梁雪蘭　張志強(qiáng)　江洪波

摘要：目的：研究女貞子提取物對不同器官的抗氧化活性差異。方法：將女貞子用超聲提取后，用D101大孔樹脂分離為不同部位，進(jìn)行小鼠體內(nèi)抗氧化活性測試。用試劑盒檢測小鼠血清及心、肝、腎組織中（N1和對照組）MDA含量、SOD和GSHpx酶活性。結(jié)果：女貞子提取物及分離部位可顯著降低小鼠血清MDA含量，提高小鼠的血清及組織SOD和GSHpx活力。結(jié)論：女貞子提取物均具有體內(nèi)抗氧化活性，且對心肌有較高的選擇性。

關(guān)鍵詞：女貞子;抗氧化;D101大孔樹脂;水洗部位

補(bǔ)陰中藥女貞子，具有扶正固本的功效，分布非常廣泛，資源較為豐富，冬季女貞樹（Ligustrum lucidum Ait.）果實成熟，變?yōu)闉鹾跁r采收，女貞為木犀科植物女貞的干燥成熟果?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載將其列之為上品，味苦平，主補(bǔ)中，安五臟，養(yǎng)精神，除百病，具有較為廣泛的功效。現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)研究證明，女貞子其化學(xué)成分主要有三萜類、環(huán)烯醚萜苷類、黃酮類、多酚類、多糖、氨基酸、色素等多類化合物。女貞子與許多慢性疾病如骨質(zhì)疏松、高血壓、高血糖、高血脂、胃腸消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、衰老等有關(guān)，這些疾病均與人體內(nèi)累積過多的氧自由基存在某種關(guān)系[1]。許多學(xué)者研究表明女貞子提取物，及其含有的黃酮、環(huán)烯醚萜苷、酚類等化學(xué)成分有較強(qiáng)的清除自由基及抗氧化作用[2，3]。本文用女貞子的提取物，系統(tǒng)萃取分離后，用不同萃取部位制成混懸液或溶液對小鼠灌胃喂養(yǎng)，對照組小鼠灌胃純凈水，以此來研究女貞子提取物，提取物的不同萃取部位，喂養(yǎng)組小鼠與正常對照組小鼠血清中的超氧化物歧化酶（SOD）活力差異、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）及丙二醛（MDA）含量差異。用來判斷女貞子提取物及不同萃取部位體內(nèi)是否具有抗氧化作用，為女貞子的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)和支持，期望在抗氧化和抗衰老方面能做出相關(guān)產(chǎn)品。

1 實驗材料

1.1 材料

女貞子采自四川綿陽市涪城區(qū)四川醫(yī)專南山校區(qū)校園內(nèi)（樣品存于四川醫(yī)專北校區(qū)藥化實驗室內(nèi)，編號NZ2017），經(jīng)鄭雷博士鑒定為木犀科植物女貞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果實。

1.2 儀器設(shè)備

JP100S超聲波提取儀（深圳潔盟設(shè)備有限公司）;TU1900型雙光束紫外分光光度計（北京普析有限責(zé)任公司）。

1.3 試劑

D101大孔樹脂;DPPH（2，2二苯基1苦基肼，sigma）;谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒、丙二醛試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所）;其余試劑為分析純。

1.4 實驗動物

普通級昆明小白鼠，雌雄各半，11月齡，合格證編號：SYXK（川）2017113;小白鼠普通喂養(yǎng)飼料。

2 方法

2.1 女貞子測試樣品的準(zhǔn)備

取0.8千克女貞子，料液比1∶5，置于5000mL三角瓶中，用無水乙醇浸泡48小時候后，用超生提取器，提取液溫度30℃，提取3次，每次0.5h。合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，抽干，得147.4g浸膏，編號N1，冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ1約100g，攪拌分散于1000ml水中，上樣D101大孔樹脂柱，首先用蒸餾水洗脫至無色，出去高極性小分子單糖類等化合物，再用50%乙醇水溶液繼續(xù)洗脫，直至洗脫液變?yōu)闊o色。將各洗脫部分減壓濃縮，得女貞子水溶性部分浸膏（N2）54.5g和女貞子50%乙醇水溶液部浸膏（N3）39.8g。

