楊雲(yún)雲(yún)，陳 鑫，陳啟洲，盧 芳，徐 晨，楊洪濤，蘇佩佩，劉曉龍

(1.宜春學(xué)院 生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西 宜春 336000；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，吉林 長(zhǎng)春 130033)

長(zhǎng)江中下游地區(qū)是我國(guó)重要的水稻主產(chǎn)區(qū)，近年來(lái)，由于氣候變暖導(dǎo)致的夏季極端高溫天氣時(shí)有發(fā)生，最高溫度超過(guò)35 ℃的天氣持續(xù)10～15 d。高溫脅迫已對(duì)當(dāng)?shù)氐乃旧a(chǎn)造成嚴(yán)重影響，并已成為制約當(dāng)?shù)厮痉N植業(yè)發(fā)展的主要限制因素之一。高溫脅迫會(huì)對(duì)不同生育時(shí)期的水稻生長(zhǎng)造成影響，在種子萌發(fā)期遭遇超過(guò)35 ℃的高溫脅迫會(huì)導(dǎo)致種子發(fā)芽遲緩、種子喪失活力、發(fā)芽率下降[1]。水稻在幼苗階段遭受高溫脅迫不僅會(huì)出現(xiàn)葉片卷曲，含水量降低，葉片顏色變淺、變白、變短和畸形等癥狀，還會(huì)致使植株生長(zhǎng)發(fā)育緩慢、抑制根系生長(zhǎng)[2-3]，光合作用受阻，凈光合速率和氣孔導(dǎo)度降低，光合作用原初反應(yīng)受到抑制[4-5]。水稻孕穗期遭遇高溫脅迫會(huì)導(dǎo)致穎花退化、花粉敗育、花粉活力下降，進(jìn)而導(dǎo)致秕粒增加[6-7]；在抽穗期和灌漿期遭受高溫脅迫會(huì)阻礙水稻的開(kāi)花授粉，穗中秕粒增多、結(jié)實(shí)率下降，造成千粒質(zhì)量降低，進(jìn)而導(dǎo)致水稻減產(chǎn)[8-11]。研究表明，水稻幼苗在堿脅迫環(huán)境下，根系活性氧大量積累，破壞了抗氧化防御系統(tǒng)，進(jìn)而損傷根系細(xì)胞，導(dǎo)致幼苗萎蔫和死亡[12]。高溫脅迫與堿脅迫類似，其抑制水稻生長(zhǎng)發(fā)育的一個(gè)重要因素就是引起ROS過(guò)量積累，破壞ROS產(chǎn)生和清除的平衡體系，導(dǎo)致膜質(zhì)過(guò)氧化作用加劇，進(jìn)而損壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)[3，13-14]。高溫脅迫抑制水稻種子萌發(fā)，但其導(dǎo)致發(fā)芽率下降的主要原因尚不明確，本研究擬以ROS積累為線索探究高溫脅迫抑制水稻種子萌發(fā)的機(jī)制。

脫落酸(ABA)是植物體內(nèi)的重要激素，常作為脅迫激素參與植物對(duì)多種逆境脅迫的響應(yīng)，并發(fā)揮重要作用[15]。產(chǎn)生誘抗效應(yīng)是ABA提高植物抗逆性的一個(gè)重要機(jī)制[16]。ABA對(duì)水稻耐鹽堿脅迫產(chǎn)生誘抗效應(yīng)，能夠提高水稻對(duì)堿脅迫的抗性和蘇打鹽堿水田中的產(chǎn)量[17-18]。ABA在提高植物耐高溫脅迫中同樣具有促進(jìn)作用，高溫處理可降低植物體內(nèi)IAA、GA、自由脯氨酸及可溶性蛋白質(zhì)的含量，增加脫落酸含量[19]。抽穗期噴施S-誘抗素或ABA溶液能夠提高水稻的結(jié)實(shí)率和千粒質(zhì)量，稻米的碾磨品質(zhì)和蒸煮品質(zhì)也得到改良[20]。研究表明，外源ABA能夠通過(guò)增加蔗糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和加速蔗糖代謝來(lái)保持碳平衡和能量平衡，進(jìn)而阻止花粉敗育[21]。以上研究結(jié)果為ABA提高水稻耐高溫特性的效果提供了堅(jiān)實(shí)的科學(xué)依據(jù)，但目前對(duì)于其內(nèi)在的生理機(jī)制及分子機(jī)理解析尚不明晰，尤其在ROS相關(guān)通路中的報(bào)道并不多見(jiàn)。研究表明，ABA預(yù)處理能夠提高堿脅迫下水稻幼苗的下游抗氧化防御能力，抑制ROS過(guò)量積累；且ABA緩解了外源二氯百草枯(Paraquat)對(duì)水稻幼苗引發(fā)的氧化脅迫，這是ABA誘導(dǎo)水稻耐堿脅迫的主要途徑之一[22]?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，本研究以高溫為主要非生物脅迫因子，探究ABA對(duì)水稻耐高溫脅迫的誘抗效應(yīng)，以ABA浸種的方式在水稻種子萌發(fā)期進(jìn)行研究，并以ROS積累為出發(fā)點(diǎn)初步解析高溫環(huán)境下ABA對(duì)水稻種子萌發(fā)的影響機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 供試材料

