宋軍，周志新，王晗晟，劉夢，鄭家三，孫東波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶163319）

奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）是一種無莢膜、無芽孢、有鞭毛和菌毛的革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌，是變形桿菌屬中最重要的病原菌之一[1]。以產(chǎn)生脲酶和固體培養(yǎng)基上形成典型的遷徙運動能力而聞名[2]。奇異變形桿菌是一種腐生性的條件致病菌，分布較廣，可存在于多種環(huán)境中，常見于土壤、污水、動物體表、腸道等部位，能夠引起人和動物傷口、眼睛、呼吸道、胃腸道和尿道等感染[3]。奇異變形桿菌是繼大腸桿菌之后最易引發(fā)人泌尿道感染的細(xì)菌，可引起嚴(yán)重的泌尿道組織學(xué)損傷并與膀胱和腎臟結(jié)石的形成有關(guān)[4-5]。

近年來，奇異變形桿菌作為人獸共患的病原菌，除了能夠感染人以外，還能感染雞、豬、山羊、水貂、狐貍、恒河猴等多種動物，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[6-8]。同時，奇異變形桿菌被證明能夠抵抗多種抗生素和獲得能夠生產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶拓展譜的能力[9-11]，導(dǎo)致嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[12]。

噬菌體廣泛存在于自然界，是一類可以感染并裂解細(xì)菌的病毒。噬菌體具有極強的宿主特異性，除對宿主菌具有裂解作用，不會感染其他正常菌群，對人和動物無害[13]。近年來，噬菌體在防治人和動物疾病、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、食源性感染防治應(yīng)用廣泛[14-17]。特別是作為一種抗生素替代物或補充治療方法[18]，在控制病原菌的傳播以及治療耐藥性細(xì)菌感染等方面取得了巨大的進展。在當(dāng)下耐藥菌株不斷出現(xiàn)、新型抗菌藥物研發(fā)進展緩慢的狀況下，噬菌體可作為治療感染性疾病的手段再次引起人們的關(guān)注。

前期研究[19]從城市居民區(qū)生活污水中分離出4株奇異變形桿菌的噬菌體，并對其生物學(xué)特性進行研究，表明其具有較好的特異性和裂解活性。周祥瑩等[20]以貉源奇異變形桿菌為宿主菌分離出噬菌體，驗證其體外裂解活性，為貉奇異變形桿菌病的防治提供了基礎(chǔ)。研究從感染性結(jié)石犬的尿液中分離到致病菌，通過形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、16S rRNA測序等，判定為奇異變形桿菌，并具有較強的耐藥性。再以分離菌株為宿主菌，從污水中分離裂解性噬菌體，命名為vB_PmM_XNR，對其生物學(xué)特性進行研究，同時評價裂解性噬菌體對奇異變形桿菌的體外裂解活性，以期為治療和控制奇異變形桿菌感染和研制新型抗菌制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑

LB培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯、Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基、亞碲酸鈉卵黃增菌液、尿素酶瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基購自海博（青島）生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組提取、DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；革蘭氏染色試劑盒、透析袋購自索萊寶（北京）科技有限公司；DNA Ladder Marker、PCR Mix，購自近岸蛋白質(zhì)科技有限公司；其他常規(guī)試劑均為分析純。聚乙二醇8000購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海森信實驗儀器有限公司）；低溫冷離心機（德國艾本德股份公司）；JEM-2100 Plus透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）；Bio-Rad S1000TMPCR儀（美國BIO-RAD S1000）。

1.2 細(xì)菌分離及生物學(xué)特性分析

1.2.1 細(xì)菌分離

病料采自于大慶市農(nóng)大動物醫(yī)院。無菌采取犬膀胱尿液，2 000 r·min-1離心5 min，棄去尿液上清液，將沉淀物接種于Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基和血瓊脂固體培養(yǎng)基上，置37℃培養(yǎng)24 h后，挑取典型菌落進行分離純化，染色鏡檢。

為了進一步觀察分離菌株的形態(tài)特征，取純化的菌液10μL（105CFU·mL-1）置于銅網(wǎng)，靜置15 min左右，用濾紙吸干多余液體，用負(fù)染液（2%磷鎢酸溶液）染色5 min，濾紙吸干染液后，用蒸餾水清洗2遍，干燥后置于透射電鏡（JEM-2100 Plus，JEOL，日本）觀察。

1.2.2 溶血能力檢測

將分離純化的細(xì)菌劃線接種到新鮮配置的血瓊脂培養(yǎng)基（脫纖維羊血5%），置于37℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，觀察細(xì)菌。

