陳友紅,楊文豪,2,倪超
利用食管類器官研究在食管癌發(fā)生中的作用
陳友紅1,楊文豪1,2,倪超1
1. 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200433 2. 四川大學(xué)華西第二醫(yī)院小兒呼吸免疫科,成都 610041
基因在食管癌等多種惡性腫瘤中異常高表達(dá),但其參與癌癥發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚不完全清楚。為探究在食管癌發(fā)生中的作用,本文成功構(gòu)建了食管類器官作為研究模型,首先制備表達(dá)的慢病毒并通過(guò)高效侵染方法獲得了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的食管類器官。以正常食管類器官作為對(duì)照,使用ImageJ軟件分析感染7代后食管類器官的形態(tài),顯示食管類器官的上皮形態(tài)并未出現(xiàn)異常。隨后利用免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)和CCK8試劑檢測(cè)食管類器官的細(xì)胞增殖狀態(tài),結(jié)果顯示細(xì)胞增殖速度也沒(méi)有顯著改變。最后通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)(quantitative real-time PCR, qPCR)檢測(cè)細(xì)胞周期、細(xì)胞代謝以及常見(jiàn)的在食管癌中高表達(dá)基因的表達(dá)情況,結(jié)果顯示相關(guān)基因表達(dá)均未顯著升高。這些結(jié)果初步表明在食管中單獨(dú)過(guò)表達(dá)基因不足以誘導(dǎo)食管上皮細(xì)胞癌化。本文建立了食管類器官研究模型,通過(guò)高效的慢病毒過(guò)表達(dá)體系研究了原癌基因?qū)κ彻茴惼鞴侔l(fā)育和增殖的潛在影響。這對(duì)于食管類器官模擬食管發(fā)育和食管癌發(fā)生相關(guān)研究具有一定參考意義。
食管癌;食管類器官;過(guò)表達(dá);慢病毒侵染
食管癌預(yù)后差、生存率低,原因在于早期無(wú)癥狀而檢測(cè)到的食管癌大多數(shù)都處于晚期高級(jí)別,極大增加了治療難度[1~3]。探究食管癌發(fā)生過(guò)程中的分子學(xué)和細(xì)胞學(xué)機(jī)制能夠改善早期診斷策略[4~6]。研究表明,在人類癌癥中大部分腫瘤的發(fā)生與很多基因突變或異常表達(dá)密切相關(guān)(如、、等)[7~9]。
是一個(gè)常見(jiàn)的原癌基因,正常情況下其表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控。主要通過(guò)作為轉(zhuǎn)錄因子與伴侶蛋白MAX形成二聚體,調(diào)控大量下游基因的表達(dá)。當(dāng)其異常表達(dá)時(shí)往往導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞代謝等過(guò)程的異常以及腫瘤形成。研究發(fā)現(xiàn)在胰腺癌、肝癌、肺癌以及食管癌等腫瘤中均檢測(cè)到的突變或異常表達(dá)[10~14],也有報(bào)道顯示參與肝癌起始過(guò)程并且單獨(dú)過(guò)表達(dá)就能誘發(fā)肝癌發(fā)生[15],但在食管癌發(fā)生過(guò)程的作用機(jī)制尚不清楚。
類器官是原始干細(xì)胞或成體干細(xì)胞在體外3D環(huán)境下培養(yǎng)形成的結(jié)構(gòu)與功能均高度接近成體組織的結(jié)構(gòu),是新興的體外研究模型[16,17]。傳統(tǒng)的研究模型(主要有細(xì)胞系和小鼠品系)存在細(xì)胞系細(xì)胞類型單一和某些小鼠品系胚胎致死導(dǎo)致無(wú)法進(jìn)行后續(xù)研究的問(wèn)題,而類器官的出現(xiàn)則能彌補(bǔ)上述不足。類器官既具有與成體組織相同的細(xì)胞類型和結(jié)構(gòu),又能夠特定地研究組織的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)[18]。由食管永生化上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)形成的器官類似物以及成體干細(xì)胞來(lái)源的食管類器官是近年來(lái)用于研究食管上皮的主要體外3D模型,已被廣泛應(yīng)用于研究食管的發(fā)育及疾病發(fā)生[19~22]。其中成體干細(xì)胞來(lái)源的食管類器官培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單,同時(shí)能夠通過(guò)單細(xì)胞形成,因而具有廣闊的應(yīng)用前景。
本文將小鼠成體組織來(lái)源的食管在基質(zhì)膠中培養(yǎng)形成食管類器官,通過(guò)高效的慢病毒侵染方法在食管類器官中過(guò)表達(dá)。在此基礎(chǔ)上,初步探究了在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用,發(fā)現(xiàn)的單獨(dú)過(guò)表達(dá)對(duì)于食管類器官的形態(tài)、增殖和代謝以及食管癌相關(guān)的基因表達(dá)等無(wú)顯著影響,提示基因的過(guò)表達(dá)不足以有效誘導(dǎo)食管癌化。這一發(fā)現(xiàn)有助于加深對(duì)食管癌發(fā)生過(guò)程的理解,為后續(xù)食管類器官研究提供一定方法參照。
