喻錦莉，劉長(zhǎng)愛(ài)，符 霖，王 鑫，歐陽(yáng)解秀

(南昌大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西省分子生物學(xué)與基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330031)

可變剪接(Alternative splicing，AS)又稱為選擇性剪接，指單個(gè)mRNA前體(pre-mRNA)通過(guò)不同的剪接方式產(chǎn)生多個(gè)成熟的mRNA，是一種典型的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式[1-2]。在真核生物中，基因的AS過(guò)程有助于豐富蛋白質(zhì)的多樣性；另外，與宿主基因共轉(zhuǎn)錄內(nèi)含子miR400降低pri-miR400的加工效率和成熟miR400的表達(dá)[3]。基因的可變剪接在植物發(fā)育、生理代謝、環(huán)境脅迫及植物抗病中發(fā)揮重要作用[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子促進(jìn)miR528的產(chǎn)生，同時(shí)轉(zhuǎn)錄本中3′片段縮短可以對(duì)miR528產(chǎn)生正向調(diào)控，通過(guò)影響miR528基因的轉(zhuǎn)錄或miR528轉(zhuǎn)錄本的可變剪接，從而影響到水稻開(kāi)花[3]。高溫影響OsbZIP58的可變剪接，促進(jìn)了全長(zhǎng)OsbZIP58α蛋白形式轉(zhuǎn)變成截短的OsbZIP58β蛋白形式，來(lái)提高灌漿期間水稻耐熱性[6]。OsLG3b區(qū)域的6個(gè)SNPs導(dǎo)致其選擇性剪接，從而影響水稻籽粒的粒長(zhǎng)[7]。

熱激蛋白(Heat shock proteins，HSPs)是一類進(jìn)化上非常保守的蛋白，在真核和原核生物中廣泛存在，具有保護(hù)機(jī)體免受非生物脅迫的危害功能[8-9]。根據(jù)分子量、系統(tǒng)發(fā)育同源性和功能，HSPs通常被分為5個(gè)亞科，分別是小熱激蛋白(sHSPs)、HSP60、HSP70、HSP90和HSP100s家族[10]。其中，sHSPs是指蛋白分子量為15～42 ku的一類熱激蛋白，研究顯示sHSPs的表達(dá)受到高溫、鹽、干旱等多種逆境的影響來(lái)發(fā)揮生物學(xué)功能[11-12]。另外，sHSPs還可以作為在擬南芥中，過(guò)量表達(dá)AtHSP17.6A提升了擬南芥對(duì)鹽和干旱的耐受性[12]。過(guò)表達(dá)JrsHSP17.3提高轉(zhuǎn)基因核桃植株對(duì)鹽和耐熱耐寒的性能[13]。

水稻作為世界重要的糧食作物，其產(chǎn)量受到高溫、鹽、干旱等非生物脅迫的影響[9，14]。在水稻中鑒定到23個(gè)sHSPs，通過(guò)RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)大部分sHSPs的表達(dá)受到高溫脅迫的影響[15]。Sato等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在水稻中過(guò)量表達(dá)OsHSP17.7，有效提高植株對(duì)UV-B、干旱和熱脅迫的耐受性。OsHsp18.0過(guò)表達(dá)株系對(duì)細(xì)菌性條斑病的抗性增強(qiáng)，而抑制株系的抗性下降[17]。在大腸桿菌和畢赤酵母細(xì)胞中的異源表達(dá)OsHSP20增強(qiáng)了其對(duì)熱鹽脅迫的耐受性。組成性過(guò)表達(dá)OsHSP20的轉(zhuǎn)基因水稻植株在熱、鹽處理?xiàng)l件下根長(zhǎng)和發(fā)芽率高于對(duì)照植株[18]。目前，關(guān)于水稻中sHSPs的生物學(xué)功能報(bào)道較少。

在Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中發(fā)現(xiàn)sHSPs的另一個(gè)成員OsHSP40，通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該基因具有不同的可變剪接。前期研究發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)受到鹽脅迫的影響[9]，但是該基因生物學(xué)功能鮮有報(bào)道，有待于進(jìn)一步研究。本研究根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果設(shè)計(jì)特異性引物，以中花11為材料，利用RT-PCR和TA克隆技術(shù)對(duì)OsHSP40基因的不同剪接本進(jìn)行鑒定，以確定其存在的可變剪接體，為后續(xù)深入研究該基因在水稻生長(zhǎng)發(fā)育和逆境適應(yīng)過(guò)程中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)用的植株材料為粳稻中花11(ZH11)由江西省分子生物學(xué)與基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。超薄DNA產(chǎn)物純化試劑盒和DNA割膠回收試劑盒(TIANGEN)、金牌Mix(TSINGKE)、TransTaq HiFi DNA聚合酶(TRAN)。

1.2 試驗(yàn)菌株及載體

大腸埃希菌DH5α(上海唯地生物技術(shù)有限公司)、PMD18-T(TaKaRa)。

1.3 引物設(shè)計(jì)

在Phytozome網(wǎng)站(https：//phytozome.jgi.doe. gov/pz/portal.html)分別下載水稻OsHSP40可能存在的不同剪接體的參考序列，并編號(hào)為1～4號(hào)可變剪接體(表1)，根據(jù)這些可變剪接體的序列特征，設(shè)計(jì)特異的RT-PCR引物(表2)。

表1 水稻OsHSP40基因可能存在的4種可變剪接體Tab.1 Four putative splice variants of rice OsHSP40

1.4 樣品逆境處理

參考文獻(xiàn)[19-20]報(bào)道的試驗(yàn)方法：選取生長(zhǎng)21 d的ZH11幼苗進(jìn)行150 mmol/L鹽處理，處理后3，6，9 h進(jìn)行取樣，并迅速凍于液氮中后-80 ℃保存。選取生長(zhǎng)21 d的ZH11幼苗進(jìn)行42 ℃高溫處理，處理后2，4，6，8，12，24 h進(jìn)行取樣，并迅速凍于液氮中后-80 ℃保存。不同水稻組織樣品經(jīng)液氮研磨成粉末，采用TRIzol法提取水稻不同組織的總RNA。按照TIANGEN 的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TIANGEN)說(shuō)明書(shū)合成cDNA第一鏈[9]。

1.5 RT-PCR

以葉片或者其他組織的cDNA為模板，利用DNA聚合酶和表2中的特異性引物對(duì)OsHSP40基因的不同剪接本進(jìn)行擴(kuò)增。經(jīng)DNA割膠回收或者超薄回收獲得目的產(chǎn)物后，進(jìn)行TA克隆[21]。

1.6 TA克隆

根據(jù)試劑盒說(shuō)明將純化得到的目的片段與pMD8-T載體進(jìn)行連接，采用10 μL體系16 ℃連接30 min。連接體系包含5 μL目的片段、0.5 μL載體和4.5 μL Solution I。轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行抗性篩選，獲得陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

表2 引物信息Tab.2 Information of primers

2 結(jié)果與分析

2.1 OsHSP40基因可變剪接體及其RT-PCR特異引物位置

根據(jù)Phytozome(https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)網(wǎng)站數(shù)據(jù)，OsHSP40預(yù)測(cè)存在4種不同的剪接體，分別命名為OsHsp40.1、OsHsp40.2、OsHsp40.3和OsHsp40.4，不同可變剪接體如圖1-A所示。預(yù)測(cè)顯示，OsHSP40基因可變剪接體的CDS序列長(zhǎng)度分別是1 230，1 227，1 155，1 125 bp(表1)，1號(hào)可變剪接體比2號(hào)可變剪接體在第1個(gè)外顯子中多3個(gè)堿基(AGC)。3號(hào)可變剪接體是由于引物e所在位置成為外顯子，4號(hào)可變剪接體則是由于引物d所在位置轉(zhuǎn)變成為外顯子。根據(jù)OsHSP40基因不同可變剪接體的序列及結(jié)構(gòu)特征設(shè)計(jì)RT-PCR擴(kuò)增的特異性引物(圖1-A、表2)。