2.2 體內(nèi)抗氧化作用研究

用小白鼠為實驗對象，通過喂養(yǎng)給藥，給藥四周后，通過試劑盒檢測小鼠血清中的MDA及GSHPx含量和及SOD活力，評價女貞子提取物及各部位在小白鼠體內(nèi)的抗氧化作用。

2.2.1 給藥方法及取樣方法

將小鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)5d后，隨機(jī)分成4組：對照組，女貞子粗提取物N1組，女貞子水溶性N2組和女貞子50%乙醇水溶液部N3組，雌雄各半，每組10只小鼠。普通對照組的小鼠采用0.9%生理鹽水灌胃，N1組，N2組和N3組分別灌胃女貞子提取物混懸液、女貞子水洗部溶液，女貞子50%乙醇水溶液洗部混懸液，灌胃給藥量為400mg/kg，一共給藥4周。實驗期間飼普通飼料喂養(yǎng)，自由攝食和飲水。實驗第28天小鼠空腹過夜，稱重后眼眶取血，離心分離血清（4℃，3000r/min，10min），并于-20℃保存待測。N1組和對照組小鼠取血后，頸椎脫臼處死，取心、肝、腎，以冰生理鹽水洗去浮血，濾紙吸干，稱重。再用預(yù)冷的PBS緩沖液（pH74，0.2mol/L）做勻漿介質(zhì)在冰浴下，將各器官組織進(jìn)行機(jī)械勻漿（1.0g濕組織加9.0ml緩沖液），后于4℃，離心10min（6000r/min），分離出上清液，-20℃保存待測。

2.2.2 檢測方法

GSHPx含量、SOD活力及MDA含量測定按照試劑盒說明書完成。

2.2.3 數(shù)據(jù)處理

最終的實驗數(shù)據(jù)用x±s形式表示，采用t檢驗，進(jìn)行顯著性檢驗，SPSS軟件統(tǒng)計、分析和比較。

3 結(jié)果（體內(nèi)抗氧化實驗）

3.1 血清中GSHPx、MDA含量及SOD活力比較

女貞子粗提取物（N1），提取物水溶性部位（N2）和提取物50%醇部位（N3）喂養(yǎng)組小鼠血漿內(nèi)的GSHPx活性、SOD含量均高，而MDA水平相比于對照組降低（p<0.01）。且N2組小鼠血漿內(nèi)的SOD，GSHPx活性（含量）比N3組及N1組高，且MDA水平最低。N1，N2和N3均有體內(nèi)抗氧化活性，且N2體內(nèi)抗氧化活性更佳。

3.2 組織中SOD活力，MDA及GSHPx含量（N1組）

由表2可知，女貞子提取物（N1）組小鼠的心肌和腎SOD活力均高于正常對照組，特別是心肌SOD活力顯著高于正常對照組，而肝組織中的SOD活力有所下降。N1組小鼠肝、腎的MDA含量分別低于和高于對照組，但變化不大，而心肌的MDA含量顯著低于對照組。N1組小鼠的肝、腎組織GSHpx活力值雖高于正常對照組，可是不是太明顯，但心肌的GSHpx活力比對照組較為明顯升高，顯示N1對心肌有一定的靶向性，GSHpx值的升高最為顯著。

