李瑞明 賀昱霖 程 彬 魏志強(qiáng) 孟忠吉

十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)生物醫(yī)學(xué)研究所 (湖北 十堰，442000)

乙型肝炎病毒(HBV)感染呈全球分布，是導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞肝癌的重要原因之一[1，2]。HBV宿主范圍有限，組織嗜性狹窄，用于體外感染研究的原代人肝細(xì)胞來(lái)源困難，阻礙了對(duì)HBV完整生命周期特別是病毒感染早期過(guò)程的研究，因此有必要建立一種穩(wěn)定支持HBV感染的細(xì)胞模型。本研究在肝細(xì)胞系L-02中穩(wěn)定表達(dá)HBV感染功能性受體鈉離子牛磺膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(NTCP)，從而建立高表達(dá)hNTCP的L-02細(xì)胞系，并篩選HBV易感的克隆，為研究HBV入侵細(xì)胞的機(jī)制和抗病毒藥物篩選提供新的模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 質(zhì)粒、細(xì)菌和細(xì)胞細(xì)制備 質(zhì)粒hNTCP又名SLC10A1(Genebank編號(hào)：NM_003049，產(chǎn)品編號(hào)：CH890269)購(gòu)自維真生物，骨架質(zhì)粒為維真生物pENTER載體，含嘌呤霉素抗性基因。hNTCP基因通過(guò)限制性內(nèi)切酶AsiSI/MluI克隆至pENTER載體，同時(shí)在hNTCP基因C末端包含一個(gè)Flag標(biāo)簽(圖1)。大腸桿菌DH5a感受態(tài)購(gòu)自北京天根。人肝細(xì)胞系L-02為本室保存。復(fù)蘇后培養(yǎng)于含10% 滅活胎牛血清DMEM培養(yǎng)基。

圖1 hNTCP質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖

1.1.2 主要儀器和試劑 酶標(biāo)儀(德國(guó)Eppendorf)，定量PCR儀(美國(guó)ABI stepone plus)；熒光顯微鏡(日本Olympus IX71)；Chamber Slides(美國(guó)Thermo Fisher Scientific)；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、脂質(zhì)體Lipofectamine3000、Trizol購(gòu)自生命技術(shù)公司；FastQuant RT Kit(With gDNase)購(gòu)自北京天根；質(zhì)粒提取試劑盒、定量PCR試劑盒購(gòu)自羅氏公司；HBsAg和HBeAg EILISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自科美公司；Flag抗體DYKDDDDK Tag(D6W5B)Rabbit mAb 購(gòu)自CST公司；HBcAg兔多克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；嘌呤霉素購(gòu)自青島生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) hNTCP編碼區(qū)長(zhǎng)1 050 bp，使用NCBI Primer Blast在線設(shè)計(jì)hNTCP定量PCR引物，跨越第一個(gè)內(nèi)含子，產(chǎn)物全長(zhǎng)107 bp：NTCP-U TTGAGGCACTGGCCATCTTG，NTCP-D GTGGTCATCACAATGCTGAGGTT。使用ABI Primer Express設(shè)計(jì)HBV定量PCR引物及探針，擴(kuò)增區(qū)域位于HBV polyA序列(nt1828-nt1922)：PGP_v1(nt1828-nt1847)CACCTCTGCCTAATCATCTC，BC1_v2(nt1922-nt1903)TTATACGGGTCAATGTCCAT，HBV_qPCR_probe1(nt1853-nt1881)CATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTG，5′標(biāo)記6-FAM，3′標(biāo)記BHQ1。全部引物由上海生工合成。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及耐藥克隆篩選 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染參照Lipofectamine 3000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。在24孔板中每孔接種1×105個(gè)L-02細(xì)胞，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，轉(zhuǎn)染hNTCP真核表達(dá)質(zhì)粒0.5 μg/孔，培養(yǎng)24 h后，換液，加入含0.5 μg/ml嘌呤霉素培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 d，至對(duì)照組細(xì)胞全部死亡，繼續(xù)培養(yǎng)1周，顯微鏡下挑取全部耐藥克隆至96孔板繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 免疫熒光檢測(cè)hNTCP-flag表達(dá)及篩選高表達(dá)克隆 耐藥克隆在96孔板培養(yǎng)1周后，消化接種部分細(xì)胞至Chamber Slide，每孔鋪1×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，參照標(biāo)準(zhǔn)免疫熒光檢測(cè)流程檢測(cè)Flag標(biāo)簽。熒光顯微鏡下觀察陽(yáng)性數(shù)目細(xì)胞數(shù)目及熒光強(qiáng)度，選取最佳克隆繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 hNTCP mRNA水平的定量檢測(cè) 參照Trizol說(shuō)明書(shū)分離提取L-02-hNTCP細(xì)胞總RNA。參照FastQuant RT Kit(With gDNase)說(shuō)明書(shū)合成cDNA，Realtime PCR檢測(cè)hNTCP水平，擴(kuò)增參數(shù)：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火延伸20 s，循環(huán)40次。