以江西省主推常規(guī)水稻品種黃華占和日本晴為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 ABA溶液的配制 脫落酸(ABA：Sigma，Inc.，St，Louis，MO，USA)試劑先溶于少量的無(wú)水乙醇中，然后用去離子水定容至一定的濃度。本試驗(yàn)用外源ABA浸種的方式探究ABA對(duì)水稻種子萌發(fā)的誘抗效應(yīng)，參照前人研究結(jié)果，選用10 μmol/L作為試驗(yàn)用ABA濃度[17-18，22]。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 萌發(fā)試驗(yàn)在培養(yǎng)皿中進(jìn)行，設(shè)置2個(gè)處理，即非ABA處理組(-ABA)和ABA處理組(+ABA)，每個(gè)處理5次重復(fù)。每個(gè)重復(fù)選取飽滿一致的50粒種子，ABA處理組用10 μmol/L的ABA溶液于黑暗條件下浸種24 h，非ABA處理組用去離子水于黑暗條件下浸種24 h。

1.3 各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定方法

1.3.1 相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量的測(cè)定 相對(duì)電導(dǎo)率(Relative conductivity，RC)常用來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞膜的損傷程度。用煮沸前和煮沸后的電導(dǎo)率(R1和R2分別表示煮沸前后溶液的電導(dǎo)率)來(lái)計(jì)算，公式為：RC(%)=R1/R2×100%。丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸顯色法測(cè)定，采用公式6.45×(A532-A600)-0.56×A450計(jì)算各樣品的MDA濃度，再根據(jù)樣品質(zhì)量計(jì)算MDA含量。

過(guò)氧化氫含量的測(cè)定：植物中的H2O2與硫酸鈦(或氯化鈦)反應(yīng)生成黃色的過(guò)氧化物-鈦復(fù)合物沉淀，在H2SO4中進(jìn)行溶解，在415 nm處有特征吸收峰，用分光光度計(jì)比色可測(cè)定H2O2含量[25]。

1.3.3 萌發(fā)相關(guān)基因的表達(dá)分析 利用TRIzol法提取水稻幼芽總RNA，并測(cè)定RNA濃度，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRaBioInc.，Otsu，Japan)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，形成cDNA。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Eco TM 48，Illumina，Saffron Walden，UK)上進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)(Quantitative real-time PCR)，總反應(yīng)體系為20 μL，包括：10 μL 2×SYBRPremixExTaqTM(TaKaRa Bio)，1.6 μL cDNA，0.8 μL引物和7.6 μL ddH2O。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。確定cDNA模板和引物沒(méi)有基因組DNA污染后，以穩(wěn)定表達(dá)的水稻看家基因β-actin作為內(nèi)參，進(jìn)行基因表達(dá)量的測(cè)定。每個(gè)處理設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)模板2次技術(shù)重復(fù)，利用2-ΔΔCT的方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[26]。

ROS清除相關(guān)基因包括：OsCATB、OsAPX6、OsFe-SOD和OsCu/Zn-SOD；細(xì)胞死亡相關(guān)基因包括：OsBI1和OsKOD1；ABA應(yīng)答基因有Salt和OsWsi18[12，22]，用于qRT-PCR的基因及相關(guān)引物(5′-3′)如下：