1.2.3 細(xì)菌脲酶鑒定

參照W.B.Christensen等[21]的試驗方法，將分離純化的細(xì)菌接種于尿素培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)10～12 h后，觀察尿素培養(yǎng)基顏色變化。尿素培養(yǎng)基由橘黃色變紅色則表明細(xì)菌能夠產(chǎn)生尿素酶。

1.2.4 16 Sr R NA的擴增

參考細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組DNA，稀釋至濃度為20 ng·μL-1備用。設(shè)計細(xì)菌16S通用引物，引物序列為F5′-GAGTTTGATCCTGGCTCA-3′和R5′-GTTACCTTGTTACGACT-3′，預(yù)擴增片段大小約為1 500 bp。PCR擴增體系（總體積為50μL）：Rnase-free 2×Taq Mix 25μL，引物各2μL，DNA模板2μL，H2O 19μL。擴增程序：94℃預(yù)變性90 s；94℃變性20 s，50℃退火20 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán)；72℃再延伸5 min。使用DNA純化回收試劑盒切膠純化PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶大小無誤后送到生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結(jié)果與GenBank中其他序列進行比對分析。

1.2.5藥敏試驗

挑取單個菌落置于LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)6～8 h，取100μL菌液滴入LB固體培養(yǎng)基中涂布均勻，將不同的藥敏紙片置于均勻涂滿菌液的LB固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌環(huán)直徑，參照CLSI（2014）標(biāo)準(zhǔn)[22]判定結(jié)果。

1.3 噬菌體分離鑒定及生物學(xué)特性分析

1.3.1 噬菌體的分離純化及電鏡觀察

取未處理污水經(jīng)紗布初濾大顆粒雜質(zhì)后加入CaCl2終濃度為1 mmol·L-1，6 000 g離心15 min除去其他雜質(zhì)。采用透析袋濃縮離心后的污水上清4℃過夜，濃縮后的污水經(jīng)0.22μM濾膜過濾除菌、備用。以分離到的菌液為宿主菌分離噬菌體，將100 mL除菌的濾液上清加入100 mL 2×LB培養(yǎng)基，滴入對數(shù)生長期的宿主菌100μL，37℃160 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h，10 000 g離心10 min，將上清經(jīng)0.22μM濾器過濾除菌。將濾液和宿主菌充分混合，接種到融化的半固體培養(yǎng)基（瓊脂含量0.75%）充分混勻，倒入營養(yǎng)瓊脂平板中，凝固后置于37℃恒溫培養(yǎng)8 h，觀察噬菌斑的形成情況。挑取透明、形狀規(guī)則的噬菌斑，采用雙層平板法分離純化8～10次，可以得到純化的噬菌體。

為了進一步觀察vB_PmM_XNR的形態(tài)，采用透射電鏡（JEM-2100 Plus，JEOL，日本）觀察。簡要步驟：取噬菌體懸液10μL（106PFU·mL-1）置于銅網(wǎng)，靜置20 min左右，用濾紙吸干多余液體，用負(fù)染液（2%磷鎢酸溶液）染色5 min，濾紙吸干染液后，用蒸餾水清洗2遍，干燥后置于透射電鏡（JEM-2100 Plus，JEOL，日本）觀察。

1.3.2 最佳感染復(fù)數(shù)測定及一步生長曲線

將細(xì)菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期（約1×108CFU·mL-1），噬菌體與細(xì)菌各100μL，按照比例為100、10、1、0.1、0.01、0.001進行混合，室溫靜置10 min。37℃恒溫160 r·min-1振蕩培養(yǎng)4 h。雙層平板法測定噬菌斑個數(shù)，以噬菌體滴度增加最高比例的為最佳感染復(fù)數(shù)，重復(fù)3次取均值。

將對數(shù)生長期的分離株（OD600=0.3，約為1×108CFU·mL-1）和噬菌體按MOI等體積（各500μL）混合后，置37℃靜置孵育15 min，8 000 g離心5 min，棄上清。沉淀重懸于10 mL LB中，37℃搖床160 r·min-1振蕩培養(yǎng)。每間隔5 min取樣，測定不同時間點噬菌體滴度，繪制一步生長曲線。

1.3.3 噬菌體溫度和pH穩(wěn)定性實驗

將等體積噬菌體（108PFU·mL-1）分別置于不同溫度（4、25、37、42、60和70℃）條件下孵育1 h后，采用雙層平板法檢測噬菌體滴度變化，評價噬菌體熱穩(wěn)定性。同樣，將等體積的噬菌體分別加到不同pH（pH=2.0～12.0）的緩沖溶液中37℃水浴中孵育1 h，檢測噬菌體滴度。