本實(shí)驗(yàn)所用小鼠為/品系6~8周雄性小鼠,購(gòu)買(mǎi)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司;組裝慢病毒所用293細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。
取得新鮮的小鼠食管組織,剪碎后移至1.5 mL Eppendorf管中加入已預(yù)熱的消化液(消化液組成:0.25 mg/mL Pronase E,400 U/mL Collagenase I,20 U/mL DNase I),于37℃搖床100 r/min消化1 h。充分混勻,1000 r/min離心3 min,棄上清,用PBS洗2次。40 μm濾網(wǎng)過(guò)濾獲得單細(xì)胞懸液,1000 r/min離心3 min,細(xì)胞沉淀置于冰上備用。取適量已解凍的基質(zhì)膠液重懸細(xì)胞,混勻后鋪于24孔板中(30 μL/孔),37℃靜置15 min,待基質(zhì)膠凝固充分加入500 μL體積液體培養(yǎng)基覆蓋于表面,接著于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2~3天換液,通常培養(yǎng)10~12天后傳代。食管類器官培養(yǎng)基[23]組成為:Advanced DMEM/F12 (12634028,Thermofisher,美國(guó))中添加1xGlutamax (35050061,Gibco,美國(guó));1xHEPES (15630080,Gibco,美國(guó));1 mmol/L N- acetylcysteine (A9165-5g,Sigma,美國(guó));10 mmol/L Nicotinamide (N0636,Sigma,美國(guó));1xPenicillin- streptomycin (15140122,Gibco,美國(guó));1xB27 (17504044,Gibco,美國(guó));10 μmol/L Y27632 (13624,Cell Signaling Technology,美國(guó));10 mmol/L SB202190 (8158,Cell Signaling Technology,美國(guó)),500 nmol/L A8301 (75073,Cell Signaling Technology,美國(guó)),100 μmol/L Gastrin (3006,R&D,美國(guó)),100 ng/mL R-sondin1 (4645-RS,R&D,美國(guó)),100 ng/mL Noggin (6057-NG,R&D,美國(guó)),50 ng/mL EGF (236-NG,R&D,美國(guó))。
食管類器官傳代方法:輕刮下類器官并轉(zhuǎn)移至Eppendorf管中,1000 r/min離心3 min,去上清。用已預(yù)熱的1xTryplE (2216499,Gibco,美國(guó))消化液500 μL重懸,混勻后于37℃靜置5~10 min。待消化充分后用終止消化,用PBS洗2次,以約5000個(gè)細(xì)胞接種到24孔板按上述步驟進(jìn)行3D培養(yǎng)。基質(zhì)膠(matrigel) (#356231)購(gòu)自Corning公司。Pronase E (107433),Collagenase I (C0130),DNase I (10104159001)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。
病毒過(guò)表達(dá)載體為pLVX-P2A-Puro-GFP,由本實(shí)驗(yàn)室改造而成。慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2 (#12260)、pMD2G (#12259)均購(gòu)自美國(guó) Addgene 公司?;蜻^(guò)表達(dá)的慢病毒包裝時(shí),在生長(zhǎng)于10 cm 皿中密度為80%左右的293T細(xì)胞中,加入含10 μL vigofect、7 μg pLVX-、2 μg psPAX2、5 μg pMD2G的DMEM溶液,6 h后更換為完全培養(yǎng)基培養(yǎng),48 h后收集上清,用0.45 μm濾膜過(guò)濾。收集上述慢病毒上清,45,000 r/min離心2 h,適量體積PBS溶解病毒沉淀,從而獲得高濃度的慢病毒,于?80℃保存。此后,取1 μL慢病毒感染293T細(xì)胞,觀察熒光強(qiáng)度并用qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下游基因表達(dá)情況,檢驗(yàn)慢病毒的有效性。
感染食管類器官時(shí),先將類器官消化成單細(xì)胞懸液。感染培養(yǎng)基為在食管類器官培養(yǎng)基中加入適量慢病毒(約20 μL濃縮病毒,聚凝胺濃度為10 μg/mL,總體積250 μL的混合液)。將感染培養(yǎng)基與食管單細(xì)胞懸液混合均勻,隨后加入到48孔板中,封口膜密封后于孔板離心機(jī)中32℃條件下2000 r/min離心1 h。接著轉(zhuǎn)移至37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h。室溫1000 r/min離心3 min,去上清,用30 μL基質(zhì)膠重懸細(xì)胞沉淀,按1.2所述方法進(jìn)行3D培養(yǎng)。約72 h于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光所占比例,加入2 μg/mL的嘌呤霉素(puromycin)進(jìn)行篩選,培養(yǎng)2代之后即可獲得穩(wěn)定高比例表達(dá)目的基因的食管類器官。