OsACT1(內(nèi)參，Os03g0718100)F：TTCCAGCCTT

CCTTCATA，R：AACGATGTTGCCATATAGAT；

OsBI1(Os02g0125300)F：CTACATCAAGCACGC

ACTC，R：ACCTCTTCTTCCTCTTCTTCTC；

OsKOD1(Os04g0507950)F：TCAAGCCATTCATC

TTCCAT，R：ATCAGCAACCTCGTCAAG；

Salt(Os01t0348900)F：CGAAATAATGTTCCATG

GTGTT，R：TGTACTACGGATCGGTGCAA；

OsWsi18(Os01g0705200)F：TGTGACTCGATCCA

GCGTAG，R：GTTCCTGCTGAGAAGCCATC；

OsCATB(Os06g0727200)F：GCTGGTGAGAGATACC

GGTCA，R：TCAACCCACCGCTGGAGA；

OsAPX6(Os12g0178100)F：CCCCAAGATCCCCA

TGATCTA，R：CCTCTGGCGGGCATTG；

OsFe-SOD(Os06g0143000)F：CGACGCCGAGGAAT

TTCTAG，R：AGGTGGTGTAAGTGTCTCTCATGC；

OsCu/Zn-SOD(Os06g0130900)F：TGTGACGGGA

CTTACTCCTGG，R：CACCCATTCGTAGTATCGCCA。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)繪圖應(yīng)用Origin 9.1繪圖軟件。利用SPSS 21.0(IBM Corp.，Armonk，NY)軟件，基于單因素方差分析(ANOVA)和Duncan方法進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性差異分析，顯著性差異水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 ABA浸種預(yù)處理對(duì)高溫脅迫下水稻種子萌發(fā)的影響

不同處理下，種子萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。非高溫處理下，ABA浸種與否對(duì)種子萌發(fā)無(wú)明顯影響。高溫脅迫抑制了日本晴和黃華占的種子萌發(fā)，導(dǎo)致芽長(zhǎng)和根長(zhǎng)縮短。而ABA浸種能夠促進(jìn)高溫脅迫下水稻種子的萌發(fā)和幼芽的生長(zhǎng)。

發(fā)芽率統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果表明(圖2)，ABA浸種在高溫脅迫初期促進(jìn)了水稻種子的萌發(fā)。非ABA浸種條件下，與CK-ABA相比，高溫處理使日本晴在第2天和第3天的發(fā)芽率分別提高了11.60，7.60百分點(diǎn)，使黃華占在第2天，第3天的發(fā)芽率分別提高了14.00，4.00百分點(diǎn)。ABA浸種條件下，與CK+ABA相比，高溫處理使日本晴在第2天，第3天的發(fā)芽率分別提高了7.60，9.20百分點(diǎn)，使黃華占在第2天，第3天的發(fā)芽率分別提高了14.40，6.80百分點(diǎn)。隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，不管ABA浸種與否，高溫脅迫均抑制了水稻種子的萌發(fā)。在萌發(fā)的第7天，高溫脅迫使ABA浸種和非ABA浸種的日本晴發(fā)芽率分別下降了12.00，22.80百分點(diǎn)，黃華占分別下降了10.40，20.00百分點(diǎn)。

對(duì)照條件下，ABA浸種的種子發(fā)芽率略低于非ABA浸種。而高溫脅迫下，ABA浸種對(duì)水稻種子的萌發(fā)起到了一定的促進(jìn)作用，且脅迫時(shí)間越長(zhǎng)，促進(jìn)作用越明顯。從萌發(fā)的第5 天開(kāi)始，高溫脅迫條件下，ABA浸種提高了2個(gè)水稻品種的發(fā)芽率；在萌發(fā)的第6天，ABA浸種使日本晴和黃華占的發(fā)芽率分別提高了4.40，6.80百分點(diǎn)；第7天，ABA浸種使日本晴和黃華占的發(fā)芽率分別提高7.60，8.00百分點(diǎn)。

ABA浸種促進(jìn)了水稻芽和根的生長(zhǎng)。試驗(yàn)結(jié)果表明(圖3)，對(duì)照條件下，ABA浸種對(duì)水稻幼芽和根的生長(zhǎng)略有促進(jìn)作用，ABA浸種顯著提高了黃華占的主根長(zhǎng)(P<0.05)。高溫脅迫下，ABA浸種顯著提高了水稻的芽長(zhǎng)和主根長(zhǎng)(P<0.05)，黃華占的芽長(zhǎng)增加更明顯。高溫脅迫下，ABA浸種使日本晴和黃華占的芽長(zhǎng)分別提高了21.96%，38.92%；主根長(zhǎng)分別提高了48.00%，63.82%。