1.3.4 氯仿敏感性檢測

取1 mL（108PFU·mL-1）噬菌體液加入氯仿（1%體積），充分混合15 s后置于室溫靜置30 min，待分層后取上層溶液測定滴度[23]。

1.4 體外裂解作用

將奇異變形桿菌PM-XNR培養(yǎng)至對數(shù)生長期，PBS（pH=7.4）洗滌去除培養(yǎng)基，并調(diào)整細(xì)菌濃度為108PFU·mL-1，加入1 mL效價約為108PFU·mL-1的噬菌體XNR于37℃靜置培養(yǎng)，分別于0、4、8、12、24 h測定培養(yǎng)液中細(xì)菌濃度以及噬菌體效價。

2 結(jié)果與分析

2.1 革蘭氏染色和生物學(xué)特性檢測

分離株在Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基上菌落呈圓形褐色，邊緣圍繞一圈透明帶，符合奇異變形桿菌在Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基上生長特性，如圖1 A所示。分離株經(jīng)革蘭氏染色后，顯微鏡下觀察呈紅色，無芽孢及莢膜，具有多形態(tài)性呈桿狀、球狀等（見圖1 B）；透射電鏡能夠清楚看到細(xì)菌形態(tài)，表面粗糙、有鞭毛（見圖1 C）；分離株在血瓊脂培養(yǎng)呈灰白色菌落，具有溶血現(xiàn)象，散發(fā)特殊的腐敗性臭味（見圖1 D）；分離株在尿素培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18 h變?yōu)榉奂t色，說明分離株產(chǎn)生脲酶分解尿素（見圖1 E），這也是泌尿系統(tǒng)產(chǎn)生結(jié)石的主要原因之一。通過上述革蘭氏染色和生物學(xué)特性實驗可以初步判定分離株為奇異變形桿菌。

圖1 分離菌生物學(xué)特性及電鏡觀察結(jié)果Fig.1 Biological characteristics and observation by transmission electron microscope

2.2 16Sr RNA序列同源性比較

細(xì)菌基因組經(jīng)PCR擴增后，在1 500 bp左右出現(xiàn)單一條帶（圖2）。測序后BLAST分析比對，發(fā)現(xiàn)與其Query程度最高的幾種16SrRNA序列均為奇異變形桿菌，其Query程度均高達98%以上，因此可以確定分離到的菌株為奇異變形桿菌，命名為PMXNR。

圖2 16Sr RNA擴增結(jié)果Fig.2 Amplification results of 16SrRNA

2.3 藥敏試驗

18種藥品對PM-XNR進行藥敏試驗，其中該菌株P(guān)M-XNR對頭孢抗生素頭孢吡肟敏感，對阿米卡星、氨芐西林、左氧氟沙星、氯霉素和環(huán)丙沙星中度敏感；對其他使用的抗生素均耐藥。說明犬源奇異變形桿菌具有較強的耐藥性。

表1 PM-XNR藥敏試驗結(jié)果（抑菌圈直徑/mm）Table 1 Drug sensitivity test results of PM-XNR

2.4 噬菌斑及噬菌體電鏡觀察

以分離獲得的奇異變形桿菌PM-XNR為宿主菌，通過雙層瓊脂平板法從污水中分離出1株裂解性噬菌體，命名為vB_PmM_XNR（縮寫為XNR）。在雙層瓊脂平板上可見形狀規(guī)則、邊界清晰、透明的噬菌斑（圖1 A）。XNR經(jīng)負(fù)染后電鏡顯示（圖1 B），XNR頭部呈二十面體對稱，直徑約為60±3 nm，具有短尾。

2.5 噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)及一步生長曲線

如表2所示，當(dāng)MOI=0.01時，噬菌體XNR感染宿主后噬菌體滴度增加了將近104；為XNR的最佳感染復(fù)數(shù)。

圖3 vB_PmM_XNR噬菌斑和電鏡圖片F(xiàn)ig.3 Phage plaque and electron micrograph of vB_PmM_XNR

表2 vB_PmM_XNR最佳感染復(fù)數(shù)Table 2 Optimal multiplicity of infection of vB_PmM_XNR

