楊光武，田嫄

果蠅F-box基因促進(jìn)脂肪儲(chǔ)存

楊光武，田嫄

貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025

脂質(zhì)是構(gòu)成生物體的重要成分之一，脂質(zhì)代謝的精確調(diào)節(jié)和穩(wěn)態(tài)維持對(duì)人類(lèi)健康至關(guān)重要。泛素化途徑通過(guò)降解脂質(zhì)相關(guān)蛋白來(lái)調(diào)控脂質(zhì)代謝。()編碼一種F-box蛋白，后者是SCF (Skp1-Cullin1-F-box)泛素化復(fù)合體成員之一。已有的研究表明在調(diào)控果蠅體節(jié)的正常發(fā)育和著絲粒組蛋白的正確定位方面發(fā)揮重要的作用，但在脂肪代謝方面的功能研究卻未見(jiàn)報(bào)道。本研究以黑腹果蠅()作為研究對(duì)象，探究了在脂肪儲(chǔ)存中的功能。通過(guò)與綠色熒光蛋白融合表達(dá)，檢測(cè)PPA的亞細(xì)胞定位；應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)，構(gòu)建的缺失突變體；通過(guò)BODIPY 493/503或Nile red脂滴染色，對(duì)缺失突變體和超量表達(dá)果蠅的脂滴形態(tài)改變進(jìn)行分析。隨后，在缺失突變體中超量表達(dá)以驗(yàn)證其功能。結(jié)果表明，PPA-GFP融合蛋白定位于唾液腺和脂肪體的細(xì)胞核中。與對(duì)照組果蠅相比，缺失突變體表現(xiàn)為脂滴變??；超量表達(dá)顯示出脂滴變大。在突變體中超量表達(dá)能夠?qū)⒅位貜?fù)至正常狀態(tài)。綜上所述，本研究揭示了在果蠅中具有促進(jìn)脂肪儲(chǔ)存的功能。

脂肪儲(chǔ)存；脂滴；CRISPR/Cas9；

脂質(zhì)代謝紊亂與肥胖、高血壓、糖尿病等代謝綜合征息息相關(guān)[1]。脂滴(lipid droplets, LDs)是由單層磷脂、中性核心脂質(zhì)和相關(guān)蛋白組成的細(xì)胞器，大多數(shù)動(dòng)物的中性脂質(zhì)都儲(chǔ)存在脂滴中[2]。脂滴在許多方面都發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能：首先，它是細(xì)胞內(nèi)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)的重要位點(diǎn)，脂肪酸含量高的高脂細(xì)胞能夠通過(guò)脂滴向相臨的低脂細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸[3]；其次，它是特定病毒的組裝平臺(tái)，肝細(xì)胞中的脂滴為極低密度脂蛋白的產(chǎn)生提供脂質(zhì)基礎(chǔ)，而丙肝病毒能夠侵入極低密度脂蛋白分泌途徑并附著在其表面，促進(jìn)丙肝病毒以低密度脂病毒顆粒的形式釋放[4]；在神經(jīng)調(diào)節(jié)方面，遺傳性痙攣性截癱相關(guān)基因的敲除小鼠表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)和認(rèn)知能力的缺陷，并且在神經(jīng)元中顯示出大量的異位脂肪累積[5]。脂滴的大小受到核心脂質(zhì)含量、單層磷脂組成和促進(jìn)脂滴融合相關(guān)蛋白的影響[6,7]。大脂滴的形成有兩種機(jī)制，一種是脂滴的生長(zhǎng)和膨脹，通常是通過(guò)將中性脂質(zhì)添加到脂滴核心來(lái)實(shí)現(xiàn)，另一種是由較小脂滴融合形成，但融合活性很低[8]。

