呂炫 張淼 胡增金 李佳明 張沖 朱英奇 魏娟文 吳瓊 張瑞辰 夏倫志 王桂軍

摘要：?采用RT-PCR擴增獲得鵝星狀病毒（Goose astrovirus）的衣殼纖突蛋白基因vp27，并將其克隆至pCold-SUMO原核表達(dá)載體。重組表達(dá)載體pCold-vp27經(jīng)過測序和雙酶切驗證正確后，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞Rosetta。挑取陽性克隆子，利用異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)鵝星狀病毒衣殼纖突重組蛋白，使用鎳柱純化衣殼纖突蛋白VP27，將定量的重組蛋白免疫BALB/c小鼠。利用ELISA、Western blot和IFA鑒定鼠抗衣殼纖突蛋白VP27多克隆抗體。結(jié)果顯示，鼠抗衣殼纖突蛋白VP27多克隆抗體的效價大于1∶64 000，Western blot試驗結(jié)果證明了鼠抗衣殼纖突蛋白VP27多克隆抗體的特異性，IFA試驗結(jié)果證明鼠抗衣殼纖突蛋白VP27多克隆抗體能夠識別天然的鵝星狀病毒衣殼纖突蛋白VP27。

關(guān)鍵詞：?鵝星狀病毒;衣殼纖突蛋白VP27;多克隆抗體

中圖分類號：?S858.332.65+9.6??文獻標(biāo)識碼：?A??文章編號：?1000-4440（2021）02-0412-06

Abstract：?The vp27 gene of capsid spike protein of goose astrovirus was amplified by RT-PCR and cloned into prokaryotic expressional vector pCold-SUMO. The recombinant expressional vector pCold-vp27 was transformed into competent cell Rosetta after verified to be correct by sequencing and double enzyme digestion. The positive clones were selected， and the capsid spike recombinant protein of goose astrovirus was induced to express by isopropyl-β-D-thiogalactoside （IPTG）. The capsid spike protein VP27 was purified by nickel column and quantitative recombinant protein was used to immune BALB/c mice. The polyclonal antibody against capsid spike protein VP27 in mice was identified by ELISA， Western blot and IFA. The results showed that the titer of polyclonal antibody against capsid spike protein VP27 in mice was higher than 1∶64 000. The specificity of polyclonal antibody against capsid spike protein VP27 in mice was proved by the testing results of Western blot. Results of IFA test proved that the polyclonal antibody against capsid spike protein VP27 in mice could recognize natural goose astrovirus capsid spike protein VP27.

Key words：?goose astrovirus;capsid spike protein VP27;polyclonal antibody

星狀病毒（Astrovirus）是一種單股正鏈無囊膜的RNA病毒，可以感染哺乳動物和禽類。在哺乳動物中，星狀病毒通常感染人、豬[1]、狗[2]和牛[3]等，主要引起胃腸炎和腹瀉，在極個別條件下會引起腦炎[4]。在禽類動物中，星狀病毒感染主要發(fā)生在雞、鴨、鵝和火雞中，引起雞腎炎[5]、鴨致死性肝炎[6]、火雞腸炎[7]等臨床常見疾病。近年來，在安徽、江蘇、福建等省份流行一種由鵝星狀病毒（Goose astrovirs）感染引起雛鵝痛風(fēng)為主要特征的疾病[8]。鵝星狀病毒主要感染21日齡左右的雛鵝，死亡率可達(dá)30%，給養(yǎng)鵝產(chǎn)業(yè)帶來極大的經(jīng)濟損失。

目前鵝星狀病毒的檢測主要依賴于RT-PCR方法，沒有商品化的試劑盒[9]。衣殼纖突蛋白VP27作為存在于鵝星狀病毒表面的衣殼纖突蛋白，含有中和抗原表位，介導(dǎo)鵝星狀病毒粒子與細(xì)胞表面受體結(jié)合[10]。相關(guān)研究結(jié)果表明，衣殼纖突蛋白VP27是鵝星狀病毒主要的抗原決定蛋白[11]。本研究以本實驗室分離的鵝星狀病毒DY-19株為基礎(chǔ)，構(gòu)建鵝星狀病毒衣殼纖突蛋白VP27原核表達(dá)載體，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和親和層析柱純化方法獲得衣殼纖突蛋白VP27，免疫小鼠獲得多抗血清，利用制備的多克隆抗體對感染新型鵝星狀病毒的雞肝癌細(xì)胞（Chicken liver hepatocellular carcinoma cell line，LMH）進行間接免疫熒光（Indirect immunofluorescence assay，IFA）檢測，為鵝星狀病毒早期檢測方法的建立和應(yīng)用以及后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?材料