當(dāng)MOI=0.01時噬菌體產(chǎn)出量最高，按0.01的比例繪制一步生長曲線。XNR一步生長曲線如圖4所示。XNR感染宿主菌后15 min內(nèi)（潛伏期）滴度無明顯的變化，感染后15～55 min內(nèi)，噬菌體數(shù)量急劇增加，可知XNR爆發(fā)時間約為40 min，平均裂解量約為80 PFU·cell-（1裂解量=爆發(fā)末期噬菌體效價/感染初期宿主菌濃度）。

圖4 vB_PmM_XNR一步生長曲線測定Fig.4 One-step growth curve of vB_PmM_XNR

2.6 噬菌體熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性及氯仿敏感性

噬菌體分離自污水中，對環(huán)境的適應(yīng)能力和耐受能力相對較強[24]。溫度敏感性實驗結(jié)果（圖5 A）表明，噬菌體vB_PmM_XNR在4℃～42℃之間，活性基本穩(wěn)定。當(dāng)溫度升高到60℃時，噬菌體vB_PmM_XNR滴度下降100倍左右；達到70℃時，噬菌體全部失活。

從結(jié)果（圖5 B）可以看出噬菌體vB_PmM_XNR經(jīng)不同的pH處理1 h后，pH值為2.0和12.0時噬菌體失活；而pH值在6.0～8.0范圍內(nèi)時酸堿度對噬菌體的活性影響不大。上述表明，vB_PmM_XNR具有較好的熱穩(wěn)定性和耐酸堿性，能夠滿足后續(xù)動物體內(nèi)治療的需要。

圖5 噬菌體vB_PmM_XNR的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性測定Fig.5 Determination of thermal and pH stability of vB_PmM_XNR

由表3可知，氯仿對噬菌體效價無顯著影響，說明噬菌體vB_PmM_XNR粒子表面不含有脂類物質(zhì)，對氯仿不敏感。

表3 噬菌體vB_PmM_XNR氯仿敏感性Table 3 Sensitivity to chloroform of vB_PmM_XNR

2.7 噬菌體對奇異變形桿菌的裂解作用

從圖6中可以看出，XNR對PM-XNR具有較好的裂解作用。XNR作用24 h后，細(xì)菌濃度下降3個數(shù)量級，由108CFU·mL-1降至105CFU·mL-（1清除效率約為99.9%）；而XNR效價從108PFU·mL-1增至109PFU·mL-1。PM-XNR濃度隨XNR作用時間延長不斷降低，XNR效價不斷增加，表明噬菌體XNR能夠持續(xù)有效抑制和清除細(xì)菌。

圖6 噬菌體XNR對奇異變形桿菌的裂解作用Fig.6 The lysis effect of phage XNR on Proteus mirabilis

3 討論與結(jié)論

近年來，奇異變形桿菌作為人獸共患的病原體，在人與動物中引起的感染頻繁發(fā)生[8]。特別是能夠感染寵物的病原菌，奇異變形桿菌就是其中之一。寵物與人類接觸密切，增加了人類感染性疾病患病幾率，對人類健康造成一定的威脅，同時也受到了廣泛的關(guān)注[25]。此外，廣譜抗生素的大量使用及濫用，導(dǎo)致臨床耐藥菌株的產(chǎn)生并且耐藥性不斷增加，這也為臨床治療帶來了較大的挑戰(zhàn)，成為嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)問題[12，26]。從大慶市農(nóng)大動物醫(yī)院患犬尿液中分離到奇異變形桿菌，該菌株具有溶血活性和產(chǎn)脲酶分解尿素，說明該菌株具有致病性，與寵物出現(xiàn)的感染性結(jié)石癥狀相吻合。

前期研究表明，多數(shù)奇異變形桿菌對氨基糖苷類與β-內(nèi)酰胺類藥物敏感[27-29]。林燕青等[30]對2016～2018年奇異變形桿菌耐藥性進行研究，發(fā)現(xiàn)奇異變形桿菌對氨芐西林、頭孢唑林、復(fù)方新諾明、呋喃妥因的耐藥率均＞50%，并且氨芐西林/舒巴坦的耐藥率從29.8%上升到42.6%；對慶大霉素的耐藥率從35.1%降到27.9%。奇異變形桿菌對頭孢他啶、頭孢吡肟、哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南、阿米卡星的耐藥率均＜6%。楊睿等[31]作用從腹瀉仔豬中分離的15株奇異變形桿菌均有多重耐藥性，其中13株含有3種以上的耐藥基因。結(jié)果表明，腹瀉仔豬中分離的奇異變形桿菌含有大量的耐藥基因和多重耐藥性，可以引起仔豬腹瀉癥狀，導(dǎo)致抗生素在臨床治療時不能發(fā)揮。試驗對分離的PM-XNR進行藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)PM-XNR對大多數(shù)藥物耐藥或不敏感，僅對四代頭孢吡肟敏感，超出正常寵物的臨床用藥，說明分離自犬的奇異變形桿菌耐藥性極強，這可能與人類或?qū)櫸锟咕幬锏氖褂貌划?dāng)和濫用存在一定聯(lián)系。同時，有研究表明將動物源和人源奇異變形桿菌菌株進行了毒力基因、表型方面進行比較，未發(fā)現(xiàn)不同來源菌株的毒力特征有明顯的差異[32]。說明犬源奇異變形桿菌對人類健康存在一定威脅。

