李曉梅，楊 峰，雍曉平，陳 琳 ，冉 科 ，冉茂林

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻高粱研究所，四川 德陽 618000；2.蔬菜種質(zhì)與品種改良四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610300；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，四川 成都 611130)

蘿卜為典型的異花授粉植物，自交衰退嚴(yán)重，其雜種優(yōu)勢(shì)明顯。利用細(xì)胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic male sterility，CMS)進(jìn)行雜交制種是當(dāng)前蘿卜雜種優(yōu)勢(shì)利用的主要途徑，具有雜種一代純度高、制種成本低、親本不易流失等優(yōu)點(diǎn)[1-2]。1968年，日本學(xué)者小倉(cāng)首次發(fā)現(xiàn)蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型Ogura CMS，后續(xù)又有UK-1、Kosena、NWB及DCGMS胞質(zhì)類型被發(fā)現(xiàn)[3-6]。2005年，韓國(guó)學(xué)者首次報(bào)道NWB CMS，與Ogura CMS相比該胞質(zhì)類型花藥上有約1/2無功能花粉，與來自多個(gè)國(guó)家的74份材料進(jìn)行測(cè)交均未發(fā)現(xiàn)其恢復(fù)材料[5]。2008年，韓國(guó)學(xué)者從烏茲別克斯坦引進(jìn)的蘿卜材料中發(fā)現(xiàn)DCGMS CMS，該胞質(zhì)類型花藥特征與NWB CMS相似，石蠟切片分析表明敗育發(fā)生在單核小孢子時(shí)期，藥室內(nèi)有未被染色的花粉粒，同時(shí)該胞質(zhì)可擴(kuò)增出NWB CMS特異分子條帶，推測(cè)2種胞質(zhì)可能為同一類型[6]。張麗等[7]研究表明，NWB CMS敗育發(fā)生在單核小孢子時(shí)期，主要表現(xiàn)為絨氈層輕度液泡化，藥室內(nèi)仍有未染色的花粉?？諝ぃM(jìn)一步驗(yàn)證NWB CMS與DCGMS CMS相似。Park等[8]通過線粒體基因組測(cè)序推測(cè)orf463為DCGMS CMS不育主控基因。隨后，Yamagishi等[9]發(fā)現(xiàn)orf463基因廣泛存在于黑蘿卜(普通蘿卜的一個(gè)變種)中，且同一黑蘿卜線粒體中DCGMS CMS線粒體結(jié)構(gòu)類型與已測(cè)序日本黑蘿卜線粒體結(jié)構(gòu)類型并存，只是不同材料2種類型的亞計(jì)量不同。Wang等[10]通過對(duì)NWB CMS線粒體基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，NWB CMS與日本黑蘿卜線粒體基因組序列與結(jié)構(gòu)完全一致，與DCGMS CMS僅存在結(jié)構(gòu)上的差異，是同分異構(gòu)型，以上兩項(xiàng)研究從分子與基因組水平證實(shí)NWB CMS與DCGMS CMS屬于同一不育胞質(zhì)類型。

有關(guān)NWB CMS及DCGMS CMS恢復(fù)材料及恢復(fù)基因遺傳研究的報(bào)道較少且比較復(fù)雜，Lee等[6]從一份來自俄羅斯的材料(R171)及一份未知來源的材料(R121)中找到DCGMS CMS恢復(fù)基因。Kim等[11]進(jìn)一步研究了R171與R121中DCGMS CMS恢復(fù)基因的遺傳規(guī)律，證實(shí)R171含2個(gè)以上基因，R121含1個(gè)基因。隨后，Cho、Lee等[12-13]分別利用蘿卜基因組與擬南芥的共線性，將Rfd1定位于擬南芥3號(hào)染色體，區(qū)間大小分別為220 kb及83 kb，但在區(qū)域內(nèi)未找到編碼PPR相關(guān)蛋白的基因，說明DCGMS CMS恢復(fù)基因可能不屬于編碼PPR相關(guān)蛋白的常見恢復(fù)基因類型。Yamagishi、Wang等[9-10]均證實(shí)DCGMS/NWB CMS恢復(fù)基因主要存在于黑蘿卜和歐洲蘿卜中，不同恢復(fù)材料，其遺傳規(guī)律不同，所含基因?qū)?shù)各異。

