孫雙，張婷，方琰，胡莎莎，黃思琦，葉其然，蘭利瓊，卿人韋

（四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實驗室，四川成都 610065）

微藻是一類光自養(yǎng)生物，固碳效率高、生長周期短，在適當(dāng)?shù)臈l件下，細(xì)胞內(nèi)能夠高水平積累具有獨(dú)特價值的化合物，可供商業(yè)開發(fā)利用[1-3]。雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）隸屬于綠藻綱Chlorophyceae、團(tuán)藻目Volvocales，在高光、缺氮等脅迫條件下可以大量積累蝦青素，被認(rèn)為是理想的天然蝦青素生產(chǎn)者[4-8]。蝦青素（Astaxanthin）（3,3’-二羥基-β,β’-胡蘿卜素-4,4’-二酮）是一種類胡蘿卜素[9]，呈鮮紅色，作為一種新型的生物材料，具有極強(qiáng)的抗氧化活性，在提高免疫力、延緩衰老、預(yù)防腫瘤及心血管疾病等方面有積極的作用[10-12]。研究表明，雨生紅球藻在脅迫條件下大量積累蝦青素，然而脅迫條件并不利于藻的營養(yǎng)生長[13]。這種生物量增加和蝦青素積累不同步的矛盾制約著雨生紅球藻的規(guī)?；a(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。因此，現(xiàn)今工業(yè)上成功的生產(chǎn)模式都采用兩步培養(yǎng)法，即先進(jìn)行雨生紅球藻綠色營養(yǎng)細(xì)胞生長積累藻生物量，然后進(jìn)行脅迫培養(yǎng)積累蝦青素[14]。

雨生紅球藻綠色營養(yǎng)生長時期的生物量影響著蝦青素的總產(chǎn)量，培養(yǎng)基成分是影響雨生紅球藻生長的重要因子，也是影響雨生紅球藻培養(yǎng)及蝦青素工業(yè)化生產(chǎn)的要素[15]。柳科歡等人，比較研究了不同培養(yǎng)基對雨生紅球藻生物量的影響，但并沒有針對篩選出的培養(yǎng)基進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化，且她在培養(yǎng)過程中用了CO2通氣培養(yǎng)以提高生物量，但通氣培養(yǎng)需要高濃度CO2，且損耗較大，生產(chǎn)成本較高，在蝦青素的批量生產(chǎn)上不占優(yōu)勢[14]。為此本文從5種不同的培養(yǎng)基中篩選出最適于雨生紅球藻生長的培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上，選用醋酸鈉和碳酸氫鈉作為碳源，并對其進(jìn)行濃度的優(yōu)化，從而優(yōu)化出最有利于雨生紅球藻綠色細(xì)胞增殖的培養(yǎng)基，以提高生物量，旨在為雨生紅球藻大規(guī)模培養(yǎng)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

由于雨生紅球藻中蝦青素在脅迫條件下積累明顯，不同脅迫條件和脅迫程度對蝦青素的積累效果會有較大差別[16]。為此，本文在利用優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，采用單因素試驗，中心點(diǎn)復(fù)合設(shè)計（CCD）響應(yīng)面法以光照強(qiáng)度、初始pH和誘導(dǎo)時間為實驗因素，以雨生紅球藻在脅迫條件下蝦青素產(chǎn)量為響應(yīng)值，根據(jù)旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計原理，經(jīng)Design Expert軟件分析數(shù)據(jù)，采用三因素五水平的響應(yīng)面法進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化，得到最有利于蝦青素積累的脅迫條件，以期獲得雨生紅球藻的高蝦青素產(chǎn)量，為雨生紅球藻高效規(guī)模化生產(chǎn)提供理論和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）HP1是四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院藻類實驗室長期保存的藻株。

儀器：pH測試儀器：成都特思特儀器有限公司；滅菌鍋：上海申安立式壓力蒸汽滅菌鍋；TU-1810PC紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；光照強(qiáng)度測試儀：德國Testo 540照度計；25×16血球計數(shù)板；顯微鏡：重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；小型臺式離心機(jī)：Gene Company Limied基因有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 綠色生長階段基本培養(yǎng)基的篩選與碳源及其濃度的優(yōu)化

