菌的有氧呼吸有抑制作用，隨著納米木聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提升，對(duì)彩絨革蓋菌有氧呼吸抑制性就越強(qiáng)，在90 min時(shí)，彩絨革蓋菌的呼吸作用趨于穩(wěn)定。但納米木聚糖對(duì)褐腐菌密粘褶菌的有氧呼吸抑制性有限，在120 min時(shí)，其有氧呼吸依舊在繼續(xù)。

2）通過考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定發(fā)現(xiàn)，納米木聚糖處理可以增加木腐菌蛋白質(zhì)滲出率，彩絨革蓋菌的蛋白滲出率要大于密粘褶菌。

3）納米木聚糖處理木腐菌后，會(huì)增加木腐菌所在溶液的電導(dǎo)率，這說明納米木聚糖可以增大木腐菌細(xì)胞膜的通透率，使細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外泄。

4）納米木聚糖對(duì)白腐菌彩絨革蓋菌的抑制性要強(qiáng)于褐腐菌密粘褶菌。