黃雪嬌，吳元輝，吳娟，遲原龍，何強(qiáng)，任堯

（1.四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川成都 610065）（2.瀘州源輝農(nóng)業(yè)有限公司，四川瀘州 646000）

桑葉是?？浦参锷５娜~子，是一種藥食同源的原料，其藥用價(jià)值在我國(guó)源遠(yuǎn)流長(zhǎng)[1]。桑葉中富含多種生物活性成分，如多酚、黃酮、多糖、γ-氨基丁酸和生物堿等[2]，具有抗氧化[3,4]、輔助降血糖[5,6]和降血脂[7]等功效。研究發(fā)現(xiàn)，桑葉中多酚、黃酮和多糖類物質(zhì)具有良好的抗氧化作用。桑葉多酚和黃酮具有較強(qiáng)的DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基清除能力，且與抗壞血酸較為接近[8,9]。而桑葉多糖抗氧化活性相對(duì)較弱，但其對(duì)多酚和黃酮物質(zhì)的抗氧化活性具有明顯增強(qiáng)作用[10]，三者是桑葉中起到抗氧化作用的主要物質(zhì)。我國(guó)桑葉資源豐富，在傳統(tǒng)蠶桑業(yè)中，桑葉主要用來(lái)飼養(yǎng)家蠶或作為畜禽、魚類的飼料，整體上用途單一，每年都有大量桑葉被廢棄。開發(fā)桑葉新用途，對(duì)提高經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益、拓寬桑葉資源利用方式都具有重要意義。桑葉提取物作為一種天然功能性原料，將桑葉通過(guò)水提或醇提后干燥而成，保留了桑葉中大量的生物活性成分，可添加到普通食品或保健食品中，具有良好的應(yīng)用前景[11]。

紫金蜜桑，又名臺(tái)灣長(zhǎng)果桑，其果實(shí)較長(zhǎng)、成熟期早，是一種通過(guò)大果桑和野生長(zhǎng)果桑授粉后改良而成的優(yōu)良品種，葉片較大。目前，針對(duì)紫金蜜桑的研究相對(duì)較少，且大多集中在桑樹的種植要求和栽培技術(shù)以及桑果的形態(tài)特征、營(yíng)養(yǎng)成分和產(chǎn)品加工上，而對(duì)于紫金蜜桑葉的相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道[12]。

桑葉提取物的制備采用超聲波輔助乙醇提取法，可高效提取桑葉中的抗氧化活性成分。但在提取過(guò)程中，由于料液比、乙醇濃度、提取溫度和提取時(shí)間的差異，桑葉提取物中活性成分含量及其抗氧化能力都會(huì)受到影響[13]。本文通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)研究紫金蜜桑葉活性成分的最佳提取工藝條件，進(jìn)一步對(duì)桑葉提取物的抗氧化能力進(jìn)行分析，為紫金蜜桑葉在食品領(lǐng)域的開發(fā)和應(yīng)用提供試驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料

桑葉產(chǎn)于四川瀘州，品種為紫金蜜桑，采摘于2020年7月，選取嫩度均勻、無(wú)污染、無(wú)病蟲害的桑葉供試。

1.2 主要試劑

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、Folin- Ciocalteu試劑，Sigma公司；沒(méi)食子酸、蘆丁，阿拉丁公司；無(wú)水乙醇、碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、葡萄糖、苯酚、硫酸、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、水楊酸、鄰苯三酚、Tris-HCl緩沖液、鹽酸等試劑均為分析純。

1.3 主要儀器

KQ-300VDE三頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UV-1800PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SCIENTZ-10N真空冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.4 方法

1.4.1 桑葉預(yù)處理

桑葉洗凈瀝水后去柄切條，烘干粉碎后過(guò)40目篩，得到干燥桑葉粉，備用。

1.4.2 提取方法

準(zhǔn)確稱取桑葉粉1.0 g，在一定乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取時(shí)間下進(jìn)行超聲波輔助乙醇提取。