4 討論

女貞子的乙醇提取物（N1）和，富集得到的水洗脫部位浸膏（N2）和50%乙醇洗脫部位浸膏（N3）清除DPPH自由基的能力都比較強(qiáng)，具有良好的自由基清除能力。經(jīng)D101大孔樹脂分離的水洗脫的N2部位主要含有水溶性的成分，如花青素、多酚類、環(huán)烯醚萜苷類等化學(xué)成分，清除DPPH·自由基的能力最強(qiáng)，參考文獻(xiàn)強(qiáng)于維生素C。N3主要含黃酮類成分，黃酮類的清除自由基的能力也較強(qiáng)，故N3比女貞子粗提取原液清除自由基能力強(qiáng)。體外清除自由基的能力強(qiáng)弱分別為：N2>N3>N1。

超氧化物歧化酶SOD是一種重要的金屬酶，存在于各種生物體內(nèi)的，它能催化生物氧化，使產(chǎn)生的O2轉(zhuǎn)變成H2O2和H2，減少對細(xì)胞的損傷，起到保護(hù)細(xì)胞的作用[5]。表1數(shù)據(jù)表明，小鼠的血清SOD水平高低為：N2組>N3組>N1組>對照組。血清GSHPx活力高低為：N2>N3>N1>對照組。丙二醛MDA為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，MDA水平的高低，間接反映生物體內(nèi)自由基生成與清除的平衡狀態(tài)。MDA含量高低為：對照組>N1>N3>N2。

喂食女貞子（N2）組小鼠血清中GSHPx含量，SOD水平最高，MDA含量最低，表明女貞子中的化合物有抗氧化作用。與對照組對比，GSHPx含量，SOD水平分別增加71%和15%，MDA含量降低17%。這表明各女貞子組均有提高體內(nèi)抗氧化能力的作用，但主要含有環(huán)烯醚萜苷類和花青素類等的N2組在體內(nèi)抗氧化能力提高最強(qiáng)。在某種程度上展示了體外清除DPPH·自由基能力與體內(nèi)抗氧化能力之間有一定的相關(guān)性。

喂食女貞子粗提物N1組小鼠的心肌中的SOD活力顯著高于對照組，MDA含量顯著低于對照組，GSHpx活力值高出正常對照組較為明顯，而肝腎組織中SOD，MDA，GSHpx指標(biāo)變化不是太明顯或略有下降。顯示了N1的抗氧化作用對心肌最強(qiáng)，對由于各種原因?qū)е碌男呐K自由基增多，都可能有較好的清除作用，從而起到保護(hù)心肌的作用。

女貞子在四川地區(qū)冬春季為鳥兒主要食物，且在我國分布廣泛，資源豐富，是一種比較理想的天然來源的抗氧化資源。因此對女貞子進(jìn)一步研究，并將其開發(fā)成為天然抗氧化產(chǎn)品有一定的可行性。女貞子產(chǎn)品可能對人體保障機(jī)體健康、預(yù)防疾病，特別是與自由基過多的心臟相關(guān)疾病有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]鐘秀倩.氧自由基與疾病[J].韶關(guān)學(xué)院學(xué)報：自然科學(xué)，2006，27（6）：8790.

[2]邊曉麗，王曉理，李金娜，等.6種抗衰老中藥清除氧自由基和抗脂質(zhì)過氧化作用的測定[J].西北藥學(xué)雜志，2001，16（2）：6869.

[3]劉新，夏雪奎，袁文鵬，等.女貞子體外抗氧化活性研究[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2010，34（4）：364365.

[4]趙艷紅，李建科，李國秀.天然抗氧化物體外活性評價方法的優(yōu)選與優(yōu)化[J].食品科學(xué)，2008，29（6）：6469.

[5]宮璀璀，鄭玉霞，鄭乃剛，等.金銀花在體內(nèi)抗氧化作用的實驗研究[J].實用醫(yī)藥雜志，2006，23（5）：584585.

基金項目：四川中醫(yī)藥高等專科學(xué)校項目基金：女貞子抗衰老研究（17ZRYB03）

作者簡介：梁雪蘭（1969—），男，漢族，四川南充人，本科，高級職稱，研究方向：中藥學(xué)應(yīng)用。

*通迅作者：江洪波，研究方向：中藥活性成分研究。