真核生物中廣泛存在一類(lèi)叫做F-box的蛋白家族[9]。F-box蛋白家族的N端具有特征性的F-box結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)與其他蛋白結(jié)合形成SCF復(fù)合體，該復(fù)合體是一類(lèi)E3泛素化連接酶，其C端具有底物識(shí)別結(jié)構(gòu)域[10]。F-box蛋白與結(jié)合蛋白Skp1、骨架蛋白Cullin1和RING-finger蛋白R(shí)bx1共同組成SCF復(fù)合體。該復(fù)合體招募攜帶泛素分子的E2結(jié)合酶并識(shí)別底物蛋白，參與選擇性降解生物活性蛋白質(zhì)的泛素–蛋白酶體途徑(ubiquitin proteasome pathway, UPP)，在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫應(yīng)激等方面發(fā)揮重要作用[11,12]。研究表明，UPP介導(dǎo)多個(gè)脂滴相關(guān)蛋白的降解，例如，PLIN1是位于脂滴表面的特征性結(jié)合蛋白，能夠抑制脂質(zhì)降解，在小鼠的3T3-L1脂肪細(xì)胞中，PLIN1與選擇性自噬受體SQSTM1相互作用，并通過(guò)與泛素化蛋白特異性結(jié)合來(lái)降解PLIN1[13,14]。

是果蠅中繼后第二個(gè)被發(fā)現(xiàn)的編碼F-box蛋白的基因[15]。研究表明，在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用。在體內(nèi)與由編碼的Eve共同作用，抑制轉(zhuǎn)錄激活因子Prd(由編碼，)，調(diào)控包括()在內(nèi)的體節(jié)極性基因的表達(dá)。在正常表達(dá)的細(xì)胞中，mRNA被Eve抑制，確保了Prd被激活，從而激活下游靶基因的表達(dá)；而在不表達(dá)的細(xì)胞中，mRNA緊挨Prd，并將Prd條帶降解，抑制下游靶基因的表達(dá)[16,17]。此外，在著絲粒的穩(wěn)定性維持方面也發(fā)揮重要作用，著絲粒組蛋白CID決定著絲粒的特性和功能，超量表達(dá)會(huì)使得該蛋白錯(cuò)誤定位于染色體的非著絲粒區(qū)域，導(dǎo)致異位著絲粒的產(chǎn)生，從而引發(fā)染色體的錯(cuò)誤分離[18]。介導(dǎo)的泛素化途徑能夠降解錯(cuò)誤定位的CID，使該蛋白重新定位于著絲粒[19]。本研究通過(guò)蛋白定位、突變體分析和基因挽救實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)果蠅中的脂肪儲(chǔ)存。

1 材料與方法

1.1 果蠅品系

實(shí)驗(yàn)中所用到的果蠅均在玉米面培養(yǎng)基中飼養(yǎng)，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)規(guī)章制度操作，果蠅來(lái)源及用途見(jiàn)表1。

1.2 果蠅組織染色

將3齡幼蟲(chóng)在1×PBS緩沖液中解剖，獲得脂肪體和唾液腺。將組織放入4%多聚甲醛中固定30 min后，用1×PBS清洗2次，每次5 min。使用脂滴染料BODIPY 493/503或者Nile red避光染色30 min，使用細(xì)胞核染料DAPI避光染色10 min，使用細(xì)胞骨架染料Phalloidin 594避光染色30 min。用1×PBS清洗3次，每次5 min。在載玻片上滴加30 μL的70%甘油，將染色完畢的樣品轉(zhuǎn)移至載玻片上，蓋玻片壓片，最后用指甲油封片，將制作完成的片子在激光共聚焦顯微鏡上掃描成像。

表1 本研究中所用的果蠅品系

1.3 PPA的亞細(xì)胞定位分析

通過(guò)在/編碼區(qū)的C端添加表達(dá)綠色熒光蛋白的GFP序列，構(gòu)建得到轉(zhuǎn)基因果蠅/。29℃下，利用驅(qū)動(dòng)/的全身表達(dá)，解剖3齡幼蟲(chóng)的唾液腺和脂肪體，使用DAPI和Phalloidin 594染色標(biāo)記細(xì)胞核和細(xì)胞骨架，激光共聚焦顯微鏡下掃描成像。

1.4 sgRNA表達(dá)載體的構(gòu)建

通過(guò)網(wǎng)站www.flyrnai.org/crispr2設(shè)計(jì)兩段sgRNA序列，其位于的CDS區(qū)的第78～97 nt和第518～538 nt，并在引物前添加I酶切位點(diǎn)。將設(shè)計(jì)好的sgRNA序列在Flybase上進(jìn)行序列比對(duì)，確保在基因組中沒(méi)有其他配對(duì)區(qū)域。sgRNA及檢測(cè)引物序列見(jiàn)表2。