2.2 OsHSP40基因可變剪接體擴(kuò)增及克隆

利用野生型ZH11的cDNA為模板，采用特異性引物組合進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，首先，采用引物b/e組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)后具有清晰約100 bp大小的電泳條帶，說(shuō)明3號(hào)剪接體可能存在(圖1-B)；引物b/d組合擴(kuò)增后具有約150 bp的電泳條帶(圖1-C)，說(shuō)明剪接體4可能存在，將擴(kuò)增獲得的目的產(chǎn)物測(cè)序，進(jìn)一步驗(yàn)證了可變剪接體3和4的存在；最后利用引物a/c組合PCR擴(kuò)增后具有清晰的電泳條帶(圖1-D)，說(shuō)明OsHSP40基因的1、2和4號(hào)可變剪接體可能存在，由于OsHSP40可變剪接體1和2相差3個(gè)堿基(AGC)，故對(duì)引物a/c組合的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，對(duì)陽(yáng)性菌落進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，對(duì)測(cè)序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，測(cè)序獲得樣品中有12個(gè)單菌落克隆為1號(hào)可變剪接體，只有1個(gè)為2號(hào)可變剪接體，這一結(jié)果表明，OsHSP40基因的1號(hào)可變剪接體的表達(dá)量可能遠(yuǎn)高于2號(hào)可變剪接體。綜上，成功鑒定到OsHSP40的4種可變剪接體。

2.3 OsHSP40可變剪接體表達(dá)分析

為了研究OsHSP40的生物學(xué)功能，選取野生型水稻ZH11不同組織部位，包括根、莖和葉，利用RT-PCR對(duì)OsHSP40不同可變剪接體的表達(dá)模式進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)，OsHSP40(OsHsp40.1234)基因在ZH11根、莖和葉中均表達(dá)，呈組成型表達(dá)；OsHSP40可變剪接體4(OsHsp40.4)在所檢測(cè)的ZH11根、莖和葉中表達(dá)，在葉片中的表達(dá)量高于其在根和莖中的表達(dá)量(圖2)。這一結(jié)果表明，OsHSP40不同的可變剪接體表達(dá)模式可能存在差異。

2.4 高鹽條件下OsHSP40可變剪接體表達(dá)分析

前期研究發(fā)現(xiàn)，該基因的表達(dá)受到鹽脅迫的影響[9]，不同OsHSP40可變剪接體在高鹽脅迫過(guò)程中響應(yīng)是否存在差異，采用3周齡的ZH11幼苗進(jìn)行150 mmol/L鹽溶液處理，處理后3，6，9 h分別取地上和地下部分的組織進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖3)，在未處理時(shí)可變剪接體4(OsHsp40.4)在地上和地下部分中的表達(dá)量均顯著低于OsHSP40的表達(dá)，該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)OsHSP40基因存在可變剪接體4(OsHsp40.4)；高鹽處理后，在地上部分的組織中，可變剪接體4(OsHsp40.4)的表達(dá)量上升，處理9 h后最高，但上升幅度低于OsHsp40.1234。在地下部分的組織中，處理6 h后OsHsp40.1234的表達(dá)顯著升高達(dá)到峰值，9 h后下降；可變剪接體OsHsp40.4的表達(dá)則在處理3 h開(kāi)始上升，處理9 h后高于其他時(shí)期。這一表達(dá)結(jié)果顯示，OsHSP40基因及其可變剪接體的表達(dá)受到高鹽脅迫的誘導(dǎo)，高鹽條件下OsHsp40.4與OsHsp40.1234的表達(dá)方式存在一定的差異。