DH5α和Rosetta大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞采購于通用公司，Solution Ⅰ、限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ采購于寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，2×tap PCR Mix、質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒購自天根公司，胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自Gibco公司，HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）、異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的羊抗小鼠IgG購自Solarbio公司，異丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）購自biosharp公司，DMEM-F12培養(yǎng)基購自HyClone公司。LMH細(xì)胞系、pCold-SUMO載體、鵝星狀病毒DY-19株（GenBank：MT708902）由本實驗室分離和保存。BALB/c小鼠購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2?方法

1.2.1?衣殼纖突蛋白基因vp27的RT-PCR擴增?根據(jù)鵝星狀病毒DY-19株全基因序列（GenBank：MT708902），利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，擴增鵝星狀病毒衣殼纖突蛋白基因vp27，擴增的衣殼纖突蛋白基因vp27片段大小為723 bp。同時在上、下游引物5′端分別添加BamHⅠ和HindⅢ酶切位點。vp27基因的引物序列如表1所示。

1.2.2?重組質(zhì)粒pCold-vp27的構(gòu)建?將膠回收的衣殼纖突蛋白基因vp27目的片段和pCold-SUMO質(zhì)粒利用BamHⅠ和 HindⅢ限制性內(nèi)切酶分別進行雙酶切。反應(yīng)總體系50 μl，其中10×K buffer 5 μl， BamHⅠ 2 μl， HindⅢ 2 μl，利用無菌去離子水補足。于37 ℃水浴鍋酶切3 h，衣殼纖突蛋白基因vp27片段、pCold-SUMO質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物電泳后利用膠回收試劑盒分別進行回收。

將衣殼纖突蛋白基因vp27片段、pCold-SUMO質(zhì)粒的膠回收產(chǎn)物進行連接，反應(yīng)總體系10 μl：衣殼纖突蛋白基因vp27片段4 μl，pCold-SUMO質(zhì)粒膠回收產(chǎn)物1 μl，Solution Ⅰ 5 μl。于16 ℃條件下連接4 h。吸取連接產(chǎn)物10 μl轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞Rosetta。利用pCold-SUMO載體的氨芐抗性進行篩選。在氨芐瓊脂平板上挑取單個菌落進行PCR鑒定。對于PCR鑒定陽性的單個菌落搖菌提取質(zhì)粒，利用BamHⅠ和 HindⅢ限制性內(nèi)切酶進行雙酶切鑒定，同時將質(zhì)粒進行測序。鑒定正確后將重組質(zhì)粒命名為pCold-vp27。

1.2.3?重組衣殼纖突蛋白VP27的誘導(dǎo)表達(dá)和純化?將鑒定正確的重組質(zhì)粒pCold-vp27轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta，挑取陽性菌落，進行IPTG濃度優(yōu)化（終濃度0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L、2.0 mmol/L），16 ℃ 、120 r/min誘導(dǎo)24 h。收集菌體后，利用超聲波細(xì)胞粉碎機破碎細(xì)菌，細(xì)菌破碎后8 000 r/min 離心10 min，分別保存重組星狀病毒衣殼纖突蛋白上清液和沉淀。取星狀病毒重組衣殼纖突蛋白質(zhì)上清液和沉淀分別加入蛋白質(zhì)上樣緩沖液進行SDS-PAGE分析。

1.2.4?衣殼纖突蛋白VP27免疫及多克隆抗體制備?按照上述方法大量制備衣殼纖突蛋白VP27，以純化定量后的衣殼纖突蛋白VP27為抗原免疫6周齡BALB/c雌性小鼠。免疫程序如下：第1次免疫，100 μl衣殼纖突蛋白VP27（100 μg）和100 μl的等體積弗氏完全佐劑完全混合后，皮下注射;14 d后進行第2次免疫，100 μl衣殼纖突蛋白VP27（100 μg）和100 μl的等體積弗氏不完全佐劑完全混合，皮下注射;第1次免疫后28 d進行第3次免疫，免疫方法與第2次免疫相同。第3次免疫后7 d，腹腔注射衣殼纖突蛋白VP27加強免疫，1只100 μg。應(yīng)用ELISA方法測定其效價。