1.2.5 HBV病毒感染L-02-hNTCP細(xì)胞 參照文獻(xiàn)[3]制備HBV感染性顆粒并制備感染性培養(yǎng)基(5×108GEq/ml)。在24孔板中每孔接種1.5×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，加入感染性培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS洗3遍后換普通培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，收集第3、5天培養(yǎng)上清用于HBV抗原ELISA檢測(cè)。第5天收集細(xì)胞抽提核衣殼相關(guān)HBV復(fù)制中間體，用于定量PCR檢測(cè)。

1.2.6 免疫熒光檢測(cè)HBcAg L-02-hNTCP細(xì)胞感染HBV 24 h后消化接種于Chamber Slide，培養(yǎng)24 h后按標(biāo)準(zhǔn)免疫熒光程序檢測(cè)HBcAg。

1.2.7 HBsAg和HBeAg的酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測(cè) 采用ELISA試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)上清中的HBsAg和HBeAg水平，參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.8 核衣殼相關(guān)HBV復(fù)制中間體的提取及定量檢測(cè) 核衣殼相關(guān)HBV復(fù)制中間體的提取參考文獻(xiàn)[4]。實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增參數(shù)：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火延伸20 s，循環(huán)40次。

2 結(jié)果

2.1 hNTCP穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞系L-02-hNTCP建立 hNTCP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染L-02細(xì)胞經(jīng)過(guò)嘌呤霉素篩選最終獲得92個(gè)耐藥克隆，對(duì)這些耐藥克隆進(jìn)一步檢測(cè)hNTCP-Flag表達(dá)水平，共篩出2個(gè)高表達(dá)克隆，取表達(dá)水平最高的細(xì)胞株命名為L(zhǎng)-02-hNTCP。

2.2 L-02-hNTCP細(xì)胞系中hNTCP-Flag的表達(dá)水平 免疫熒光結(jié)果顯示，L-02-hNTCP細(xì)胞能被Flag抗體特異結(jié)合，所有細(xì)胞都呈綠色，且陽(yáng)性區(qū)域主要集中于細(xì)胞膜。對(duì)照組L-02細(xì)胞全部為陰性。見(jiàn)圖2。

圖2 L-02-hNTCP細(xì)胞系中hNTCP-Flag的表達(dá)(200×)

2.3 共培養(yǎng)后的L-02-hNTCP細(xì)胞系中HBcAg表達(dá)水平 免疫熒光結(jié)果顯示，L-02-hNTCP細(xì)胞被HBcAb結(jié)合，呈現(xiàn)紅色熒光，對(duì)照組L-02細(xì)胞全部為陰性(圖3)。

圖3 HBV感染性培養(yǎng)基共培養(yǎng)后的L-02-hNTCP細(xì)胞系中HBcAg表達(dá)的免疫熒光檢測(cè)(200×)

2.4 L-02-hNTCP細(xì)胞hNTCP mRNA表達(dá)水平 Realtime RT-PCR相對(duì)定量結(jié)果顯示，相比于L-02細(xì)胞，L-02-NTCP細(xì)胞系中hNTCP 基因mRNA水平高出(1 205.45±199.49)倍。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳，在107 bp處L-02-hNTCP細(xì)胞有很亮的條帶，而L-02只有極弱的條帶(圖4)。

圖4 L-02-hNTCP細(xì)胞hNTCP mRNA水平(A.實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)hNTCP mRNA表達(dá)水平；B.PCR產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳)