根據(jù)設(shè)計(jì)的sgRNA序列合成單鏈寡核苷酸片段，經(jīng)過(guò)退火形成兩端有粘性突出末端的雙鏈片段。用T4連接酶將sgRNA1和sgRNA2的退火片段分別連接到I酶切后的線性化載體pMD18T-U63- BsmB1上。經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，篩選得到兩個(gè)連接成功的質(zhì)粒，pMD18T-U63--sgRNA1和pMD18T-U63--sgRNA2。通過(guò)PCR擴(kuò)增給U63--sgRNA1和U63--sgRNA2添加接頭序列。利用Golden-gate連接將兩段由U63啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的sgRNA連接到中間載體PCR/TOPO/GW-I-Bb。最后將組裝好的質(zhì)粒通過(guò)LR反應(yīng)重組連接，得到pUAST-attB--sgRNAs表達(dá)載體。

表2 本研究中所用的引物序列

1.5 突變體鑒定與脂滴表型分析

將構(gòu)建的pUAST-attB--sgRNA質(zhì)粒送至珠海聯(lián)合華益公司進(jìn)行顯微注射，得到轉(zhuǎn)基因果蠅。將與表達(dá)Cas9蛋白的果蠅雜交，后代中得到同時(shí)表達(dá)Cas9蛋白與sgRNA的果蠅。使用-chk-F和-chk-R進(jìn)行Founder的PCR鑒定，通過(guò)雜交得到純合的突變果蠅，并通過(guò)PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序比對(duì)確定突變位點(diǎn)。具體的雜交策略如圖1所示。

研究選取了兩株突變體Ppa和Ppa以及兩者的雜交后代Ppa/Ppa進(jìn)行分析，解剖獲得3齡幼蟲(chóng)的脂肪體，使用DAPI和BODIPY 493/503標(biāo)記細(xì)胞核和脂滴，激光共聚焦顯微鏡下掃描成像。通過(guò)Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)特定面積內(nèi)(143 μm×143 μm)的不同直徑脂滴進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計(jì)，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組各選取3個(gè)樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。通過(guò)GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并繪制統(tǒng)計(jì)圖。

圖1 利用CRISPR/Cas9技術(shù)的基因敲除雜交策略

1.6 超量表達(dá)Ppa的脂滴表型分析

T-A克隆/的編碼區(qū)，通過(guò)RⅠ和Ⅰ連接至pUAST-attB，獲得了轉(zhuǎn)基因果蠅/。29℃下，利用驅(qū)動(dòng)/的全身表達(dá)，解剖3齡幼蟲(chóng)的脂肪體，使用DAPI和Nile red染色標(biāo)記細(xì)胞核和脂滴，激光共聚焦顯微鏡下掃描成像。通過(guò)Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)特定面積內(nèi)(143 μm×143 μm)的不同直徑脂滴進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計(jì)，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組各選取3個(gè)樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。通過(guò)GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并繪制統(tǒng)計(jì)圖。

1.7 基因挽救實(shí)驗(yàn)

通過(guò)遺傳操作，構(gòu)建得到Ppa;da>UAS-Ppa- RA/的果蠅。29℃下，在突變體Ppa中利用驅(qū)動(dòng)/的全身表達(dá)，解剖3齡幼蟲(chóng)的脂肪體，使用DAPI和BODIPY 493/503染色標(biāo)記細(xì)胞核和脂滴，激光共聚焦顯微鏡掃描成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPA融合熒光蛋白定位于細(xì)胞核