基因cDNA的來(lái)源于人肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。NCBI中的轉(zhuǎn)錄本編號(hào)為Myc-206,全長(zhǎng)1365 bp。上游克隆引物為:5′-GAATTCTGGATTTTTTTCGG-GTAGTGGAAAACCAGCA-3′,下游克隆引物為:5′- ACTAGTTACGCACAAGAGTTCCGTAGCTGTTCAA- 3′,由蘇州金唯智公司合成。Vigofect轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)買(mǎi)自北京威格拉斯生物技術(shù)有限公司。嘌呤霉素(A610593)購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司。
選取培養(yǎng)8~10天的成熟的食管類器官,收集于Eppendorf管里。以600~800 r/min離心3 min,用4%PFA 重懸混勻食管類器官,于4℃固定5 h。PBS洗一次,600 r/min離心后用0.25% tryton 100×500 μL重懸并透膜30 min。離心600 r/min,去上清。用5%BSA作為封閉液,用量500 μL重懸食管類器官,常溫靜置1 h。離心去上清,加入配置好的抗體液(c-Myc,Ki67均以1:100濃度配制) 50 μL與類器官混勻,隨后4℃條件靜置過(guò)夜。接著用PBST緩沖液洗3次,10 min/次。加入配置好的二抗(CY3抗體濃度1∶200,647二抗?jié)舛葹?∶400,Hoechst33342濃度為1∶1000),靜置冰浴1 h。隨后用PBST緩沖液洗3次,10 min/次,將類器官轉(zhuǎn)移至粘附載玻片上,滴加抗熒光淬滅封片劑,蓋上蓋玻片完成封片。待凝固充分后用共聚焦顯微鏡觀察并拍照,?20℃保存。
抗體(#18351)和Ki67抗體(#9449)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司,P63抗體(ab124762)與二抗CY3(A10520)、647(A32728)均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司,KRT13抗體(66684-1-Ig)購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。Hoechst33342 (A3472)購(gòu)自美國(guó)APExBIO公司。
選取培養(yǎng)8~10天的食管類器官,收集于Eppen-dorf管。1000 r/min離心3 min,去上清,用微量樣品RNA提取試劑盒(天根生物科技)提取RNA。取1 μgRNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega,美國(guó))逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,稀釋10倍至200 μL,并于–20℃長(zhǎng)期保存,后續(xù)的定量PCR (qPCR)則在此濃度的情況下使用1 μL作為模板。在qPCR儀中以10 μL體系進(jìn)行反應(yīng),每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,所用2×SYBR Green qPCR Master Mix(B21702)為美國(guó)Bimake公司提供。反應(yīng)的溫度體系設(shè)置為:95℃ 15 min;95℃ 15 s,
60℃ 30 s,40個(gè)循環(huán);95℃ 10 s,65℃~95℃(每隔5 s增加0.5℃)。反應(yīng)引物序列如表1所示,所有引物均是在NCBI官網(wǎng)設(shè)計(jì)并進(jìn)行Blast (https://www. ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/),由金唯智公司合成。根據(jù)Ct值,以為內(nèi)參,根據(jù)2–ΔΔCt法分析各基因的相對(duì)表達(dá)量。
表1 qPCR引物序列
“h-”表示human,“m-”表示mouse。“-總”為能同時(shí)檢測(cè)內(nèi)源和外源的引物;:cyclin;:cyclin dependent kinase;,ornithine decarboxylase;:nicotinamide phosphoribosyltransferase;:metastasis-associated protein 1;:lactate dehydrogenase A;:nuclear respiratory factor 1;:3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme a reductase。
取成熟的食管類器官,消化制備單細(xì)胞懸液。用luna-fl雙熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Luf-14-00980,韓國(guó))計(jì)數(shù)確定細(xì)胞濃度。按1500細(xì)胞/孔接種到96孔板進(jìn)行3D培養(yǎng)。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別各鋪9個(gè)孔。分別于Day1,Day4,Day5用CCK8試劑(APExBIO- K1018,美國(guó))檢測(cè)對(duì)應(yīng)組3個(gè)孔的細(xì)胞活性。每個(gè)96孔添加10 μL的CCK8試劑(與90 μL培養(yǎng)基混合),隨后于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h,接著直接將96孔板于酶標(biāo)儀檢測(cè)480 nm處的吸光值,統(tǒng)計(jì)吸光值并用Graphpad8軟件分析結(jié)果。