將接種好的培養(yǎng)液用保鮮袋密封，置于室內(nèi)培養(yǎng)架上培養(yǎng)，初始接種量為2.00×104個/mL，培養(yǎng)溫度為21±1 ℃，光照強(qiáng)度為30 μmol/m2·s，光照周期是12 h/12 h（光/暗），培養(yǎng)規(guī)模在250 mL三角瓶中盛裝100 mL培養(yǎng)基。每天定時充分搖動三角瓶5次，每次搖動時隨機(jī)調(diào)換三角瓶位置，盡可能使處理組的光照一致。每個試驗做3瓶平行對照，每瓶每次取2個樣測定參數(shù)。

1.2.1.1 基本培養(yǎng)基篩選選用五種培養(yǎng)基（BBM、OHM、改良MCM、配方A、BG11）

對本實驗室來源的雨生紅球藻HP1進(jìn)行培養(yǎng)，通過比較雨生紅球藻HP1在不同培養(yǎng)基中的細(xì)胞數(shù)，確定不同培養(yǎng)基對雨生紅球藻綠色細(xì)胞生長的影響，篩選出最適于HP1生長的培養(yǎng)基。用細(xì)胞密度血球計數(shù)板法對上述所有培養(yǎng)條件下的雨生紅球藻進(jìn)行計數(shù)：每隔24 h分別取1mL藻液于顯微鏡下計數(shù)，每個樣品計數(shù)三次，取平均值。

1.2.1.2 碳源濃度的優(yōu)化

本研究在篩選出最優(yōu)基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，向培養(yǎng)基中補(bǔ)充濃度分別為（0.1 g/L、0.3 g/L、0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L）的有機(jī)碳源（NaAc）或無機(jī)碳源（NaHCO3），其他營養(yǎng)元素的用量和配比保持不變，研究碳源濃度對雨生紅球藻生長的影響。

1.2.2 蝦青素積累階段脅迫條件研究

1.2.2.1 蝦青素誘導(dǎo)單因素實驗

（1）藻的處理：當(dāng)藻細(xì)胞在上述正常培養(yǎng)條件下生長到對數(shù)生長期，離心（4000 r/min，10 min）收集藻液，用少量OHM培養(yǎng)液重懸藻體，將懸浮液分別轉(zhuǎn)移至脅迫培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，將脅迫培養(yǎng)體系設(shè)置為有機(jī)碳源培養(yǎng)基和無機(jī)碳源培養(yǎng)基2種形式，每個處理設(shè)3個重復(fù)。

（2）光照強(qiáng)度：采用（1）項下方法，考察光照強(qiáng)度對雨生紅球藻蝦青素產(chǎn)量的影響。分別在光照周期12 h/12 h（光/暗）、初始pH=7、誘導(dǎo)時間8 d，設(shè)置光照強(qiáng)度為75 μmol/m2·s、110 μmol/m2·s、145μmol/m2·s、180 μmol/m2·s、215 μmol/m2·s共5個梯度，來分析其最適光強(qiáng)。

（3）初始pH：采用a項下方法，考察初始pH對雨生紅球藻蝦青素產(chǎn)量的影響。分別在光照周期12 h/12 h（光/暗）、光照強(qiáng)度為145 μmol/m2·s、誘導(dǎo)時間8 d，設(shè)置初始pH為5、6、7、8、9、10共6個梯度，來分析其最適初始pH。

（4）誘導(dǎo)時間：采用a項下方法，考察誘導(dǎo)時間對雨生紅球藻蝦青素產(chǎn)量的影響。分別在光照周期12 h/12 h（光/暗）、初始pH=7、光照強(qiáng)度為145 μmol/m2·s，設(shè)置誘導(dǎo)時間為6、7、8、9、10、11、12 d，共7個處理，來分析其最適誘導(dǎo)時間。