在前期工作中，發(fā)現(xiàn)超量表達(dá)能夠增強(qiáng)果蠅唾液腺的異位脂肪累積。本研究首先通過(guò)與綠色熒光蛋白融合表達(dá)，對(duì)PPA的定位進(jìn)行分析。經(jīng)查Flybase得知，基因具有3個(gè)轉(zhuǎn)錄本，其中RA和RC具有相同的編碼區(qū)，RA與RB的mRNA序列一致，且RB的編碼區(qū)在RA/RC的基礎(chǔ)上越過(guò)了一個(gè)終止密碼子UGA。本研究克隆了/的編碼區(qū)，構(gòu)建了融合蛋白表達(dá)載體并得到轉(zhuǎn)基因果蠅/。通過(guò)驅(qū)動(dòng)/的全身表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PPA-PA/PC在3齡幼蟲(chóng)唾液腺的細(xì)胞核中檢測(cè)出強(qiáng)烈的熒光信號(hào)(圖2A)，并在3齡幼蟲(chóng)脂肪體的細(xì)胞核中檢測(cè)出較弱的熒光信號(hào)(圖2B)，表明可能參與脂質(zhì)代謝。

2.2 Ppa缺失突變體的獲得與脂滴表型分析

為了進(jìn)一步探究對(duì)脂肪代謝的影響，本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建基因缺失突變體。首先，構(gòu)建了attB--sgRNA表達(dá)載體，通過(guò)顯微注射得到表達(dá)sgRNA的轉(zhuǎn)基因果蠅。將與表達(dá)Cas9蛋白的果蠅雜交，對(duì)進(jìn)行基因敲除。通過(guò)對(duì)雜交后代的遺傳篩選和PCR鑒定，得到了兩株純合可活的缺失突變體Ppa和Ppa，具體策略詳見(jiàn)材料與方法。隨后對(duì)突變體進(jìn)行測(cè)序鑒定，發(fā)現(xiàn)Ppa缺失了445 bp，Ppa缺失了446 bp，如圖3所示，缺失的片段位于編碼區(qū)的前端。

通過(guò)BODIPY對(duì)3齡幼蟲(chóng)脂肪體中的脂滴進(jìn)行染色標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組w相比，突變體Ppa和Ppa中的脂滴明顯減小(圖4：A～C)。在對(duì)照組中觀察到直徑較大的大脂滴，但在突變體中則表現(xiàn)為小脂滴的增加。由于CRISPR/Cas9技術(shù)具有潛在的脫靶效應(yīng)，故本研究對(duì)兩個(gè)片段缺失等位基因的反式雜合突變體Ppa/Ppa的脂滴進(jìn)行了分析，以消除遺傳背景上的其他未知突變對(duì)表型的影響，研究發(fā)現(xiàn)Ppa/Ppa的脂滴較對(duì)照組明顯減小，小脂滴數(shù)量明顯增多(圖4D)。隨后對(duì)特定面積內(nèi)不同直徑的脂滴進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)不同直徑的脂滴所占的比例具有顯著差異。與對(duì)照組相比，突變體表現(xiàn)出10 μm以上大脂滴減少(圖4F)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證突變體中脂滴減小的表型，隨后在突變體Ppa中超量表達(dá)，發(fā)現(xiàn)脂滴較突變體明顯增大，但較對(duì)照組無(wú)顯著差異(圖4：E和F)，說(shuō)明能夠回復(fù)突變體中脂滴減小的表型，并且提示的缺失是導(dǎo)致脂滴減小的原因，也進(jìn)一步揭示了參與脂肪儲(chǔ)存的調(diào)控。

圖2 PPA-GFP在3齡幼蟲(chóng)中的亞細(xì)胞定位

使用驅(qū)動(dòng)/的全身表達(dá)。A：唾液腺的GFP信號(hào)；a：唾液腺的細(xì)胞核染色；a?：唾液腺的細(xì)胞骨架染色；a?：唾液腺的熒光信號(hào)合并圖。B：脂肪體的GFP信號(hào)；b：脂肪體的細(xì)胞核染色；b?：脂肪體的細(xì)胞骨架染色；b?：脂肪體的熒光信號(hào)合并圖。DAPI (藍(lán)色)：細(xì)胞核染色；GFP (綠色)：PPA-GFP的融合熒光蛋白；Phalloidin (紅色)：細(xì)胞骨架染色；Salivary gland：唾液腺；Fat body：脂肪體。標(biāo)尺：25 μm。