取成熟的食管類器官,消化制備單細(xì)胞懸液。用luna雙熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)確定細(xì)胞濃度。按500細(xì)胞/孔接種到96孔板進(jìn)行3D培養(yǎng)。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各設(shè)置5個(gè)孔。于Day4時(shí)統(tǒng)計(jì)每個(gè)96孔中食管類器官的數(shù)量,此時(shí)的食管類器官通常直徑大于30 μm。計(jì)算其由單細(xì)胞形成類器官數(shù)與細(xì)胞數(shù)的比值,定義為類器官形成率(%)。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組各取3個(gè)孔的值(去掉最高值與最低值),比較類器官形成能力。
選取成熟的食管類器官,消化制備單細(xì)胞懸液,使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)確定細(xì)胞懸液的濃度。以3000細(xì)胞/孔接種到24孔板中進(jìn)行3D培養(yǎng),每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,利用顯微鏡觀察并拍照。根據(jù)收集的JPEG格式的照片,使用圖片分析軟件ImageJ分析圖中類器官的大小(平均面積),每個(gè)組累積統(tǒng)計(jì)100個(gè)類器官,選取同樣的計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)面積統(tǒng)計(jì)結(jié)果用Graphpad8軟件做出箱型圖,并分析對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的形態(tài)與大小的差異。
對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)用Graphpa8處理并繪圖,兩組間的差異性評(píng)估采用檢驗(yàn)評(píng)估。數(shù)據(jù)顯著性用*標(biāo)注。*:<0.05;**:<0.01;***:<0.001;ns:>0.05,無(wú)顯著差異。
成熟的食管復(fù)層鱗狀上皮主要由單層具有干性的基底細(xì)胞(basal cell)和多層不同程度分化的上基層細(xì)胞(suprabasal cell)組成,基底細(xì)胞和上基層細(xì)胞的主要標(biāo)志物分別為和cytokeratin 13 ()?;准?xì)胞被認(rèn)為是食管上皮干細(xì)胞,能夠不斷增殖并向內(nèi)移動(dòng)形成不同程度分化的上基層細(xì)胞,最終高度角質(zhì)化并從食管腔內(nèi)脫落。通過(guò)這樣的動(dòng)態(tài)過(guò)程維持食管上皮的自我更新與穩(wěn)態(tài)。
本研究分離了小鼠食管組織,將其消化制備成單細(xì)胞懸液,隨后在基質(zhì)膠中進(jìn)行3D培養(yǎng)。通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中Wnt信號(hào)通路激活劑的用量,我們獲得了可以穩(wěn)定傳代(7代以上)的3D培養(yǎng)物。培養(yǎng)約10天形成的3D培養(yǎng)物如圖1所示,從近乎單細(xì)胞狀態(tài)開(kāi)始,約3天時(shí)間逐漸增大形成透亮的小球狀結(jié)構(gòu);到8~10天時(shí),小球體逐漸長(zhǎng)成清晰可見(jiàn)的實(shí)心囊狀物,顏色逐漸加深。整個(gè)過(guò)程中生長(zhǎng)狀態(tài)良好,且形態(tài)與食管上皮形態(tài)高度相近。
為進(jìn)一步證實(shí)食管培養(yǎng)物為食管類器官,我們通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)鑒定3D培養(yǎng)物的細(xì)胞組成。結(jié)果如圖2所示,3D培養(yǎng)物最外層細(xì)胞細(xì)胞核表達(dá)P63,而內(nèi)層細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)則表達(dá)KRT13,這與成熟食管上皮細(xì)胞標(biāo)志物一致。綜上所述,形態(tài)分析和細(xì)胞類型鑒定結(jié)果表明本研究成功建立了食管類器官。
為探究的功能,我們嘗試借助于高效的慢病毒侵染方法在食管類器官中過(guò)表達(dá)。首先構(gòu)建表達(dá)基因的慢病毒載體,隨后利用高效侵染方法獲得過(guò)表達(dá)的食管類器官,并通過(guò)qPCR和免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)。
2.2.1 慢病毒構(gòu)建與驗(yàn)證