1.4.3 桑葉提取物中活性成分含量測(cè)定

多酚測(cè)定參考T/AHFIA 005-2018《植物提取物及其制品中總多酚含量的測(cè)定 分光光度法》[14]；黃酮測(cè)定參考DB34/T 2743-2016《槐米及其制品中總黃酮含量的測(cè)定 分光光度法》[15]；多糖測(cè)定參考SN/T 4260-2015《出口植物源食品中粗多糖的測(cè)定 苯酚-硫酸法》[16]。

1.4.4 單因素試驗(yàn)

1.4.4.1 乙醇濃度對(duì)桑葉提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取桑葉粉1.0 g，料液比為1:30 g/mL，提取時(shí)間為60 min，提取溫度為40 ℃，乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%和90%，在此條件下提取，測(cè)定活性成分的含量。

1.4.4.2 料液比對(duì)桑葉提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取桑葉粉1.0 g，乙醇濃度為60%，提取時(shí)間為60 min，提取溫度為40 ℃，料液比分別為1:20、1:25、1:30、1:35、1:40和1:45，在此條件下提取，測(cè)定活性成分的含量。

1.4.4.3 提取溫度對(duì)桑葉提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取桑葉粉1 g，料液比為1:30，乙醇濃度為60%，提取時(shí)間為60 min，提取溫度分別為30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃和55 ℃，在此條件下提取，測(cè)定活性成分的含量。

1.4.4.4 提取時(shí)間對(duì)桑葉提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取桑葉粉1.0 g，料液比為1:30，乙醇濃度為60%，提取溫度為40 ℃，提取時(shí)間分別為30 min、40 min、50 min、60 min、70 min和80 min，在此條件下提取，測(cè)定活性成分的含量[17]。

1.4.5 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，在乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取時(shí)間4因素下分別設(shè)置3水平，以多酚、黃酮和多糖含量為考察指標(biāo)進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，確定最佳提取工藝條件。因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 The design for orthogonal test of four factors at three different levels

1.4.6 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證正交試驗(yàn)所得條件的合理性和正確性，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.4.7 桑葉提取物凍干粉的制備

將提取得到的桑葉提取液經(jīng)旋蒸后預(yù)凍，隨即放入真空冷凍干燥機(jī)中干燥48 h，取出粉碎過(guò)60目篩，得到桑葉提取物凍干粉。存于-20 ℃冰箱中，備用。

1.4.8 抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.4.8.1 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)

測(cè)定參考文獻(xiàn)（韋獻(xiàn)雅等，2014）所述方法[18]。

1.4.8.2 羥自由基清除實(shí)驗(yàn)

測(cè)定參考文獻(xiàn)（李冠楠等，2015）所述方法[19]。

1.4.8.3 超氧陰離子自由基清除實(shí)驗(yàn)

測(cè)定參考文獻(xiàn)（任堯，2011）所述方法[20]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組試驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。采用Origin 8.0、SPSS v23軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)桑葉提取效果的影響

不同乙醇濃度對(duì)桑葉中多酚、黃酮和多糖的提取結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，隨著乙醇濃度的增大，活性成分含量呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，多酚和多糖含量達(dá)到最大值，分別為12.03 mg/g和55.43 mg/g；乙醇濃度為70%時(shí)，黃酮含量呈最大值，為1.60 mg/g。當(dāng)乙醇濃度從60%到70%，多酚得率降低8.41%，黃酮得率提高2.56%，多糖得率降低13.42%，綜合考慮濃縮干燥的成本，選擇乙醇濃度為60%。

圖1 乙醇濃度對(duì)桑葉提取效果的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction of mulberry leaf

2.1.2 料液比對(duì)桑葉提取效果的影響

不同料液比對(duì)桑葉中多酚、黃酮和多糖的提取結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，隨著溶劑體積的增加，活性成分含量先上升后下降或基本趨于不變。當(dāng)料液比為1:30 g/mL時(shí)，多酚、黃酮和多糖含量都達(dá)到最大值，分別為10.96 mg/g、1.63 mg/g和49.02 mg/g，故選擇料液比為1:30 g/mL。

圖2 料液比對(duì)桑葉提取效果的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction of mulberry leaf

2.1.3 提取溫度對(duì)桑葉提取效果的影響

不同提取溫度對(duì)桑葉中多酚、黃酮和多糖的提取結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 提取溫度對(duì)桑葉提取效果的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction of mulberry leaf