1.2.2.2 響應(yīng)面實驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取光照強(qiáng)度、初始pH和誘導(dǎo)時間三個因素作為響應(yīng)變量，以雨生紅球藻在脅迫條件下蝦青素產(chǎn)量為響應(yīng)值，考察各因素間的交互作用對雨生紅球藻蝦青素積累的影響[17-21]。利用Design Expert軟件按照旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計（CCD）原理，通過響應(yīng)面曲面分析進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化，得到最有利于蝦青素積累的脅迫條件。試驗設(shè)計因素與水平如表1所示。共20個實驗點(diǎn)，其中14個為析因點(diǎn)，6個為零點(diǎn)。零點(diǎn)實驗進(jìn)行6次，做誤差估計。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.2.2.3 蝦青素含量測定

配制5%氫氧化鈉：準(zhǔn)確稱取0.25 g NaOH加入雙蒸水4.75 mL。取藻液5 mL，經(jīng)3900 r/min離心15 min，收集沉淀，向沉淀中加入700 μL 5%氫氧化鈉和300μL甲醇溶液，混勻，65 ℃水浴加熱15 min除去樣品中的葉綠素（間或進(jìn)行搖勻樣品），待加熱后的樣品冷卻至室溫，經(jīng)7000 r/min離心3 min收集沉淀，再用雙蒸水洗滌沉淀3次，向沉淀中加入1 mL DMSO，65 ℃水浴加熱5 min，待冷樣品卻至室溫，7000 r/min離心3 min收集上清液，沉淀用DMSO重復(fù)提取至提取液基本無色，合并收集的上清液并定容于5 mL[14]。

用分光光度計檢測提取樣品，DMSO為空白對照，檢測波長是490 nm，蝦青素含量由以下公式計算：

其中：A490：待測樣品在波長490nm處吸光值；Cast：蝦青素含量；V1：提取所得液體體積mL；V2：提取所用藻液體積mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗設(shè)置3組平行試驗，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差的形式表示試驗結(jié)果，并用Excel 2016軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用GraphPad Prism 6軟件處理對實驗數(shù)據(jù)繪圖，試驗設(shè)計使用Design Expert軟件進(jìn)行CCD方法的響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)線性擬合，通過擬合后線性關(guān)系制作預(yù)測結(jié)果等高線和響應(yīng)曲面圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 基本培養(yǎng)基篩選

王正方等[22]利用BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)雨生紅球藻，獲得最大藻細(xì)胞濃度為1.70×105個/mL。Choi等[23]研究數(shù)據(jù)顯示，OHM培養(yǎng)基培養(yǎng)雨生紅球藻可獲得藻細(xì)胞濃度2.10×105個/mL。本試驗的培養(yǎng)條件下，HP1株系雨生紅球藻在5種試驗培養(yǎng)基中的生長情況如圖1。藻細(xì)胞生物量從第5 d開始迅速增加，在培養(yǎng)結(jié)束期即第12 d時，HP1在培養(yǎng)基配方A及OHM中的生物量均能達(dá)到較高生物量分別3.14×105個/mL、2.66×105個/mL，其次是MCM，BG11、BBM培養(yǎng)基。對比前人研究可知，本實驗培養(yǎng)條件下獲得的生物量明顯增加。由圖1可知，配方A相較于OHM更利于雨紅球藻綠色營養(yǎng)細(xì)胞的生長，可能與配方A中含有生長素、細(xì)胞分裂素等有機(jī)物有關(guān)，考慮到這些成分價格昂貴，綜合考慮，本文在后續(xù)實驗選擇OHM培養(yǎng)基。

圖1 不同培養(yǎng)基對雨生紅球藻HP1生長的影響Fig.1 Effect of different media on the growth of Haematococcus pluvialis HP1