過(guò)表達(dá)慢病毒載體的核心元件如圖3A所示,如果慢病毒成功侵染類器官,則感染后的食管類器官會(huì)顯示綠色熒光(coGFP)并具有嘌呤霉素(puromycin)抗性,能夠非常方便我們進(jìn)行觀察和篩選。為檢驗(yàn)構(gòu)建的慢病毒的有效性,我們用慢病毒感染293T細(xì)胞,觀察綠色熒光情況并用qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下游基因的表達(dá)。結(jié)果顯示293T細(xì)胞均高表達(dá)綠色熒光,同時(shí)下游基因均顯著高表達(dá),說(shuō)明慢病毒高效感染293T細(xì)胞并表達(dá)外源(圖3,B和C),表明我們成功構(gòu)建了表達(dá)的慢病毒。
圖1 小鼠食管消化后的單細(xì)胞在3D培養(yǎng)條件下形成囊狀實(shí)心結(jié)構(gòu)
A~E:小鼠食管組織被消化成單細(xì)胞后培養(yǎng)9天形成實(shí)心囊狀物的過(guò)程;F:圖E的局部放大圖。
圖2 食管類器官表達(dá)食管上皮細(xì)胞標(biāo)志物P63和KRT13
培養(yǎng)至P1D9的食管類器官,使用抗體P63和KRT13進(jìn)行免疫熒光染色結(jié)果。Hoechst33342試劑染細(xì)胞核,顯示為藍(lán)色;P63染基細(xì)胞細(xì)胞核,顯示為紅色;KRT13染上基層細(xì)胞細(xì)胞質(zhì),顯示為綠色。
圖3 成功構(gòu)建表達(dá)外源基因的慢病毒
A:慢病毒質(zhì)粒載體核心元件示意圖。CMV為啟動(dòng)子,MCS表示多克隆位點(diǎn)(multiple cloning site)。B:慢病毒感染293T細(xì)胞72 h之后觀察綠色熒光的結(jié)果。C:qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下游基因表達(dá)情況。*:<0.05;**:<0.01。
2.2.2 食管類器官的高效感染與篩選
類器官感染通常采用直接將慢病毒與單細(xì)胞混合培養(yǎng)的感染方法,但這種方法在食管類器官中感染效率不高且細(xì)胞存活率低[24~27]。為高效獲得過(guò)表達(dá)的食管類器官,我們采用離心感染法。研究表明該方法能增加細(xì)胞與慢病毒接觸幾率并能提高細(xì)胞存活率。未進(jìn)行慢病毒感染的正常食管類器官在含2 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天之內(nèi)就會(huì)死亡。而慢病毒感染后類器官能夠在含2 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基中正常培養(yǎng)、傳代,第1代第9天(記為P1D9)觀察熒光情況如圖4所示,初步顯示慢病毒高效感染食管類器官。
進(jìn)一步我們通過(guò)qPCR和免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)總的表達(dá)情況,結(jié)果如圖5A和B所示,均顯示基因的顯著高表達(dá)。綜上所述,我們成功建立了過(guò)表達(dá)基因的食管類器官。
2.3.1過(guò)表達(dá)對(duì)食管的類器官形態(tài)的影響
組織形態(tài)紊亂是腫瘤的特征之一。為探究是否具有誘導(dǎo)食管癌發(fā)生的能力,我們首先分析了過(guò)表達(dá)食管類器官的形態(tài)體積的變化情況。感染后的類器官連續(xù)傳代培養(yǎng),對(duì)每一代的食管類器官生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行詳細(xì)觀察和拍照記錄,結(jié)合軟件ImageJ分析類器官的大小(平均面積),利用軟件Graphpad做出箱型圖并分析差異。從圖6A中可以看出,食管類器官長(zhǎng)期穩(wěn)定傳代后,對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組相比同時(shí)期的形態(tài)沒(méi)有顯著差異;而從圖6B和6C中對(duì)應(yīng)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的食管類器官平均面積沒(méi)有顯著差異(>0.05)。綜上所述,過(guò)表達(dá)后食管類器官的形態(tài)和平均面積均沒(méi)有出現(xiàn)顯著性變化。
2.3.2過(guò)表達(dá)對(duì)食管類器官增殖的影響
腫瘤組織通常表現(xiàn)出增殖異?,F(xiàn)象。為探究過(guò)表達(dá)對(duì)食管增殖的影響,我們首先用Ki67抗體進(jìn)行免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)食管類器官細(xì)胞增殖水平。結(jié)果如圖7所示,過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組的Ki67表達(dá)量相同,且表達(dá)位置都在基底細(xì)胞,說(shuō)明過(guò)表達(dá)后Ki67的表達(dá)并沒(méi)有升高,即細(xì)胞的增殖水平?jīng)]有增加。
圖4 食管類器官的慢病毒感染與篩選
慢病毒感染后的食管類器官在含2 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至P1D7(即第1代第7天)的綠色熒光觀察結(jié)果。
圖5 qPCR和免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)顯示高效獲得過(guò)表達(dá)c-Myc的食管類器官
A:感染后培養(yǎng)9天(P1D9)用qPCR檢測(cè)總的表達(dá)量;B:培養(yǎng)9天(P1D9)的食管類器官進(jìn)行免疫熒光染色實(shí)驗(yàn),用抗體檢測(cè)的表達(dá)量。IF,Immunofluorescent staining method。***:<0.001。
