付 帥，陳仕朋，葉 煒，林玉玲，徐 涵，3，賴鐘雄*，葉開溫，4*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建福州350002；2.三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，福建三明365000；3.法國圖盧茲綜合科學(xué)研究所，法國圖盧茲31000；4.臺灣大學(xué)植物科學(xué)研究所，臺灣臺北10617）

MAD2（spindle check point protein MAD2）是一種紡錘體檢查點蛋白，首先在玉米中鑒定，它與有絲分裂細(xì)胞以及減數(shù)分裂I和II期間的著絲?！獎恿?fù)合體相關(guān)[1]。MAD2是紡錘體檢查點的重要組成部分，在微管附著到動粒完成的過程中該基因能阻斷分離酶的激活和姐妹染色單體的溶解[2]。對細(xì)胞分裂的過程進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)了在未與紡錘體連接的著絲點上MAD2蛋白的濃度較高，而在與紡錘絲連接的著絲點上則與之相反，這表明MAD2在未與紡錘體連接的著絲粒點上高濃度[3]。MAD2是維持染色體在分裂時向細(xì)胞兩級移動的關(guān)鍵物質(zhì)，在探討染色體不分離問題的分子機(jī)制中，該基因的研究顯得極為重要[4]。在nua突變體中發(fā)現(xiàn)NUA和MAD2可能在植物的分生細(xì)胞分裂中發(fā)揮作用[5]。已有的研究表明，在文心蘭不可育品種‘檸檬綠’中，On MAD2的表達(dá)量低于可育品種‘巧克力’，因此推測MAD2是影響文心蘭‘檸檬綠’花粉活力低的關(guān)鍵基因之一[6]。

該試驗通過At MAD2基因的擬南芥突變體mad2（SALK_136419）的鑒定與表型分析，發(fā)現(xiàn)了當(dāng)At MAD2基因在擬南芥花苞中表達(dá)量增高時會影響植物的生殖生長，如抽花梗時間提早、花粉活力和結(jié)果莢率下降。表明了MAD2在擬南芥中表達(dá)量高會導(dǎo)致育性下降，這與MAD2在文心蘭中的表達(dá)結(jié)果相反。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥（Arabidops is thaliana）mad2（S A L K_136419）突變體購自擬南芥突變體中（Ara Share），通過T AIR（https://www.arabidopsis.org/index.jsp）查詢T-D N A插入位點的邊緣序列（Flanking sequence），經(jīng)三引物法篩選鑒定后用于本次試驗。

1.2 方法

1.2.1 播種方法與種植環(huán)境。將種子從4℃冰箱取出，之后在超凈臺使用84消毒液∶水（1∶5）進(jìn)行清洗2次，每次5 min，消毒后用高壓滅菌水進(jìn)行清洗5～6次，每次1 min。均勻播種在1/2 M S培養(yǎng)基平板上。4℃黑暗環(huán)境下存放2 d后，轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)室，培養(yǎng)溫度22℃，相對濕度60%～70%，14 h/10 h的光暗周期。大約7 d后，移栽到培養(yǎng)土中（土∶蛭石=2∶1）。放置在人工氣候箱，光照條件和溫度同上。

1.2.2 突變體鑒定。幼苗生長3周，剪取葉片采用C T AB法提取基因組總D N A，以總D N A為模板進(jìn)行PC R擴(kuò)增。PC R所用引物L(fēng) P、R P的序列根據(jù)插入位點的位置自行設(shè)計，T-D N A通用引物B P通過http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html設(shè)計，進(jìn)行PC R擴(kuò)增(表1)，驗證m y b106突變體是否為純合體。反應(yīng)體系共20μL：模板1μL，引物各1μL，10μL 2×Taq PCR Master Mix(上海生物工程有限公司)，加ddH2O至20μL，充分混勻后進(jìn)行PC R擴(kuò)增。PC R反應(yīng)程序為：94℃變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，共32個循環(huán)。PC R產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后于凝膠成像系統(tǒng)成像。

表1 PCR引物序列

1.2.3 擬南芥總R N A的提取。采用T ri z ol u p R N A試劑盒（全式金生物技術(shù)有限公司）提取擬南芥未開放時期花苞的總R N A，利用超微量分光光度計（Thermo Electron Corp）檢測R N A樣品濃度（O D260/O D280值介于1.8～2.1），并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測花器官總R N A的質(zhì)量和純度。cDNA經(jīng) SMART TM RACEA cDNA Amplification Kit試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成，用于后續(xù)目的基因AtMAD2表達(dá)量的檢測。

具體操作方法參考試劑盒說明書。

1.2.4 植株的表型觀測。使用手機(jī)拍攝記錄播種30和60 d的生長情況。隨機(jī)選取16株擬南芥野生型和mad2突變體的植株。

1.2.5 擬南芥花藥和花粉粒的亞歷山大染色。取擬南芥野生型和mad2突變體的盛開期的花朵，參考Alexander[7]的方法，將花粉置于載玻片上，滴少量亞歷山大染色液，可育花粉呈深紅色，花粉活力弱呈淺紅色，敗育花粉呈無色。置于普通光學(xué)顯微鏡（B X-50）下觀察染色花粉粒的數(shù)量和形狀。并統(tǒng)計3個最佳視野下花粉粒的總數(shù)和著色花粉粒數(shù)。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理和分析方法。使用軟件Excel 2010進(jìn)行student t-test顯著性分析，P<0.05為顯著差異（*），P<0.01為極顯著差異（**）。