NWB CMS及其恢復(fù)基因相關(guān)研究主要集中在日韓，國(guó)內(nèi)有關(guān)研究極少，至今其不育主控基因orf463未被驗(yàn)證，恢復(fù)基因也未被克隆。NWB CMS胞質(zhì)相對(duì)于Ogura CMS恢復(fù)材料較少，更易篩選保持系，對(duì)蘿卜雜交品種選育具有重要意義。但恢復(fù)材料較少限制了不育機(jī)制及核質(zhì)互作機(jī)理的研究，同時(shí)導(dǎo)致育種者難以利用花粉敗育的NWB CMS蘿卜資源。本研究通過對(duì)不同核背景下NWB CMS敗育特征及不同材料恢復(fù)基因的遺傳規(guī)律分析，可為國(guó)內(nèi)研究者對(duì)該胞質(zhì)及其恢復(fù)基因的深入研究與育種應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料A1～A4為4個(gè)穩(wěn)定的蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，其中A1為Ogura CMS，A2～A4為以韓國(guó)世農(nóng)種苗世農(nóng)301為不育源經(jīng)過連續(xù)6代回交轉(zhuǎn)育而成的NWB CMS不育系(世農(nóng)301經(jīng)認(rèn)證為NWB CMS)；B1～B4為不育系相應(yīng)保持系；R1～R5為具有NWB CMS育性恢復(fù)功能的恢復(fù)系(表1)；遺傳規(guī)律分析所用F1、F2、BC1群體為A2與R1～R5創(chuàng)制獲得。所有材料于2019年11月4日種植于四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所德陽市大同試驗(yàn)基地，2020年4月進(jìn)行育性鑒定及各項(xiàng)試驗(yàn)。

表1 供試保持系及恢復(fù)系來源、類型及育性Tab.1 The origin，variety types and fertility of the maintainer and restorer lines used in the experiments

1.2 不同核背景NWB CMS不育系花器形態(tài)觀察

蘿卜盛花期觀察Ogura CMS(A1)與不同核背景下NWB CMS(A2～A4)花器形態(tài)，并拍照記錄。

1.3 石蠟切片

石蠟切片法觀察正?？捎牧螧1及4個(gè)細(xì)胞質(zhì)雄性不育系花粉粒的發(fā)育過程。選取不同大小花蕾，置于 FAA 固定液中(甲醛∶冰醋酸∶70% 酒精=5∶5∶90，體積比)，4 ℃過夜。參照張麗等[7]的方法對(duì)固定后花蕾進(jìn)行脫水→透明→石蠟包埋→切片，貼片后用甲苯胺藍(lán)進(jìn)行染色，最后于光學(xué)顯微鏡(Nikon Eclipse E100)下觀察并拍照。

1.4 電鏡掃描

取NWB CMS不育系A(chǔ)4花藥上無功能花粉與其相應(yīng)保持系B4花藥上正?；ǚ郏?.5%的戊二醛固定，參照衡雙平[14]的方法，對(duì)固定花粉進(jìn)行抽真空→緩沖液洗滌→鋨酸再固定→緩沖液洗滌→乙醇梯度脫水→臨界點(diǎn)干燥等一系列處理。隨后，將樣品用少量導(dǎo)電膠固定在樣品臺(tái)上，進(jìn)行樣品噴金，最后在塞維爾(谷歌)生物電鏡平臺(tái)用掃描電子顯微鏡(Hitachi SU8010)進(jìn)行照相。