圖6 c-Myc過(guò)表達(dá)對(duì)食管類器官的形態(tài)和大小均無(wú)顯著影響
A:慢病毒感染后的類器官進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)的過(guò)程,每代培養(yǎng)8~10天,所示為第一代、第四代、第7代培養(yǎng)9天后的生長(zhǎng)情況;B:對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組類器官平均面積比較(P4D9);C:對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組類器官平均面積比較結(jié)果(P7D9)。ns:>0.05,無(wú)顯著差異。
圖7 免疫熒光染色顯示Ki67的表達(dá)無(wú)顯著變化
慢病毒感染后的食管類器官,用抗體Ki67進(jìn)行免疫熒光染色的結(jié)果。
食管復(fù)層鱗狀上皮由食管上皮干細(xì)胞增殖分化形成并維持穩(wěn)態(tài),因此食管類器官的形成能力也反映了食管上皮細(xì)胞的增殖能力。我們通過(guò)將食管類器官消化成單細(xì)胞后,取相同數(shù)量的單細(xì)胞,計(jì)算其形成類器官的能力,評(píng)估過(guò)表達(dá)對(duì)食管上皮細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)不能促進(jìn)食管類器官形成能力的增加,提示過(guò)表達(dá)不能導(dǎo)致食管上皮細(xì)胞增殖升高(圖8A)。
為進(jìn)一步探究過(guò)表達(dá)對(duì)食管細(xì)胞增殖影響,我們利用CCK8 試劑檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。圖8B所示為不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)食管類器官的吸光值的統(tǒng)計(jì)結(jié)果??梢钥闯?,過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組食管類器官在480 nm處的吸光值強(qiáng)度沒(méi)有顯著性差異(>0.05),即CCK8試劑檢測(cè)結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)后食管類器官的增殖活性未出現(xiàn)異常增高情況。
綜上所述,我們的研究結(jié)果表明過(guò)表達(dá)不能導(dǎo)致食管上皮細(xì)胞出現(xiàn)類似腫瘤的細(xì)胞增殖異常升高現(xiàn)象。
的異常表達(dá)往往導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝相關(guān)基因的異常高表達(dá),進(jìn)而驅(qū)動(dòng)腫瘤的發(fā)生。為探究過(guò)表達(dá)基因是否具有促進(jìn)食管癌發(fā)生的能力,我們利用qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了下游與細(xì)胞周期、代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況。其中細(xì)胞周期相關(guān)基因包括、、、、與[15];細(xì)胞代謝相關(guān)基因包括、、、、與[28~30]。結(jié)果表明在食管類器官中過(guò)表達(dá)后,細(xì)胞周期、細(xì)胞代謝相關(guān)的基因表達(dá)情況均未出現(xiàn)異常升高情況(圖9)。
腫瘤的發(fā)生往往伴隨著常見(jiàn)腫瘤相關(guān)基因的異常表達(dá)。為探究是否具有誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的能力,我們利用qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了常見(jiàn)的食管癌中異常高表達(dá)基因的表達(dá)情況。其中食管鱗癌中報(bào)道高頻過(guò)表達(dá)的基因包括和等;在食管腺癌中報(bào)道高頻過(guò)表達(dá)的基因包括、和等[4,7]。qPCR檢測(cè)結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)后,食管癌相關(guān)基因的表達(dá)均未出現(xiàn)顯著升高的情況(圖10)。
食管癌是全球最高發(fā)的癌癥之一。通過(guò)尋找相關(guān)腫瘤標(biāo)志物和探究食管癌發(fā)生過(guò)程中相關(guān)的分子機(jī)制對(duì)于改善食管癌的早期診斷策略具有重要意義。由于通常情況下病人來(lái)源的樣本不易獲得,建立小鼠成體組織來(lái)源的食管類器官具有重要意義。本研()的食管類器官,為研究食管發(fā)育和疾病發(fā)生提供了一個(gè)良好的模型。
圖8 食管類器官形成能力與用CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況
A:相同細(xì)胞數(shù)培養(yǎng)形成的食管類器官數(shù)與對(duì)應(yīng)細(xì)胞數(shù)的比例(食管類器官形成率);B:添加CCK8后測(cè)定吸光值(480 nm)。*:<0.05;ns:>0.05,無(wú)顯著差異。
圖9 q-PCR檢測(cè)c-Myc下游與細(xì)胞周期、代謝相關(guān)的基因表達(dá)情況