2 結(jié)果分析

2.1 T-DNA插入位點與鑒定結(jié)果

從圖1可見，mad2（At3g25980）由7個外顯子和6個內(nèi)含子組成，mad2（S A L K_136419）突變體的T-D N A插入位點位于5′U T R端前約2 100 b p左右。

圖1 mad2突變體的T-DNA插入位點分析及鑒定結(jié)果

用mad2基因的特異性引物L(fēng) P與R P進(jìn)行PC R擴(kuò)增，野生型中擴(kuò)增出1條帶，條帶位置與目的基因（1 059 bp）大小一致。而與此對應(yīng)的mad2突變體中未擴(kuò)增出條帶，而用T-D N A特異性引物B P和R P進(jìn)行擴(kuò)增，mad2突變體中擴(kuò)增出1條特異條帶，條帶大小為500～750 b p，與引物的預(yù)期擴(kuò)增結(jié)果一致，而野生型中未能擴(kuò)增出此條帶，證明本試驗所使用MAD2的T-D N A插入體是純合的突變體。

2.2 AtMAD2的表達(dá)量分析

熒光定量PC R的結(jié)果表明在mad2突變體中，OnMAD2的表達(dá)量遠(yuǎn)高于野生型，大約是野生型的9倍（圖2）。

圖2 AtMAD2在突變體中的表達(dá)量分析

2.3 突變體的表型分析

將野生型擬南芥和mad2突變體進(jìn)行表型比較分析。結(jié)果如下：播種后30 d時mad2突變體已經(jīng)抽梗，而野生型還未抽梗（圖3A）。播種60 d后，可以看出mad2突變體植株的植株大小與野生型有明顯差異，說明MAD2基因的T-D N A插入抑制了植株的營養(yǎng)生長，除此之外，野生型的果莢數(shù)量較多，而mad2突變體的結(jié)莢數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于野生型株，并且可以看出野生型的莖相比于mad2更加粗壯（圖3B）。

圖3 擬南芥野生型和myb106突變體的表型分析

對野生型擬南芥和mad2突變體植株的結(jié)果莢情況進(jìn)行分析可知，W T的果莢長度約為1.07 cm，單個果莢內(nèi)種子數(shù)量約為19粒。與其同樣環(huán)境下種植的mad2突變體的都小于W T的果莢長度和種子數(shù)量。其中mad2的果莢長度和單果莢種子數(shù)量均約為0.79 cm、7粒，與野生型植株呈現(xiàn)極顯著差異。這表明T-D N A對MAD2基因高表達(dá)的影響，直觀的影響到了植株的繁育能力，顯著影響了果莢的發(fā)育和種子形成的過程（表2）。

表2 野生型擬南芥和mad2突變體植物的果莢分析

2.4 突變體花粉粒的亞歷山大染色

對擬南芥花朵開放期成熟花粉粒的亞歷山大染色，可以看出擬南芥野生型的單個花粉粒獨立分散，并且花粉粒形態(tài)飽滿，形狀近乎圓形，僅有少數(shù)花粉粒未被著色（圖4A-C）。對花粉粒的花粉活力進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，可以看出野生型的被染色的花粉粒高達(dá)94%（圖5）。mad2突變體的花粉粒在染色后，有較多的花粉粒未著色，這表明mad2突變體有較多的花粉粒是沒有活力的。從更細(xì)節(jié)的圖片中可以看出，mad2的花粉粒形狀異常。之后進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，得到mad2突變體的花粉活力染色率僅為69%（圖5），與野生型呈現(xiàn)極顯著差異（圖4D-F）。

圖4 擬南芥開放期花藥和花粉粒的亞歷山大染色

3 討論

在已有的研究結(jié)果中，不乏有高表達(dá)導(dǎo)致植物不育的基因，如擬南芥中過表達(dá)miR167導(dǎo)致雄性不育[8]；同樣在擬南芥中過表達(dá)At1g74450的O R F后會讓植物的株高和育性都下降[9]；在擬南芥中過表達(dá)miR159能夠延遲開花，因為miR159可以調(diào)節(jié)編碼M Y B轉(zhuǎn)錄因子的基因與花藥發(fā)育有著非常廣泛的關(guān)聯(lián)，在擬南芥中過表達(dá)mi R159的植株中，由于抑制了MYB103基因的合成，導(dǎo)致絨氈層提前降解，最終造成花粉敗育[10]。就表型來看，AtMAD2就是屬于這一類的基因。AtMAD2表達(dá)量增加提早了擬南芥抽花梗的時期，讓其提早抽花梗大約4 d左右，對于后續(xù)發(fā)育時期的生殖生長，MAD2基因也起到了關(guān)鍵作用，mad2的突變體花粉活力嚴(yán)重下降，最后導(dǎo)致了單株果莢數(shù)、果莢長度和種子數(shù)量均嚴(yán)重降低。但關(guān)于AtMAD2表達(dá)量增高造成植物育性下降的內(nèi)在機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。結(jié)合已有的研究可以得出，MAD2確實是影響花粉發(fā)育的關(guān)鍵基因，但在文心蘭不可育品種‘檸檬綠’中表達(dá)量低于可育品種，而在擬南芥中則相反，其表達(dá)量在野生型中低于育性低的株系。

圖5 花粉活力染色率