2.5 HBV感染性培養(yǎng)基處理后L-02-hNTCP細(xì)胞上清中HBsAg和HBeAg水平 HBV感染性培養(yǎng)基處理后第3 d和第5 d，L-02-hNTCP細(xì)胞上清中檢測(cè)到高水平的HBsAg和HBeAg，而同樣經(jīng)過(guò)HBV感染性培養(yǎng)基處理的L-02細(xì)胞上清僅在第3 d能檢測(cè)到微量HBeAg。

2.6 HBV感染性培養(yǎng)基處理后L-02-hNTCP細(xì)胞內(nèi)可以檢測(cè)到高水平復(fù)制中間體 在24孔板中，ReaL-time PCR結(jié)果顯示，HBV感染性培養(yǎng)基共培養(yǎng)后的L-02-hNTCP細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制中間體拷貝數(shù)為(6.57±0.36)×106拷貝/孔。

圖5 HBV感染性培養(yǎng)基處理后L-02-hNTCP細(xì)胞上清中HBsAg和HBeAg水平

圖6 HBV感染性培養(yǎng)基處理后L-02-hNTCP細(xì)胞內(nèi)HBV 復(fù)制中間體水平

3 討論

HBV宿主范圍狹窄，缺乏穩(wěn)定易操作的動(dòng)物感染模型和細(xì)胞感染模型。常用的HepG2和Huh7細(xì)胞系不能被HBV感染。人原代肝細(xì)胞(PHH)、HepaRG細(xì)胞以及樹(shù)鼩原代肝細(xì)胞(PTH)可以用于研究HBV感染早期階段。但是，PHH獲取困難，成本高，可用性有限。HepaRG需要長(zhǎng)時(shí)間誘導(dǎo)分化且感染效率低下。人血清可與HBV顆粒競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到PTH細(xì)胞膜降低實(shí)驗(yàn)可信度[5-7]。2012年李文輝等[8]首次發(fā)現(xiàn)了HBV/HDV感染的功能性受體鈉離子?；悄懰徂D(zhuǎn)運(yùn)多肽(NTCP)，并證實(shí)穩(wěn)定表達(dá)hNTCP的HepG2細(xì)胞系可以被HBV感染，這為研究HBV感染早期過(guò)程和探索新治療方法提供了一個(gè)便捷的途徑。

本研究選用了實(shí)驗(yàn)室常用的L-02肝細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染hNTCP真核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)嘌呤霉素初篩及免疫熒光進(jìn)一步篩選獲得一株hNTCP高表達(dá)細(xì)胞系L-02-hNTCP。免疫熒光結(jié)果顯示hNTCP陽(yáng)性較強(qiáng)區(qū)域主要位于細(xì)胞膜，這與預(yù)期結(jié)果一致，hNTCP主要分布于細(xì)胞膜；大約30%的細(xì)胞具有很強(qiáng)的熒光信號(hào)，表明可以進(jìn)一步篩選得到更純的高表達(dá)hNTCP細(xì)胞系，以獲得對(duì)HBV的更高敏感性。經(jīng)HBV感染性培養(yǎng)基處理后，L-02-hNTCP細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到了HBcAg，表明病毒顆粒進(jìn)入了細(xì)胞內(nèi)；在培養(yǎng)基上清中檢測(cè)到HBsAg和HBeAg，說(shuō)明HBV侵入L-02細(xì)胞后開(kāi)始表達(dá)HBV相關(guān)抗原。但是與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染相比，HBsAg和HBeAg表達(dá)強(qiáng)度明顯偏低，可以參照文獻(xiàn)[9，10]在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中用更高濃度的藥物篩選及DMSO誘導(dǎo)刺激細(xì)胞分化以獲取高敏感穩(wěn)定表達(dá)的HBV感染細(xì)胞系；第5d在24孔板中培養(yǎng)L-02-hNTCP細(xì)胞中HBV復(fù)制中間體DNA拷貝數(shù)達(dá)到數(shù)量級(jí)106。

本研究構(gòu)建的L-02-NTCP穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系能被HBV感染性顆粒感染，并且表達(dá)HBV相關(guān)抗原，細(xì)胞內(nèi)能檢測(cè)到HBV DNA。在之前的研究中，我們建立了HBV臨床分離株的克隆方法，并成功克隆了7個(gè)野生型HBV克隆[11]，結(jié)合L-02-NTCP過(guò)表達(dá)細(xì)胞系將為進(jìn)一步研究HBV早期生命周期，以及探索治療HBV感染新技術(shù)提供了一個(gè)很好的細(xì)胞模型。