1.2.5?ELISA 檢測多克隆抗體的效價?用碳酸鹽緩沖液包被純化后的衣殼纖突蛋白VP27（10 μg/ml），將包被好的衣殼纖突蛋白VP27加入96孔板，1孔100 μl，4 ℃包被過夜。第2 d早晨，棄掉96孔板中的衣殼纖突蛋白VP27包被液，用配制好的PBST洗滌3次，每次5 min，在室溫條件下，用5%的脫脂奶粉溶液（50 g/L，PBST配制）封閉1 h，甩掉5%脫脂奶粉溶液，用PBST洗滌4次，在微量振蕩器上振蕩5 min，最后拍干確保孔內(nèi)無PBST殘留，然后用5%脫脂奶粉溶液稀釋免疫小鼠的血清樣品（1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000），8個稀釋度，每孔100 μl稀釋好的樣品，對照組為未經(jīng)免疫的小鼠血清，于37 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h，甩掉稀釋的血清樣品，用PBST洗滌4次，在微量振蕩器上振蕩5 min，最后拍干確?？變?nèi)無PBST殘留，然后將羊抗小鼠IgG-HRP按照1∶2 000進行稀釋（稀釋液為5%脫脂奶粉溶液），每孔加入100 μl，于37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h，甩掉孔內(nèi)液體，用PBST洗滌4次，在微量振蕩器上振蕩5 min，最后拍干確保孔內(nèi)無PBST殘留，在室溫條件下每孔加入100 μl TMB顯色液，避光反應(yīng)15 min，最后每孔加入100 μl硫酸溶液（2 mol/L）終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀檢測各孔樣品吸光值A(chǔ)450。

1.2.6?Western blot鑒定衣殼纖突蛋白VP27多克隆抗體?將利用IPTG誘導(dǎo)的pCold-SUMO空載體和純化濃縮后的衣殼纖突蛋白VP27經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)到PVDF膜上，50 g/L脫脂奶粉溶液（PBS配制）37 ℃培養(yǎng)箱封閉1 h，用配制的TBST洗滌3次，每次10 min，一抗為1∶200稀釋的鼠血清（PBS稀釋），于37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h，然后用配制的TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10 min;二抗為1∶2 000稀釋的帶HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（PBS稀釋），然后用配制的TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10 min，最后用DAB試劑盒顯色觀察。

1.2.7?IFA鑒定衣殼纖突蛋白VP27多克隆抗體?將處理好的LMH細(xì)胞均勻鋪到6孔板，待其密度達(dá)到80%以上，3孔接種鵝星狀病毒DY-19，剩余3孔為對照組，使用DMEM-F12培養(yǎng)基代替鵝星狀病毒。鵝星狀病毒感染LMH細(xì)胞72 h后，用移液槍棄掉維持液，然后沿著側(cè)壁加入PBS洗滌3次，每次5 min，每孔加入2 ml 5%脫脂奶粉溶液（PBS配制）封閉液，37 ℃培養(yǎng)箱封閉1 h，然后沿著側(cè)壁加入PBS洗滌3次，每次5 min。一抗為1∶200稀釋的制備的抗鵝星狀病毒衣殼纖突蛋白VP27多克隆抗體（PBS配制），37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h，然后沿著側(cè)壁加入PBS洗滌3次，每次5 min;二抗為1∶1 000稀釋的帶FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h，然后沿著側(cè)壁加入PBS洗滌3次，每次5 min，加入1 ml 1∶1 000稀釋的DAPI（PBS配制）溶液，37 ℃培養(yǎng)箱孵育10 min，然后沿著側(cè)壁加入PBS洗滌3次，每次5 min，最后加入600 μl PBS，置于熒光倒置顯微鏡下進行觀察。

2?結(jié)果

2.1?衣殼纖突蛋白基因vp27的RT-PCR擴增

以制備的鵝星狀病毒 DY-19的cDNA為模板，進行衣殼纖突蛋白基因vp27擴增。衣殼纖突蛋白基因vp27擴增目的條帶大小在723 bp左右，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）。

2.2?重組質(zhì)粒pCold-vp27鑒定

構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCold-vp27經(jīng)BamHⅠ和 Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶雙酶切，得到了723 bp的目的基因片段和4.7 kb的pCold-SUMO載體片段，與預(yù)期大小相符（圖2）。

2.3?衣殼纖突蛋白VP27的表達(dá)、鑒定和純化

將轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pCold-vp27的表達(dá)菌Rosetta培養(yǎng)至A600=0.6～0.8，用4個不同濃度（0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L、2.0 mmol/L）的IPTG誘導(dǎo)，16 ℃、120 r/min誘導(dǎo)表達(dá)24 h。SDS-PAGE結(jié)果顯示，在相對分子質(zhì)量約為43 000處出現(xiàn)特異性條帶（圖3），選擇終濃度1 mmol/L的IPTG進行蛋白質(zhì)表達(dá)。未經(jīng)誘導(dǎo)的pCold-vp27無目的條帶。可溶性分析結(jié)果表明衣殼纖突蛋白VP27在沉淀和上清液中均可表達(dá)。收集破碎離心后上清液利用親和層析法純化衣殼纖突蛋白VP27。