2.2 ABA浸種對(duì)高溫脅迫下水稻幼芽ROS積累的影響

研究表明，外源ABA預(yù)處理顯著上調(diào)了多個(gè)ROS清除基因的表達(dá)，提升抗氧化酶活性，進(jìn)而抑制ROS過(guò)量積累來(lái)提高水稻幼苗的耐堿性。在這些ROS清除基因中上調(diào)幅度較大的有OsCATB、OsAPX6、OsFe-SOD、OsCu/Zn-SOD，分別為過(guò)氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)和超氧化物歧化酶(SOD)的主要調(diào)控基因[22]。本試驗(yàn)繼續(xù)分析高溫脅迫下ABA浸種對(duì)以上4個(gè)ROS清除基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明(圖5)，高溫脅迫下，ABA浸種顯著上調(diào)了4個(gè)ROS清除基因的表達(dá)(P<0.05)，且OsFe-SOD和OsCu/Zn-SOD的上調(diào)幅度更大，暗示著ABA浸種提高了抗氧化酶CAT、APX和SOD的活性以清除過(guò)多的ROS。

2.3 ABA浸種對(duì)高溫脅迫下水稻幼芽細(xì)胞死亡的影響

研究表明，逆境脅迫下ROS的過(guò)量積累是導(dǎo)致水稻細(xì)胞損傷和幼苗萎蔫的主要原因[12]，本試驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)高溫脅迫下水稻幼芽的細(xì)胞損傷狀況進(jìn)行測(cè)定。由圖6可知，高溫脅迫條件下，ABA浸種處理使幼芽中細(xì)胞死亡抑制基因OsBI1的表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)，而細(xì)胞死亡基因OsKOD1表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而降低了高溫脅迫導(dǎo)致的細(xì)胞過(guò)量死亡。高溫脅迫下，與非ABA浸種處理相比，ABA浸種使2個(gè)品種OsBI1的上調(diào)幅度分別為182.0%，156.0%，而細(xì)胞死亡基因OsKOD1則分別下調(diào)了33.5%，51.3%。

2.4 高溫脅迫下水稻種子萌發(fā)與幼芽生理指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.5 高溫脅迫下水稻幼芽ABA應(yīng)答基因表達(dá)量的變化

進(jìn)一步分析了2個(gè)ABA應(yīng)答基因的表達(dá)變化，結(jié)果如圖7所示。高溫脅迫下，ABA浸種處理下水稻幼芽?jī)?nèi)ABA應(yīng)答基因顯著(P<0.05)上調(diào)，說(shuō)明ABA浸種激活了水稻內(nèi)的ABA信號(hào)通路，使之在抵抗高溫脅迫中發(fā)揮作用。高溫脅迫下，與非ABA浸種處理相比，ABA浸種使日本晴和黃華占幼芽?jī)?nèi)Salt基因相對(duì)表達(dá)量分別提高了4.84，5.46倍(圖7-A)，OsWsi18分別提高了5.87，7.06倍(圖7-B)。

表1 高溫脅迫下非ABA浸種處理下水稻種子萌發(fā)進(jìn)程中各指標(biāo)的相關(guān)性分析Tab.1 Correlation analysis of various indexes in rice seed germination process of non-ABA soaking treatment under high temperature stress condition

表2 高溫脅迫下ABA浸種處理下水稻種子萌發(fā)進(jìn)程中各指標(biāo)的相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis of various indexes in rice seed germination process of ABA soaking treatment under high temperature stress condition