噬菌體自發(fā)現(xiàn)之初便應(yīng)用于細(xì)菌性疾病的治療，并取得了良好的治療效果[33]。由于廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用，使噬菌體的研究逐漸被人們遺忘。1958年余賀利用噬菌體成功治愈了燒傷病人的綠膿桿菌感染，開創(chuàng)了國內(nèi)噬菌體治療的先河。隨著抗生素的大量及不正確的使用，導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性越來越嚴(yán)重，每年因細(xì)菌耐藥性死亡的人數(shù)也在逐漸攀升，據(jù)統(tǒng)計到2050年全球每年因細(xì)菌耐藥性死亡的人數(shù)達100萬人。噬菌體是一類能夠特異性地裂解宿主細(xì)菌，不污染環(huán)境、無殘留、不易產(chǎn)生耐藥性的病毒，有望成為抗生素的替代藥物。但是，目前臨床上針對奇異變形桿菌并沒有多少裂解性能較好的噬菌體。

研究針對犬源奇異變形桿菌從污水中成功分離到裂解性噬菌體vB_PmM_XNR，電子顯微鏡觀察vB_PmM_XNR具有二十面體頭部結(jié)構(gòu)和可收縮尾部，可判斷為肌尾噬菌體科。噬菌體感染復(fù)數(shù)（MOI）能夠表示出感染時噬菌體與細(xì)菌的數(shù)量比值，也是平均每個細(xì)胞感染噬菌體的數(shù)量，可應(yīng)用于制備高濃度噬菌體裂解液[34]。研究中，噬菌體XNR的MOI為0.01。按照噬菌體MOI繪制一步生長曲線，可以計算出潛伏期為15 min，爆發(fā)期持續(xù)40 min，爆發(fā)量為80 PFU·cell-1。這與大多數(shù)報道的噬菌體的潛伏期和爆發(fā)期結(jié)果基本相一致，但是爆發(fā)量各報道間差異較大[35-36]。

吸附過程是噬菌體能夠裂解細(xì)菌的重要步驟，多數(shù)研究表明，吸附過程極易遭受環(huán)境（pH、溫度、離子等）因素的影響，在應(yīng)用過程中，噬菌體還要保證在體內(nèi)（血液、消化液）等極端環(huán)境下生存[37-38]，因此，要求噬菌體對酸堿度、溫度等有一定的耐受性。vB_PmM_XNR在4℃至42℃之間滴度穩(wěn)定，滿足噬菌體吸附的最佳溫度范圍；pH 6.0～8.0范圍內(nèi)活性最好，具有體內(nèi)應(yīng)用治療的潛力。該噬菌體經(jīng)分離純化后，效價穩(wěn)定、較高，在適宜的條件下24 h可使奇異變形桿菌下降3個數(shù)量級，說明XNR具有較好的裂解效率，具有潛在應(yīng)用價值。噬菌體通過宿主菌及自限性繁殖，是噬菌體具有的基本特征。在裂解奇異變形桿菌的同時，XNR效價從108PFU·mL-1增至109PFU·mL-1，說明噬菌體在裂解細(xì)胞后能夠維持效價穩(wěn)定，并且有所增加，能夠發(fā)揮持續(xù)的裂解作用。

試驗從臨床尿石癥病犬尿液中分離獲得奇異變形桿菌。菌株具有溶血活性，能產(chǎn)生脲酶，具有耐藥性，滿足感染性結(jié)石癥的特征。以奇異變形桿菌分離株為宿主菌，分離出一株裂解性噬菌體，命名為vB_PmM_XNR。該噬菌體通過對其生物學(xué)特性、體外抗菌試驗表明具有治療和控制奇異變形桿菌引起泌尿系統(tǒng)感染的潛力。