2.4?衣殼纖突蛋白VP27多克隆抗體的效價

第4次加強免疫后7 d，采集并分離小鼠血清，用ELISA方法檢測血清中衣殼纖突蛋白VP27多克隆抗體的效價。結(jié)果表明制備的鼠抗衣殼纖突蛋白VP27血清效價大于1∶64 000（圖4），衣殼纖突蛋白VP27經(jīng) 4 次免疫小鼠后誘導(dǎo)機體產(chǎn)生了抗衣殼纖突蛋白VP27特異性多克隆抗體。

2.5?衣殼纖突蛋白VP27多克隆抗體的Western blot法鑒定

以經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pCold-SUMO空載體和純化后的衣殼纖突蛋白VP27為抗原，免疫小鼠后獲得的血清為一抗，二抗為帶HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG。結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pCold-SUMO空載體組無明顯條帶，衣殼纖突蛋白VP27在相對分子質(zhì)量43 000處有一條明顯的條帶（圖5）。證明制備的衣殼纖突蛋白VP27多克隆抗體特異性良好。

2.6?衣殼纖突蛋白VP27多克隆抗體的IFA鑒定

將衣殼纖突蛋白VP27多克隆抗體應(yīng)用于病毒的 IFA 檢測，結(jié)果表明制備的衣殼纖突蛋白VP27多克隆抗體可以識別天然的衣殼纖突蛋白VP27，感染鵝星狀病毒的LMH細(xì)胞質(zhì)中檢測到明顯的熒光信號，未感染鵝星狀病毒的LMH細(xì)胞中未檢測到熒光信號（圖6）。表明制備的衣殼纖突蛋白VP27多克隆抗體可以應(yīng)用于病毒的IFA檢測。

3?討論

1975年，星狀病毒首次在嬰兒糞便中被發(fā)現(xiàn)，因其在透射電子顯微鏡下具有特征性的五角星結(jié)構(gòu)，故將其命名為星狀病毒[12]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)和病原檢測技術(shù)的發(fā)展，越來越多的星狀病毒在哺乳動物和鳥類動物中被發(fā)現(xiàn)[13-15]。導(dǎo)致動物腹瀉的主要病原體之一就是星狀病毒，同時星狀病毒還會感染機體的其他組織臟器，導(dǎo)致雛鴨致死性肝炎、雞腎炎和哺乳動物腦炎等[16]。鵝星狀病毒感染雛鵝，主要引起雛鵝的內(nèi)臟器官、腿部關(guān)節(jié)乃至腿部肌肉出現(xiàn)尿酸鹽沉積，給養(yǎng)鵝產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[17-18]。

目前，鵝星狀病毒的檢測方法主要是RT-PCR方法[19]，包括鵝星狀病毒SYBR Green I熒光定量檢測[20]和鵝星狀病毒TaqMan 熒光定量檢測[21]。RT-PCR方法主要采集發(fā)病或者病死雛鵝的部分組織器官，提取核酸進行檢測，不適合在臨床上進行大規(guī)模檢測。建立一種基于衣殼纖突蛋白VP27的ELISA檢測方法，應(yīng)用于臨床上大規(guī)模檢測尤為迫切。

衣殼纖突蛋白VP27為存在于鵝星狀病毒粒子表面的蛋白質(zhì)。相關(guān)研究結(jié)果表明，鵝星狀病毒衣殼纖突蛋白VP27是鵝星狀病毒的主要抗原決定蛋白，參加鵝星狀病毒粒子與細(xì)胞內(nèi)外受體的結(jié)合。因此，衣殼纖突蛋白VP27可以作為疾病檢測和疫苗研制的靶點[22]。本研究通過構(gòu)建pCold-vp27原核質(zhì)粒，利用大腸桿菌Rosetta表達(dá)系統(tǒng)，優(yōu)化蛋白質(zhì)表達(dá)條件（IPTG濃度），獲得高效表達(dá)的衣殼纖突蛋白VP27。將衣殼纖突蛋白VP27純化定量后與弗氏佐劑混合，免疫小鼠，經(jīng)Western blot 法檢測證明抗衣殼纖突蛋白VP27多克隆抗體血清的特異性良好，與對照組無特異性反應(yīng)。同時應(yīng)用間接ELISA方法檢測制備的鼠抗衣殼纖突蛋白VP27多克隆抗體效價大于1∶64 000。使用感染鵝星狀病毒DY-19的LMH 細(xì)胞對多克隆抗體使用IFA法進行鑒定，感染鵝星狀病毒的LMH細(xì)胞中有明顯的綠色熒光，而未感染鵝星狀病毒的LMH細(xì)胞無熒光，證明制備的抗體特異性非常好，可以特異性識別天然的衣殼纖突蛋白VP27。綜上所述，制備的鼠抗衣殼纖突蛋白VP27可以用于臨床鵝星狀病毒的檢測和實驗室中鵝星狀病毒特性研究以及致病機制研究。

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（責(zé)任編輯：張震林）