由圖3可知，隨著提取溫度的提高，多酚含量持續(xù)上升；黃酮和多糖含量先上升后下降，在40 ℃時(shí)達(dá)到最大值，分別為1.67和51.18 mg/g?？紤]到溫度上升會(huì)破壞黃酮和多糖，故選擇提取溫度為40 ℃。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)桑葉提取效果的影響

不同提取時(shí)間對(duì)桑葉中多酚、黃酮和多糖的提取結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，多酚含量在提取時(shí)間為70 min時(shí)達(dá)到最大值，為11.36 mg/g；黃酮含量在30~60 min基本保持不變，當(dāng)時(shí)間大于60 min時(shí)，黃酮含量逐漸下降；隨著時(shí)間的增加，多糖含量先升高后降低，在60 min時(shí)達(dá)最大值，為60.75 mg/g。故選擇提取時(shí)間為60 min。

圖4 提取時(shí)間對(duì)桑葉提取效果的影響Fig.4 Effect of extraction time on the extraction of mulberry leaf

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，按照表1進(jìn)行L9(34）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表4。按照多指標(biāo)無(wú)空列重復(fù)試驗(yàn)的方差分析方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，方差分析結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal test

由表4、5可知，影響桑葉提取物中多酚含量的主次因素為B>C>A>D，料液比對(duì)多酚含量有極顯著影響，乙醇濃度和提取溫度有顯著影響，提取多酚的最佳工藝條件為A1B3C3D3；影響黃酮含量的主次因素為D>C>A>B，提取時(shí)間對(duì)黃酮含量有極顯著影響，乙醇濃度和提取溫度有顯著影響，提取黃酮的最佳工藝條件為A1B3C3D3；影響多糖含量的主次因素為A>C>B>D，乙醇濃度、料液比和提取溫度對(duì)多糖含量有極顯著影響，提取時(shí)間有顯著影響，提取多糖的最佳工藝條件為A2B2C3D3。綜上，從正交優(yōu)化試驗(yàn)可以得出紫金蜜桑葉超聲波輔助乙醇提取的最佳工藝條件為A2B3C3D3，即乙醇濃度60%、料液比1:35 g/mL、提取溫度45 ℃、提取時(shí)間70 min。

表4 桑葉提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of orthogonal test on extraction process of mulberry leaf

2.3 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

按最佳提取工藝條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。結(jié)果顯示桑葉提取物平均得率為20.49%，多酚、黃酮和多糖的平均含量分別為12.13 mg/g、1.79 mg/g和58.74 mg/g，3組試驗(yàn)數(shù)據(jù)相差較小，證明正交試驗(yàn)優(yōu)選得出的工藝條件可靠且穩(wěn)定。

王瑞嫻[21]研究15種桑葉的3種活性成分發(fā)現(xiàn)，多酚含量介于0.36 mg/g~4.26 mg/g之間，黃酮為14.39 mg/g~32.20 mg/g，多糖為10.40 mg/g~101.90 mg/g。紫金蜜桑葉在本試驗(yàn)優(yōu)化的最佳工藝下提取的多酚含量遠(yuǎn)高于15種桑葉的最大值，多糖含量比15種桑葉平均多糖含量高28.39%。而黃酮含量較低，這可能與桑葉的生長(zhǎng)季節(jié)有關(guān)，于小鳳[22]研究發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)桑葉黃酮的積累有較大影響，桑葉黃酮在5月份含量較高，6月份隨著氣溫升高開始下降，8月份含量最低；而本試驗(yàn)供試桑葉采自7月，此時(shí)桑葉黃酮含量下降至較低值。

2.4 抗氧化能力的測(cè)定

2.4.1 桑葉提取物對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

桑葉提取物對(duì)DPPH自由基清除能力見(jiàn)圖5。

圖5 桑葉提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.5 The DPPH scavenging ability of mulberry leaf extract

由圖5可知，桑葉提取物濃度在0~0.2 mg/mL范圍內(nèi)，其DPPH自由基清除能力隨濃度的增加而上升，具有明顯的量效關(guān)系。當(dāng)濃度為0.6 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到93.38%，同濃度抗壞血酸的DPPH自由基清除率為97.88%，兩者相當(dāng)相近。結(jié)果顯示，桑葉提取物對(duì)DPPH自由基清除率的IC50為0.06 mg/mL，具有很強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。