2.2 碳源濃度優(yōu)化

以篩選出的OHM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，比較有機(jī)碳源與無機(jī)碳源對雨生紅球藻生長影響，并分別優(yōu)化出最優(yōu)濃度如圖2。由圖2a、2b可見在以不同濃度的有機(jī)碳源（NaAC）、無機(jī)碳源（NaHCO3）為碳源的培養(yǎng)基中其生物量都是從第5 d開始迅速增加，培養(yǎng)12 d后，在不同濃度的培養(yǎng)體系中的生物量出現(xiàn)明顯差異，在有機(jī)碳源（NaAC）為碳源的培養(yǎng)基當(dāng)碳源濃度為0.5 g/L時，藻生物量達(dá)到最大值，陳俊琳等[24]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)雨生紅球藻最佳有機(jī)碳源濃度在0.5~1.0 g/L，與本研究結(jié)果相似。不同于陸開形等[25]指出適于雨生紅球藻生長的NaHCO3濃度為0.2 g/L，此時獲得的最大細(xì)胞密度為1.40×105個/mL，在本研究中，無機(jī)碳源（NaHCO3）為碳源的培養(yǎng)基當(dāng)碳源濃度為0.5 g/L時，藻生物量達(dá)到最大值，獲得的最大細(xì)胞密度為2.80×105個/mL，比較上述結(jié)果，在本研究條件下生物量有所提高。因此可知，在本實驗條件下，有機(jī)碳源（NaAC）和無機(jī)碳源（NaHCO3）的最適濃度都為0.5 g/L，此濃度下，在培養(yǎng)結(jié)束時，其生物量分別為2.86×105個/mL、2.80×105個/mL。由圖2可知，有機(jī)碳源較無機(jī)碳源組產(chǎn)量有所提高，這與有機(jī)碳源兼養(yǎng)培養(yǎng)條件下，不僅能夠進(jìn)行光合自養(yǎng)，也能利用有機(jī)碳源進(jìn)行異養(yǎng)，同時我們也推測兼養(yǎng)培養(yǎng)改變了雨生紅球藻的光合生理狀態(tài)。

圖2 不同碳源及其濃度對雨生紅球藻HP1生長的影響Fig.2 The effect of different carbon sources and their concentrations on the growth of Haematococcus pluvialis HP1

2.3 蝦青素誘導(dǎo)單因素實驗結(jié)果

2.3.1 光照強(qiáng)度

由圖3可知，光照強(qiáng)度低于145 μmol/m2·s時蝦青素產(chǎn)量隨光照強(qiáng)度的増高而增加，當(dāng)光照強(qiáng)度達(dá)到145 μmol/m2·s時，蝦青素積累含量達(dá)到最大，隨后蝦青素產(chǎn)量隨光照強(qiáng)度増加而降低。這是因為高光照脅迫應(yīng)激下，能使雨生紅球藻中蝦青素的合成量增高并保護(hù)光合色素，但當(dāng)光照應(yīng)激程度超過雨生紅球藻抵抗范圍，細(xì)胞就會受到損傷而降低蝦青素的產(chǎn)量[26]?？梢姡岣吖庹諒?qiáng)度有助于雨生紅球藻的積累但并非越高越好。Jeon等[27]認(rèn)為125~180 μmol/m2·s是雨生紅球藻積累蝦青素的最適光強(qiáng)。與本研究結(jié)果一致，在本研究中將光照強(qiáng)度設(shè)置在145 μmol/m2·s時，更有利于蝦青素的積累，在以有機(jī)碳源（NaAC）和無機(jī)碳源（NaHCO3）為碳源的培養(yǎng)體系中，蝦青素產(chǎn)量最高值分別為5.31 mg/L、4.24 mg/L。所以蝦青素誘導(dǎo)最適光照強(qiáng)度為145 μmol/m2·s。

圖3 光照強(qiáng)度對蝦青素積累量的影響Fig.3 Effect of light intensity on astaxanthin accumulation

2.3.2 初始pH

從圖4中可知，初始pH小于7時蝦青素產(chǎn)量隨pH升高而增加，當(dāng)初始pH大于7后，蝦青素產(chǎn)量隨pH值升高下降明顯。因此可知，初始pH過低或過高都會嚴(yán)重影響雨生紅球藻蝦青素的產(chǎn)量。沈淵等[28]認(rèn)為雨生紅球藻適宜初始pH值為中性至弱堿性，與本文結(jié)果相似。在本研究中將初始pH設(shè)置為7時，更有利于蝦青素的積累。以有機(jī)碳源（NaAC）和無機(jī)碳源（NaHCO3）為碳源的培養(yǎng)體系中，初始pH為7蝦青素產(chǎn)量最高，分別為5.30 mg/L、4.22 mg/L。所以蝦青素誘導(dǎo)最適初始pH為7。