A:下游與細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)量;B:下游與細(xì)胞代謝相關(guān)基因的表達(dá)量。*:<0.05;**:<0.01;ns:>0.05,無(wú)顯著差異。
圖10 食管癌相關(guān)基因的表達(dá)情況
qPCR檢測(cè)食管癌相關(guān)基因表達(dá)情況。結(jié)果顯示均無(wú)顯著性差異(ns:>0.05)。
究成功建立了小鼠成體組織來(lái)源的食管類器官,并且采用了高效的慢病毒侵染方法獲得了過(guò)表達(dá)外源基因組織形態(tài)紊亂、細(xì)胞增殖與細(xì)胞代謝異常以及癌癥相關(guān)基因的異常高表達(dá)是腫瘤的常見(jiàn)特征。在食管癌中異常高表達(dá)且有報(bào)道其參與腫瘤發(fā)生過(guò)程,但其在食管癌發(fā)生中的作用機(jī)制有待深入研究。為探究在食管癌發(fā)生中的作用機(jī)制,我們嘗試在食管類器官中過(guò)表達(dá),預(yù)期可能會(huì)誘導(dǎo)食管上皮癌化。然而我們多方面的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示:過(guò)表達(dá)的食管類器官并未出現(xiàn)上述可能的癌化特征。
基因作為轉(zhuǎn)錄因子和原癌基因,它的異常高表達(dá)引起很多下游基因的異常表達(dá)如核糖體代謝、線粒體代謝、細(xì)胞周期等相關(guān)基因[28],從而導(dǎo)致疾病甚至癌癥的發(fā)生[28,29,32,33]。據(jù)中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心惠利健課題組報(bào)道基因的過(guò)表達(dá)能夠誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生,在類器官水平就已顯示細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂,異常增生以及線粒體代謝的異?;钴S[15]。而基因作為一個(gè)在食管腺癌和食管鱗癌中都高頻異常高表達(dá)的基因[13,14],有報(bào)道顯示在食管鱗癌細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)基因能夠促進(jìn)(programmed cell death ligand 1)[34,35]分子的表達(dá),從而使得腫瘤細(xì)胞逃逸免疫系統(tǒng)的識(shí)別和攻擊。然而這些研究都是以食管癌細(xì)胞系或食管癌來(lái)源的類器官作為研究模型,真正關(guān)于在食管癌起始過(guò)程中是否具有重要作用目前未見(jiàn)報(bào)道。通常在病變中檢測(cè)到的異常高表達(dá)大多數(shù)只是3~4倍左右,少數(shù)達(dá)到10倍[36],即在這種情況下往往就會(huì)導(dǎo)致下游相關(guān)基因的異常表達(dá)并導(dǎo)致增殖、代謝異常。然而我們導(dǎo)入的外源基因檢測(cè)顯示顯著高表達(dá),卻沒(méi)有檢測(cè)到相關(guān)基因的異常高表達(dá)。此外我們還檢測(cè)了部分常見(jiàn)的在食管癌中異常高表達(dá)的基因的表達(dá)情況,過(guò)表達(dá)基因的食管類器官也未檢測(cè)到這些基因異常高表達(dá)(盡管這些食管癌相關(guān)基因只具有有限的代表意義)。這些結(jié)果綜合表明單獨(dú)過(guò)表達(dá)基因不足以誘導(dǎo)食管癌化的發(fā)生,同時(shí)也提示食管癌的發(fā)生更有可能是多個(gè)基因突變或異常表達(dá)積累的結(jié)果。因此,為建立食管癌誘導(dǎo)模型,我們正在開(kāi)展在現(xiàn)有過(guò)表達(dá)基因的食管類器官基礎(chǔ)上引入更多的基因突變的工作。例如在食管腺癌和鱗癌中均有出現(xiàn)高頻突變的基因和基因等。
此外,需要指出的是圖5B顯示似乎在基底細(xì)胞中的表達(dá)較低。為驗(yàn)證是否在兩類細(xì)胞中的表達(dá)模式有差異,我們又對(duì)成熟食管類器官(Day7)與早期食管類器官(Day3)進(jìn)行了P63和的共定位染色(附圖1,附圖2)。結(jié)果顯示在早期食管類器官中在所有干細(xì)胞中均高表達(dá),而在后期成熟的食管類器官中基底細(xì)胞中表達(dá)比例較低;而在上基層細(xì)胞中的表達(dá)量則一直較高。這提示可能在食管基底細(xì)胞和上基層細(xì)胞中的蛋白穩(wěn)定性有差異,進(jìn)一步提示可能在基底細(xì)胞中存在抑制表達(dá)的信號(hào)。這可能是不能導(dǎo)致食管類器官癌化的原因之一。
綜上所述,本文建立的食管類器官與所采用的高效慢病毒感染方法為研究食管癌及相關(guān)疾病發(fā)生的分子機(jī)制提供了一個(gè)良好模型。并且本文利用該模型探究了基因在食管癌發(fā)生中的作用,表明單獨(dú)過(guò)表達(dá)基因不足以誘導(dǎo)食管癌化的發(fā)生。后續(xù)的研究將在現(xiàn)有過(guò)表達(dá)基因的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究多基因共同作用誘導(dǎo)食管癌形成的可能性。
附錄:
附加材料詳見(jiàn)文章電子版www.chinagene.cn。
附圖1 成熟食管類器官中與P63共定位結(jié)果
Supplemental Fig. 1 Co-localization ofand P63 in mature esophageal organoid