2.4.2 桑葉提取物對(duì)羥自由基清除能力的測(cè)定

桑葉提取物對(duì)羥自由基清除能力見(jiàn)圖6。

由圖6可知，桑葉提取物濃度在0~0.1 mg/mL范圍內(nèi)，其羥自由基清除能力隨濃度的增加而上升，具有明顯的量效關(guān)系。結(jié)果顯示，桑葉提取物對(duì)羥自由基的IC50為3.13 mg/mL，在較高濃度時(shí)具有一定羥自由基清除能力，但弱于抗壞血酸。

圖6 桑葉提取物對(duì)羥自由基的清除能力Fig.6 The ·OH scavenging ability of mulberry leaf extract

2.4.3 桑葉提取物對(duì)超氧陰離子清除能力的測(cè)定

桑葉提取物對(duì)超氧陰離子清除能力見(jiàn)圖7。

由圖7可知，桑葉提取物濃度在0~1.0 mg/mL范圍內(nèi)，其超氧陰離子清除能力隨濃度的增加而上升，具有明顯的量效關(guān)系。當(dāng)濃度為1.0 mg/mL時(shí)，桑葉提取物對(duì)超氧陰離子清除率達(dá)到55.56%，此后其清除能力上升速度減緩。結(jié)果顯示，桑葉提取物對(duì)超氧陰離子自由基的IC50為1.15 mg/mL，具有較高的超氧陰離子清除能力。

圖7 桑葉提取物對(duì)超氧陰離子的清除能力Fig.7 The superoxide anion free radical scavenging ability of mulberry leaf extract

紫金蜜桑葉提取物對(duì)DPPH自由基、羥自由基以及超氧陰離子自由基的半數(shù)清除率(IC50)分別為0.06 mg/mL、3.13 mg/mL和1.15 mg/mL，王吉成[23]等人發(fā)現(xiàn)，桑葉乙醇提取物對(duì)DPPH自由基清除率的IC50為4.69 mg/ml，而其對(duì)羥自由基的清除能力較低，在實(shí)驗(yàn)濃度為20 mg/mL時(shí)，清除能力只有達(dá)到20%左右，遠(yuǎn)低于本試驗(yàn)結(jié)果。紫金蜜桑葉提取物對(duì)DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除能力較強(qiáng)，清除率接近抗壞血酸，其中多酚、黃酮和多糖對(duì)DPPH自由基和超氧陰離子自由基都有一定的清除作用；而桑葉提取物對(duì)羥自由基的清除能力相對(duì)較弱。楊世園[24]等人研究發(fā)現(xiàn)，多酚和黃酮類物質(zhì)具有改變氧化態(tài)或烯醇式與酮式官能團(tuán)互變異構(gòu)的化學(xué)特性，是桑葉提取物中起到清除羥自由基作用的主要物質(zhì)，而多糖類物質(zhì)清除羥自由基的能力遠(yuǎn)比多酚和黃酮類物質(zhì)弱[25]。這可能是造成本研究中多糖含量較多、多酚和黃酮含量較少的桑葉提取物對(duì)羥自由基的清除能力較弱的重要因素。

3 結(jié)論

本文以紫金蜜桑葉為研究對(duì)象，采用超聲波輔助乙醇提取法提取桑葉抗氧化活性成分，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化得到最佳提取工藝條件為乙醇濃度60%、料液比1:35 g/mL、提取溫度45 ℃、提取時(shí)間70 min，此條件下，紫金蜜桑葉活性成分提取率高達(dá)20.49%。在最佳提取工藝條件上制得的桑葉提取物對(duì)DPPH自由基、羥自由基以及超氧陰離子自由基的半數(shù)清除率（IC50）分別為0.06 mg/mL、3.13 mg/mL和1.15 mg/mL。超聲波輔助乙醇提取制得的紫金蜜桑葉提取物含有豐富的多酚、黃酮和多糖類物質(zhì)，具有較強(qiáng)的抗氧化能力，在功能性食品領(lǐng)域有著非常好的應(yīng)用前景。