王 瓊,陳文怡

(云南省文山州林業(yè)和草原資源監(jiān)測站,云南 文山 663000)

1 引言

蒜頭果是云南、廣西的特有樹種，種子富含油脂，是制作潤滑油的重要原料，木材經加工后可做家具、船舶，經濟價值較高。此外，作為一種高大、挺拔的常綠喬木，也常用作城市綠化，發(fā)揮生態(tài)效益。作為國家二級保護植物，由于生長環(huán)境遭到破壞、不合理的開采利用等，導致蒜頭果數(shù)量銳減、接近瀕危。除了采取建立自然保護區(qū)、嚴防濫砍濫伐等保護措施外，積極采種育苗、擴大種植面積也是一種可行性保護措施。其中，組織培養(yǎng)是繁育蒜頭果的一種常見方式，但是在組培過程中容易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，導致植體死亡、培養(yǎng)失敗。因此，探析蒜頭果組培褐化原因和控制措施，對蒜頭果的保護與繁育有重要的意義。

2 材料與方法

2.1 試驗用材

本次試驗所用蒜頭果外植體均來自于云南省文山州某苗圃繁育基地，苗高1.3～1.8 m，樹苗筆直、挺拔，外表無明顯表皮破損或其他機械損傷，無蟲蛀或病害等情況。

2.2 試驗方法

對外植體進行去葉處理，從葉柄部位剪斷，去除葉片。然后選擇當年春季發(fā)出的新梢，從中間部位截取15 cm。然后再將截取下來的新梢分成3段，分別是莖梢、幼嫩和半木質化3種類型。保證每種類型的枝條上均含有3～5個不等的飽滿腋芽[1]。將所有材料收集起來，使用清潔的水流動沖洗，持續(xù)45 min。選取一個較大的容器，加入適量洗潔精，按照1∶300比例兌水，把流水沖洗后的材料放入容器中，浸泡10min。浸泡期間每隔1 min進行一次搖晃，保證材料各處均得到清洗。將材料撈出后置于超凈臺上，平鋪開來，使用去離子水進行第二次沖洗，最后使用干凈濾紙覆蓋在材料表面，將水分吸干[2]。完成上述處理的每段材料，使用小刀斜向切開，一分為二，形成兩個大小相同的材料，放置到培養(yǎng)基中。最后得到30瓶含有接種莖段的試驗材料，將其置于(25±1)℃的恒溫環(huán)境下，每天提供光照2400～3200 lx，光照時間為8 h/d。按照此法連續(xù)培養(yǎng)1周，每天記錄一次外植體褐化情況[3]。其中：

褐化率=褐化株數(shù)/接種總數(shù)×100%；

獲得率=未污染未褐化株數(shù)/接種總數(shù)×100%。

2.3 正交試驗設計

首先，為了防止外植體裁切后出現(xiàn)感染進而干擾試驗結果的情況，需要做嚴格消除處理[4]。本次試驗中，根據(jù)外植體類型的不同，分別提供了3種消毒處理:①對于莖梢，選擇0.3%氯化汞浸泡，持續(xù)約5 min；②對于幼嫩，用2%的次氯酸鈉浸泡10 min；③對于半木質化，先使用75%酒精浸泡60 s后，替換為氯化汞與次氯酸鈉混合液處理6 min[5]。具體情況見表1。

表1 三種外植體的消毒處理方式

外植體的處理方式如上文所述，抗氧化劑也要根據(jù)外植體類型來選用，莖梢部分使用聚乙烯吡咯烷酮，用量按照5 g/L，幼嫩部分使用硫代硫酸鈉，用量按照500 mg/L，半木質化部分使用抗壞血酸，用量為160 mg/L[5]。莖梢和幼嫩的培養(yǎng)基要做高溫高壓殺菌處理，半木質化培養(yǎng)基僅做過濾除菌處理。3種類型的外植體對應的培養(yǎng)基分別是1/2WPM，1/2MS和1/2DKW。其成分為4.5 mg/L的6-芐基腺嘌呤，0.2 mg/L的萘乙酸，10 g/L的瓊脂，50 g/L的糖，以及3 g/L的活性炭[6]。培養(yǎng)基呈弱酸性。

3 結果與分析

3.1 正交試驗結果及其分析

正交試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果

結合表2可以發(fā)現(xiàn)，極差(R)的值從大到小排序依次是B>C>A>D，再結合“褐化率”一欄的數(shù)據(jù)，可知對蒜頭果外植體褐化影響最大的是外植體的類型，其次是試驗中所選抗氧化劑的類型，而培養(yǎng)基的類型影響最弱。4種影響因素的最優(yōu)組合為A3B3C1D1，即選用半木質化外植體，對其進行氯化汞+次氯酸鈉聯(lián)合消毒后，放置于加入了聚乙烯吡咯烷酮的1/2WPM培養(yǎng)基上，能夠將褐化率降到最低[7]。

在參考極差(R)排序的基礎上，結合“獲得率”一欄的數(shù)據(jù)，可知對蒜頭果無菌苗獲得率影響最大的仍然是外植體的類型，但是4種影響因素的最優(yōu)組合變成了A1B1C3D1，即選用莖梢作為外植體，使用0.3氯化汞材料進行消毒處理，然后將其放置于加入了抗壞血酸的1/2WPM培養(yǎng)基中，經過組織培養(yǎng)可以使蒜頭果無菌苗的獲得率最高[8]。

3.2 方差結果及其分析

蒜頭果褐化率、獲得率的方差分析結果見表3。

表3 褐化率、獲得率方差分析

結合表3可知，“褐化率”一項中，影響因素B的F值達到了50.8，明顯超出了其他3個影響因素，說明外植體的種類是對蒜頭果褐化率影響最大，這與上文的正交試驗結果具有一致性。除此之外，從差異性顯著分析結果來看，在“外植體類型(B)”一項中，不同類型外植體的褐化率也存在較大差距，莖梢(1)的褐化率最高，達到了79.6%，而半木質化(3)的褐化率僅有22.5%。在其他3個因素中，雖然采用不同的消毒方式、選擇不同的抗氧化劑，也會對褐化率產生影響，但是差異并不顯著。由此可知，選擇半木質化枝條能夠使蒜頭果的褐化率降低[9]。

4 討論

組織培養(yǎng)是植物繁育的一種常用方法，而褐化現(xiàn)象則是組培過程中較為常見的一種情況，是導致培養(yǎng)失敗的主要因素。現(xiàn)階段，抑制褐化的方式方法有多種，例如挑選外植體、加強消毒處理、使用生長調節(jié)劑，或者是在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑等[10]。在組織培養(yǎng)蒜頭果時，本文分別選取了外植體類型、消毒處理、抗氧化劑、培養(yǎng)基這4個影響因素進行了探究分析。試驗結果表明，外植體類型對蒜頭果褐化率影響最為明顯，以半木質化枝條作為外植體，使用氯化汞與次氯酸鈉混合液處理6min進行消毒，然后將其放置到加入了聚乙烯吡咯烷酮抗氧化劑的1/2WPM培養(yǎng)基上，可以使褐化率控制在最低水平。除此之外，試驗過程中光照、溫度等環(huán)節(jié)因素的影響，也會對蒜頭果褐化現(xiàn)象產生影響。在試驗過程中還要對試驗環(huán)境加以控制，盡量保證環(huán)境的一致性，消除無關變量影響，對保證試驗結果的可靠性有一定幫助。