圖4 光照強(qiáng)度和初始pH對蝦青素含量的影響Fig.4 The influence of light intensity and pH on astaxanthin content

圖4 初始pH對蝦青素積累量的影響Fig.4 Effect of initial pH on astaxanthin accumulation

2.3.3 誘導(dǎo)時間

由圖5可知，脅迫誘導(dǎo)時間低于9 d時蝦青素產(chǎn)量隨光照強(qiáng)度的增強(qiáng)而增加，在第9 d時，蝦青素積累含量達(dá)到最大，超過9 d蝦青素產(chǎn)量呈下降趨勢，這是因為持續(xù)光照藻細(xì)胞開始死亡[26]。在本研究中將脅迫誘導(dǎo)時間設(shè)置在9 d時，更有利于蝦青素的積累。在以有機(jī)碳源（NaAC）和無機(jī)碳源（NaHCO3）為碳源的培養(yǎng)體系中，蝦青素產(chǎn)量最高值分別為5.35 mg/L、4.24 mg/L，所以蝦青素脅迫誘導(dǎo)最適誘導(dǎo)時間為9 d。

圖5 光照強(qiáng)度和誘導(dǎo)時間對蝦青素含量的影響Fig.5 The effect of light intensity and conversion time on astaxanthin content

圖5 誘導(dǎo)時間對蝦青素積累量的影響Fig.5 Effect of induction time on astaxanthin accumulation

2.4 響應(yīng)曲面分析

不同微藻積累蝦青素最適光照強(qiáng)度和誘導(dǎo)時間存在差異[29]。本研究利用響應(yīng)面分析法確定光照強(qiáng)度、誘導(dǎo)時間和初始pH三個因素的最優(yōu)水平，每組設(shè)置3個重復(fù)，以雨生紅球藻在脅迫條件下蝦青素產(chǎn)量為響應(yīng)值Y，利用Design Expert數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件按照旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計原理，得到實驗方案與結(jié)果，如表2用以估計試驗誤差。

利用Design-Expert軟件對對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到回歸模型：

表2 旋轉(zhuǎn)中心組合實驗設(shè)計方案和響應(yīng)值結(jié)果表Table 2 Rotating center combination experiment design scheme and response value result table

擬合二次回歸方程（有機(jī)碳源培養(yǎng)基）：

擬合二次回歸方程（無機(jī)碳源培養(yǎng)基）：

通過對該模型進(jìn)行方差分析及模型可信度分析，結(jié)果見表3、表4。

表3 響應(yīng)面回歸模型Y1 的方差分析表（有機(jī)碳源培養(yǎng)基）Table 3 ANOVA table of response surface regression model Y1 (organic carbon source medium)

表4 響應(yīng)面回歸模型Y2 的方差分析表（無機(jī)碳源培養(yǎng)基）Table 4 ANOVA table of response surface regression model Y2 (inorganic carbon source medium)

由上述分析可知，兩個回歸模型p值都小于0.001，表明模型均顯著。而從其失擬項來看均不顯著，說明預(yù)測值與實驗值之間有較好的相關(guān)性，提示回歸方程的預(yù)測值和實驗值誤差較小，可以良好地預(yù)測蝦青素產(chǎn)量。模型可信度分析，其中校正后的R2分別為0.9222、0.9192，說明模型可以解釋90%以上的實驗所得數(shù)據(jù)，實驗精密度分別為13.226、12.406均大于4，是可取的，殘差皆分布在一條直線上，進(jìn)一步說明模型擬合優(yōu)度較好，實驗誤差小，可用此模型來分析和預(yù)測結(jié)果。

在有機(jī)碳源培養(yǎng)基模型中一次項A為顯著，B不顯著，C為極顯著。3種脅迫因素對雨生紅球藻積累蝦青素含量影響效果為C>A>B。二次項A2、B2、C2均高度顯著，而交互項AB、AC、BC均有影響，但不顯著，因此，可認(rèn)為在以有機(jī)碳源（NaAC）為碳源的情況下3種脅迫因素對蝦青素產(chǎn)生交互式影響較小。在無機(jī)碳源培養(yǎng)基的模型中一次項A為顯著，B不顯著，C為極顯著。3種脅迫因素對雨生紅球藻積累蝦青素含量影響效果為C>A>B。二次項A2、B2、C2均高度顯著，而交互項AB顯著，AC、BC均有影響，但不顯著，因此，可認(rèn)為在以無機(jī)碳源（NaHCO3）為碳源的情況下3種脅迫因素對蝦青素產(chǎn)生交互式影響較小。