1.5 群體構(gòu)建與遺傳規(guī)律分析

2018年4月利用NWB CMS材料A2分別與不同恢復(fù)材料雜交獲得F1材料，2019年4月F1材料自交獲得F2群體，同時(shí)以F1為父本回交獲得BC1群體，2020年4月對(duì)F2及BC1群體進(jìn)行育性鑒定，然后對(duì)育性調(diào)查結(jié)果進(jìn)行χ2檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同核背景NWB CMS不育系花器形態(tài)特征分析

如圖1所示，不同核背景NWB CMS不育系雄蕊特征不同。保持系來源揚(yáng)州圓白的不育系A(chǔ)2其花藥瘦小、干癟，花絲短縮，花藥上無肉眼可見花粉，雄蕊顯著低于柱頭與Ogura CMS不育系A(chǔ)1特征相似；保持系來源比梨甜的不育系A(chǔ)3花藥飽滿，花絲正常，但花藥上無可見花粉；保持系來源春不老的不育系A(chǔ)4花藥飽滿，花絲正常，花藥上有可見花粉，花粉量約為其保持系的1/3，花粉測(cè)交驗(yàn)證無活性。雖然3個(gè)不同核背景下的NWB CMS不育系開花后花器形態(tài)特征明顯不同，但三者也具有共同特征，即與正?？捎暌粯樱陂_花前用手捏花蕾均有黃色液體溢出，隨著花蕾變大，A2與A3溢出的黃色液體逐漸減少，直至消失，而Ogura CMS不育系不同大小花蕾手捏均溢出白色透明液體。

2.2 NWB CMS不育系花粉敗育過程

通過石蠟切片法觀察4個(gè)細(xì)胞質(zhì)雄性不育系花粉敗育過程發(fā)現(xiàn)，NWB CMS不育系敗育時(shí)期及敗育方式與Ogura CMS不育系明顯不同，但3個(gè)花器形態(tài)差異的NWB CMS不育系敗育開始時(shí)期一致(圖2)。花粉母細(xì)胞時(shí)期4個(gè)不育系花藥與可育對(duì)照花藥沒有差異(圖2-A-E)。Ogura CMS不育系A(chǔ)1花藥在四分體時(shí)期開始敗育，表現(xiàn)為絨氈層細(xì)胞膨大，液泡化，而NWB CMS不育系(A2～A4)花藥與正?？捎|(zhì)一樣(圖2-F-J)。在單核小孢子時(shí)期3個(gè)不同核背景的NWB CMS絨氈層細(xì)胞膨大明顯，開始液泡化，而Ogura CMS絨氈層液泡化加劇，嚴(yán)重?cái)D壓小孢子生存空間，小孢子開始降解，僅有少量殘留在藥室內(nèi)(圖2-K-O)。隨著花藥發(fā)育時(shí)期的推進(jìn)，正常胞質(zhì)絨氈層開始降解，釋放出可染色的成熟花粉粒。而Ogura CMS不育系的絨氈層與小孢子完全降解，形成空的藥室。3個(gè)不同核背景的NWB CMS不育系藥室差異明顯，花期花藥干癟無花粉的A2絨氈層徹底降解，藥室結(jié)構(gòu)皺縮變形，花粉粒內(nèi)含物降解，僅剩變形空殼緊緊擠在一起，呈條狀(導(dǎo)致無法散粉)；花期花藥飽滿無粉的A3藥室內(nèi)結(jié)構(gòu)正常，有極少量花粉?？諝じ街谒幨冶?；花期花藥飽滿有無功能花粉的A4藥室內(nèi)有大量未被染色的花粉?？諝?圖2-P-T)，三者花藥發(fā)育后期藥室石蠟切片細(xì)胞學(xué)結(jié)構(gòu)差異，很好地解釋了其花藥形態(tài)差異形成的原因。