用抗體與P63對(duì)培養(yǎng)7天(Day7)的成熟食管類器官進(jìn)行免疫熒光染色。圖中白色箭頭顯示了同時(shí)表達(dá)-與P63的基底細(xì)胞。
附圖2 早期食管類器官中c-與P63共定位結(jié)果
Supplemental Fig. 2 Co-localization of-and P63 in early esophageal organoid
用抗體-與P63對(duì)培養(yǎng)7天(Day7)的早期食管類器官進(jìn)行免疫熒光染色。大部分基底細(xì)胞均表達(dá)-與P63。
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Using esophagus organoid to explore the role ofin esophageal cancer initiation
Youhong Chen1, Wenhao Yang1,2, Chao Ni1
gene is aberrantly highly expressed and participates in cancer initiation and development in various malignant tumors including esophageal cancer, while the underlying mechanism(s) still remains unclear. In order to explore the role ofin the occurrence of esophageal cancer, we successfully established the esophageal organoids (EOs) as the research model. By constructing a lentivirus overexpressingand developing more effective infection method, EOs with stable overexpression ofwere efficiently obtained. The morphologies of EOs with or without overexpressingwere first analyzed with ImageJ, which showed no difference between two groups during continuous subculture. Subsequently, we applied immunofluorescence and CCK8 assays to evaluate the cell proliferation, and the results showed no change in the-overexpressed group as compared to control EOs. Furthermore, qPCR was used to detect the expression of genes that are related to cell cycle, cell metabolism as well as esophageal cancer. The results indicated the expression of these genes was not significantly increased in theoverexpressing EOs. In conclude, we discovered that overexpression ofgene alone in the esophagus organoid is not sufficient to induce carcinogenesis in esophageal carcinoma. In this study, we successfully established an esophagus organoid culture system and together with efficient lentivirus-infection method for investigation on the effects of overexpressingin esophageal cancer. Our work demonstrated a promising research model for the study of esophagus development and esophageal cancer.
esophagus cancer; esophageal organoid;overexpression; lentivirus infection
2021-01-08;
2021-04-06
國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(編號(hào):31900581)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31900581)]
陳友紅,在讀碩士研究生,專業(yè)方向:利用食管類器官模擬食管癌發(fā)生。E-mail: 15216686231@163.com
倪超,博士,助理研究員,研究方向:利用肺類器官模擬疾病發(fā)生。E-mail: chaoni@fudan.edu.cn
10.16288/j.yczz.21-010
2021-04-26 16:24:46
URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20210426.1101.002.html
(責(zé)任編委: 方向東)