從上述方差結(jié)果及模型可行度分析可知，模型可以較好地擬合3種不同脅迫因素對雨生紅球藻高產(chǎn)蝦青素的效果，為了更加體現(xiàn)研究具體數(shù)值較優(yōu)脅迫效果，使用Design-Expert.V.8.0.6軟件對該模型繪制響應(yīng)曲面圖，考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀，圖4~6為回歸方程預(yù)測的三個因素耦合影響下的響應(yīng)面三維圖及相應(yīng)等高線圖，可以直觀表示試驗因素的3個水平間與響應(yīng)值的函數(shù)關(guān)系，獲取試驗設(shè)計中最優(yōu)工藝參數(shù)。一般的，由等高線的形狀可以判斷各因素之間的交互作用是否顯著：圓形表示不顯著，橢圓形或馬鞍形表示顯著。

光照強(qiáng)度和初始pH對蝦青素含量的影響如圖4所示，a、a`表示以有機(jī)碳源（NaAC）為碳源的培養(yǎng)體系，b、b`表示以無機(jī)碳源（NaHCO3）為碳源的培養(yǎng)體系。從圖中可知光照強(qiáng)度和初始pH交互作用對蝦青素含量的影響，呈拋物線型關(guān)系，且均有一個極大值點(diǎn)。當(dāng)前實驗范圍內(nèi)，當(dāng)初始pH不變，隨著光照強(qiáng)度的升高，蝦青素含量先升高后降低，當(dāng)光照強(qiáng)度不變，隨著初始pH的升高，蝦青素含量先升高后降低。蝦青素含量變化速率顯示，光照強(qiáng)度的主效應(yīng)略強(qiáng)于初始pH的效應(yīng)，當(dāng)光照強(qiáng)度達(dá)到145μmol/m2·s和初始pH為7條件下，相互交互效果最佳。

基于光照強(qiáng)度和誘導(dǎo)時間的響應(yīng)面和等高線圖如圖5所示，a、a`表示以有機(jī)碳源（NaAC）為碳源的培養(yǎng)體系，b、b`表示以無機(jī)碳源（NaHCO3）為碳源的培養(yǎng)體系。光照強(qiáng)度和誘導(dǎo)時間交互作用對蝦青素含量的影響，呈拋物線型關(guān)系，且均有一個極大值點(diǎn)。當(dāng)前實驗范圍內(nèi)，當(dāng)誘導(dǎo)時間不變，隨著光照強(qiáng)度的升高，蝦青素含量先升高后緩慢降低，當(dāng)光照不變，隨著誘導(dǎo)時間的延長，蝦青素含量先升高后降低。蝦青素含量變化速率顯示，誘導(dǎo)時間的主效應(yīng)略強(qiáng)于光照強(qiáng)度效應(yīng)，當(dāng)光照強(qiáng)度達(dá)到145 μmol/m2·s和誘導(dǎo)時間為9 d條件下，相互交互效果最佳。

根據(jù)初始pH與誘導(dǎo)時間繪制的響應(yīng)曲面和等高線圖如圖6所示，a、a`表示以有機(jī)碳源（NaAC）為碳源的培養(yǎng)體系，b、b`表示以無機(jī)碳源（NaHCO3）為碳源的培養(yǎng)體系。結(jié)果表明：初始pH和誘導(dǎo)時間交互作用對蝦青素含量的影響，呈拋物線型關(guān)系，且均有一個極大值點(diǎn)。當(dāng)前實驗范圍內(nèi)，當(dāng)初始pH不變，隨著誘導(dǎo)時間的延長，蝦青素含量先升高后降低，當(dāng)誘導(dǎo)時間不變，隨著初始pH的升高，蝦青素含量先升高后降低。蝦青素含量變化速率顯示，誘導(dǎo)時間的主效應(yīng)略強(qiáng)于初始pH效應(yīng)，當(dāng)誘導(dǎo)時間達(dá)到9 d和初始pH為7條件下，相互交互效果最佳。在三個測試獨(dú)立變量，誘導(dǎo)時間是影響蝦青素含量最重要因素，其次是光照強(qiáng)度和初始pH。