3 討論與結(jié)論

良好的種子萌發(fā)率是植物適應(yīng)環(huán)境的先決條件。一般來(lái)說(shuō)，水稻在種子萌發(fā)期對(duì)高溫脅迫具有較強(qiáng)的抵抗力，這是因?yàn)檎T導(dǎo)了種子中小熱激蛋白的表達(dá)，進(jìn)而能夠幫助種子抵御高溫；但超過(guò)35 ℃時(shí)水稻種子的萌發(fā)受阻，種子喪失活力，發(fā)芽率降低[27]。本研究結(jié)果表明，在萌發(fā)初期(前3 d)，水稻種子在30 ℃的環(huán)境和40 ℃的高溫環(huán)境下均能夠正常萌發(fā)，且高溫處理對(duì)種子萌發(fā)具有促進(jìn)作用，發(fā)芽率略高于對(duì)照處理，這可能是由于種子經(jīng)24 h浸泡后，含水量增加，能夠在短期內(nèi)抵抗高溫的緣故，這與前人研究結(jié)果基本一致[28]。在萌發(fā)初期，對(duì)照條件和高溫脅迫下，ABA浸種對(duì)種子萌發(fā)有抑制作用，2個(gè)品種的發(fā)芽率略低于非ABA浸種處理。隨著萌發(fā)進(jìn)程的推進(jìn)，不管ABA浸種與否，與對(duì)照相比，高溫脅迫均抑制了水稻種子的萌發(fā)；在萌發(fā)的第7 天，2個(gè)品種的發(fā)芽率在高溫處理下較對(duì)照均有不同程度的下降，且芽長(zhǎng)和主根長(zhǎng)顯著(P<0.05)低于對(duì)照處理，這與多數(shù)研究結(jié)果基本一致[29-31]。不管ABA浸種與否，在對(duì)照條件下，品種黃華占的芽長(zhǎng)和主根長(zhǎng)高于日本晴；且在高溫脅迫下的芽長(zhǎng)和主根長(zhǎng)的下降幅度以及幼芽?jī)?nèi)ROS積累和質(zhì)膜損傷程度均低于日本晴，說(shuō)明黃華占在種子萌發(fā)期對(duì)高溫的抗性略高于日本晴。

ABA不僅參與調(diào)控植物的多種生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程，且在植物應(yīng)對(duì)鹽、堿、低溫和高溫等非生物脅迫和多種生物脅迫中發(fā)揮重要作用[15，32]。ABA調(diào)控植物抗逆性的一種重要機(jī)制就是產(chǎn)生誘抗效應(yīng)，通過(guò)浸種和浸根等多種方式賦予植物抵抗逆境的潛在能力[18，22-33]。研究表明，水稻種子或幼苗經(jīng)ABA預(yù)處理后能夠提高鹽脅迫下幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育和最終產(chǎn)量[34-35]；水稻幼苗經(jīng)外源ABA浸根預(yù)處理后，能夠提高抗氧化清除能力，抑制ROS的過(guò)量積累，進(jìn)而提高對(duì)堿脅迫的抗性和蘇打鹽堿水田中的產(chǎn)量[17-18，22]。在高溫脅迫下，外源ABA能夠通過(guò)多種途徑緩解高溫脅迫對(duì)水稻的傷害，包括調(diào)控能量平衡、ROS積累和糖代謝等途徑，促進(jìn)水稻生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量形成[2，21，36]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，種子萌發(fā)初期，在對(duì)照和高溫處理下，外源ABA浸種較非ABA浸種在一定程度上抑制了種子的萌發(fā)。在長(zhǎng)期高溫脅迫下，外源ABA浸種加快了水稻種子的萌發(fā)速度，促進(jìn)了幼芽和幼根的生長(zhǎng)，緩解了長(zhǎng)期極端高溫脅迫對(duì)水稻種子幼芽生長(zhǎng)的抑制作用。對(duì)其內(nèi)在機(jī)制進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下，ABA浸種顯著(P<0.05)上調(diào)了ABA應(yīng)答基因Salt和OsWsi18的表達(dá)量，說(shuō)明ABA信號(hào)途徑被激活，進(jìn)一步提升了高溫脅迫下水稻幼芽抗氧化清除基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，降低ROS的含量，進(jìn)而緩解了水稻幼芽的質(zhì)膜損傷和細(xì)胞過(guò)量死亡，促進(jìn)幼芽的生長(zhǎng)。

綜上所述，本研究探究了高溫脅迫下ABA浸種對(duì)水稻種子萌發(fā)的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證了外源ABA對(duì)水稻抗逆性的誘抗效應(yīng)。水稻種子在萌發(fā)初期，高溫處理能夠短暫的促進(jìn)種子萌發(fā)；此后，高溫處理導(dǎo)致幼芽?jī)?nèi)ROS過(guò)量積累，并進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞損傷，進(jìn)而抑制了幼芽的生長(zhǎng)。種子在萌發(fā)前利用外源ABA浸種能夠起到提高抗氧化清除能力的作用，降低由極端高溫脅迫而引起的ROS過(guò)量積累，從而緩解細(xì)胞損傷，促進(jìn)高溫脅迫下水稻幼芽及幼根的生長(zhǎng)。