對(duì)NWB CMS不育系A(chǔ)4及其保持系B4上的花粉粒進(jìn)行掃描電鏡分析發(fā)現(xiàn)，不育系上花粉粒外壁雕紋與保持系沒有差異，但其沿花粉粒3個(gè)萌發(fā)溝凹陷呈多面體，而保持系花粉粒飽滿(圖3)，這與Lee等[6]的研究結(jié)果相似，只是因材料差異花粉粒形狀明顯不同。

2.3 恢復(fù)基因遺傳規(guī)律分析

表2 F2、BC1群體育性表現(xiàn)Tab.2 The fertile performance of F2 and BC1 genetic groups

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)不同核背景的NWB CMS不育系花藥敗育表型存在差異，花藥呈干癟無可見花粉、飽滿無可見花粉、飽滿有可見花粉3種形態(tài)，這與Nahm、Lee等[5-6]研究結(jié)果有差異，但有關(guān)胡蘿卜胞質(zhì)不育的研究也發(fā)現(xiàn)同一胞質(zhì)類型存在不同敗育特征[15]。大部分研究發(fā)現(xiàn),植物不育系花藥的敗育與絨氈層細(xì)胞有關(guān)，絨氈層細(xì)胞的過度生長(zhǎng)與膨大及絨氈層細(xì)胞的提前解體均是導(dǎo)致不育的原因[16-19]。通過對(duì)3個(gè)不同花藥表型的NWB CMS不育系石蠟切片分析發(fā)現(xiàn)：3個(gè)不育系均在單核小孢子時(shí)期開始敗育，表現(xiàn)為絨氈層細(xì)胞開始膨大，液泡化，這與張麗等[7]的研究結(jié)果一致，但最后三者藥室內(nèi)花粉粒降解程度不同，導(dǎo)致花期表型差異。因此，通過形態(tài)觀察不能對(duì)不育胞質(zhì)類型進(jìn)行有效分類，需要利用細(xì)胞學(xué)、分子學(xué)或線粒體基因組學(xué)等方式進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。

Lee等[6]篩選到2份對(duì)DCGMS CMS具有恢復(fù)功能的材料，其中1份來自俄羅斯的材料含有純合顯性恢復(fù)基因，1份未知來源的材料含有雜合恢復(fù)基因。隨后諸多研究均證實(shí)NWB CMS具有多個(gè)恢復(fù)基因，且材料來源主要集中在黑蘿卜、歐洲蘿卜與野蘿卜中[9-11，20]。本研究在3份黑蘿卜與2份歐洲蘿卜材料中找到NWB CMS恢復(fù)基因，且基因?qū)?shù)因材料而異，與前人研究結(jié)果相似。至今僅獲得DCGMS CMS恢復(fù)基因Rfd1的精細(xì)定位，初步分析其不屬于編碼PPR結(jié)構(gòu)蛋白的基因，相關(guān)基因仍未被克隆。

蘿卜中存在大量Ogura CMS恢復(fù)基因，選育Ogura CMS不育系較困難[20]，而NWB CMS恢復(fù)基因在蘿卜中分布極少，因此，NWB CMS可提高蘿卜雜交品種選育效率，且極易配制出花粉敗育的F1雜交品種，可很好保護(hù)育種者的知識(shí)產(chǎn)權(quán)。但與此同時(shí)，現(xiàn)今市場(chǎng)上流通的NWB CMS雜交品種均不育，恢復(fù)材料的缺乏導(dǎo)致此類品種的優(yōu)良性狀難以利用，長(zhǎng)此以往將導(dǎo)致大量蘿卜種質(zhì)資源的丟失。后續(xù)應(yīng)加強(qiáng)NWB CMS不育及恢復(fù)機(jī)制、恢復(fù)基因定位與克隆等理論基礎(chǔ)的研究，對(duì)蘿卜乃至整個(gè)十字花科作物的育種應(yīng)用具有重要的意義。