2.5 高溫條件下OsHSP40可變剪接體表達(dá)分析

熱激蛋白(HSPs)是指當(dāng)細(xì)胞或生物體遭受高于其正常生長(zhǎng)所需溫度8～12 ℃時(shí)，在幾小時(shí)、甚至幾分鐘內(nèi)會(huì)新合成一類蛋白質(zhì)。不同OsHSP40可變剪接體在高溫脅迫過(guò)程中響應(yīng)是否存在差異，采用3周齡的ZH11幼苗進(jìn)行42 ℃處理，處理后2，4，8，12 h分別取地上和地下部的組織進(jìn)行表達(dá)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在水稻幼苗地上組織中，OsHsp40.1234基因在處理后2 h表達(dá)變化不顯著，處理后4 h，其表達(dá)顯著上升，處理后的4～12 h表達(dá)量都顯著升高；而剪接體OsHsp40.4的表達(dá)則處理2 h后開(kāi)始上升，一直到處理后12 h達(dá)到最高。在地下組織中OsHsp40.4和OsHsp40.1234的表達(dá)在處理后2 h顯著上升，處理后8 h達(dá)到最高，處理后12 h表達(dá)上升幅度降低(圖4)。

3 結(jié)論與討論

基因的可變剪接在真核生物中廣泛存在，在植物發(fā)育、生理代謝、環(huán)境脅迫及植物抗病反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[4-5]。水稻FLO10功能缺失會(huì)影響線粒體nad1基因內(nèi)含子1的反式剪接，導(dǎo)致nad1外顯子1和外顯子2-5前體的積累，F(xiàn)LO10在維持線粒體功能和胚乳發(fā)育中起重要作用[22]。OsLG3b基因8外顯子上的堿基替換引起一個(gè)可變剪接，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄提前終止，進(jìn)而產(chǎn)生了一個(gè)C端截短了的蛋白質(zhì)，調(diào)控籽粒長(zhǎng)度增長(zhǎng)[7]。利用RT-PCR與TA克隆實(shí)驗(yàn)，成功的分離鑒定到OsHSP40基因的4種不同可變剪接體，在進(jìn)行TA克隆測(cè)序過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)1號(hào)可變剪接體轉(zhuǎn)錄水平可能高于2號(hào)可變剪接體。

植物熱激蛋白是高度保守的蛋白質(zhì)分子家族，起到分子伴侶、熱防御和穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)等功能。根據(jù)其表達(dá)的條件及作用可分為兩類：在脅迫條件下表達(dá)的應(yīng)激熱激蛋白；在生物體整體條件下存在表達(dá)，應(yīng)激時(shí)表達(dá)量增加的組成型熱激蛋白[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，OsHSP40在檢測(cè)的根、莖、葉中均表達(dá)，說(shuō)明該基因可能屬于組成型熱激蛋白。非生物脅迫下，植物的HSP基因具有時(shí)空調(diào)控作用，其表達(dá)受到各種非生物脅迫的影響[24]。試驗(yàn)顯示，OsHSP40在鹽脅迫和高溫脅迫條件下，表達(dá)量上升，說(shuō)明該基因的表達(dá)受到鹽和高溫脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)。根據(jù)分子量、系統(tǒng)發(fā)育同源性和功能，HSPs通常被分為5個(gè)亞科，分別是小熱激蛋白(sHSPs)、HSP60、HSP70、HSP90和HSP100s家族[10]。分析預(yù)測(cè)顯示，OsHSP40蛋白大小約40 ku，說(shuō)明其屬于sHSPs家族成員。

基因的可變剪接在植物發(fā)育及適應(yīng)脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，基因選擇性剪接在維持水稻礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)穩(wěn)態(tài)中起著重要作用[25]?；蚩勺兗艚佑兄谒颈３窒礖uHan2B抗旱性的遺傳改良[26]。水稻不同OsGATA轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，同時(shí)OsGATA基因剪接變異在不同環(huán)境條件下緊密調(diào)控[27]。OsGBF1存在多種可變剪接變體，這些剪接體在水稻中可能具有特異性的抗逆性功能[28]。在水稻幼苗地上組織中，OsHSP40基因在高溫處理后2 h表達(dá)變化不顯著，處理后4 h，其表達(dá)顯著上升；而剪接體OsHsp40.4的表達(dá)則處理2 h后開(kāi)始上升，一直到處理后 12 h達(dá)到最高。高鹽條件下OsHsp40.4與OsHsp40.1234的表達(dá)方式存在一定的差異。說(shuō)明OsHSP40基因的可變剪接體可能在高鹽和高溫脅迫過(guò)程中的發(fā)揮存在一定的差異。