圖6 初始pH和誘導(dǎo)時間對蝦青素含量的影響Fig.6 Effect of pH and conversion time on astaxanthin content

三組圖直觀地反映了各個因素對響應(yīng)值的影響，在三個測試獨(dú)立變量，誘導(dǎo)時間是影響蝦青素含量最重要的因素，其次是光照強(qiáng)度和初始pH。利用Design Expert軟件進(jìn)行實驗結(jié)果優(yōu)化，本實驗主要目的在于優(yōu)化雨生紅球藻最適脅迫條件，通過分析回歸方程存在穩(wěn)定點(diǎn)，穩(wěn)定點(diǎn)是極大值點(diǎn)，即光照強(qiáng)度為145μmol/m2·s、初始pH為7、誘導(dǎo)時間為9 d時，在以有機(jī)碳源（NaAC）和無機(jī)碳源（NaHCO3）為碳源的培養(yǎng)體系中，蝦青素產(chǎn)量最大分別為5.74 mg/L、4.25 mg/L。

實驗結(jié)果驗證，為了檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，再次進(jìn)行實驗，采用上述中心組合試驗得出的最優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行3次平行實驗，在以有機(jī)碳源（NaAC）和無機(jī)碳源（NaHCO3）為碳源的培養(yǎng)體系中，實際測得的平均實驗蝦青素含量值分別為5.81 mg/L、4.34 mg/L。與軟件預(yù)測值無顯著差別，但比優(yōu)化前的最佳條件略有提高，證明應(yīng)用響應(yīng)曲面法能有效優(yōu)化有利于雨生紅球藻蝦青素積累的培養(yǎng)條件。

3 結(jié)論

3.1 綠色生長階段基本培養(yǎng)基的篩選與碳源及其濃度的優(yōu)化

雨生紅球藻綠色營養(yǎng)生長時期的生物量決定了蝦青素的總產(chǎn)量，培養(yǎng)基成分是影響雨生紅球藻生長的重要因子。從5種不同的培養(yǎng)基（BBM、OHM、改良MCM、配方A、BG11）中篩選出最適于雨生紅球藻HP1生長的培養(yǎng)基為OHM培養(yǎng)基。針對篩選出的OHM培養(yǎng)基進(jìn)行碳源濃度的優(yōu)化，最適碳源濃度為0.5 g/L。在本實驗條件下，有機(jī)碳源（NaAC）和無機(jī)碳源（NaHCO3）的最適濃度都為此濃度下，在培養(yǎng)結(jié)束時，其生物量分別為2.86×105個/mL、2.80×105個/mL，生物量得到較大提高，旨在為雨生紅球藻大規(guī)模培養(yǎng)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

3.2 蝦青素積累階段脅迫條件研究

脅迫條件顯著影響積累蝦青素的含量。本文通過單因素實驗研究影響蝦青素積累的脅迫條件的主要因素，即光照強(qiáng)度、初始pH和誘導(dǎo)時間。利用Design Expert設(shè)計軟件，采用旋轉(zhuǎn)中心組合實驗設(shè)計法考察了不同因素間的相互關(guān)系，建立優(yōu)化雨生紅球藻產(chǎn)蝦青素最適脅迫條件的數(shù)學(xué)模型，根據(jù)回歸分析可知其最適脅迫條件是：光照強(qiáng)度為145 μmol/m2·s、初始pH為7、誘導(dǎo)時間為9 d。在該條件下，以有機(jī)碳源（NaAC）和無機(jī)碳源（NaHCO3）為碳源的培養(yǎng)體系中，蝦青素產(chǎn)量最大分別為5.74 mg/L、4.25 mg/L，與理論預(yù)測值基本吻合。本研究結(jié)果將為進(jìn)一步提高雨生紅球藻蝦青素產(chǎn)量提供科學(xué)依據(jù)。