圖3 突變體中的缺失區(qū)域示意圖與PCR擴(kuò)增凝膠電泳圖

A：突變體缺失區(qū)域示意圖。只有一個(gè)外顯子，藍(lán)色方框表示sgRNA位點(diǎn)，虛線表示缺失片段。B：突變體的PCR擴(kuò)增結(jié)果(使用檢測(cè)引物-chk-F和-chk-R進(jìn)行鑒定)。M：2 kb DNA marker；：對(duì)照組(w)；Ppa和Ppa：片段缺失等位基因。

2.3 超量表達(dá)Ppa增強(qiáng)脂滴儲(chǔ)存的能力

為了進(jìn)一步驗(yàn)證在脂肪儲(chǔ)存中的作用，本研究檢測(cè)了超量表達(dá)對(duì)脂滴的影響。使用Nile red對(duì)3齡幼蟲(chóng)脂肪體中的脂滴進(jìn)行染色標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，超量表達(dá)/導(dǎo)致脂滴直徑明顯增加，表現(xiàn)為大脂滴的數(shù)量顯著增多(圖5：A和B)。針對(duì)脂滴大小的差異，統(tǒng)計(jì)了特定面積內(nèi)不同直徑脂滴的分布比例，與對(duì)照組相比，超量表達(dá)/表現(xiàn)出直徑10 μm以上的大脂滴比例明顯增加，而1～5 μm的小脂滴比例明顯減少(圖5C)，表明超量表達(dá)能夠?qū)е轮倔w中小脂滴減少和大脂滴增加。

綜上所述，本研究通過(guò)亞細(xì)胞定位分析，發(fā)現(xiàn)定位于唾液腺與脂肪體的細(xì)胞核中；通過(guò)缺失突變體的脂滴形態(tài)分析，發(fā)現(xiàn)脂滴較對(duì)照組表現(xiàn)為直徑變??；通過(guò)超量表達(dá)，發(fā)現(xiàn)脂肪體中的脂滴較對(duì)照組表現(xiàn)為直徑增加，并且突變體中超量表達(dá)能夠?qū)⑼蛔凅w的脂滴減小表型回復(fù)至野生型狀態(tài)。以上結(jié)果表明具有促進(jìn)脂肪儲(chǔ)存的作用。

圖4 Ppa缺失突變體在3齡幼蟲(chóng)中的脂滴直徑變小

A～E：3齡幼蟲(chóng)的脂滴染色圖。w：對(duì)照組；Ppa和Ppa：片段缺失等位基因；Ppa/Ppa：兩個(gè)等位基因的反式突變體；Ppa;/：突變體中超量表達(dá)；BODIPY (綠色)：脂滴染色；DAPI (藍(lán)色)：細(xì)胞核染色。F：特定面積內(nèi)(143 μm× 143 μm)不同直徑脂滴的分布比例統(tǒng)計(jì)圖。X軸是脂滴直徑(μm)，Y軸為特定面積內(nèi)不同直徑的脂滴所占的比例。1～5 μm：直徑1～5 μm的脂滴；5～10 μm：直徑5～10 μm的脂滴；>10 μm：直徑10 μm以上的脂滴。ns：>0.05；*：<0.05；**：<0.01；***：<0.001。標(biāo)尺：25 μm。

圖5 超量表達(dá)Ppa導(dǎo)致3齡幼蟲(chóng)中的脂滴大小增加

A、B：29℃下，和/的3齡幼蟲(chóng)的脂滴染色圖。Nile red (紅色)：脂滴染色；DAPI (藍(lán)色)：細(xì)胞核染色。C：特定面積內(nèi)(143 μm×143 μm)不同直徑脂滴的分布比例統(tǒng)計(jì)圖。X軸是脂滴直徑(μm)，Y軸為特定面積內(nèi)不同直徑的脂滴所占的比例。1～5 μm：直徑1～5 μm的脂滴；5～10 μm：直徑5～10 μm的脂滴；>10 μm：直徑10 μm以上的脂滴。*：<0.05；***：<0.001。標(biāo)尺：25 μm。

3 討論

在小鼠()中，F(xiàn)-box基因家族成員的缺失引發(fā)了高血糖和胰島素抵抗；同時(shí)，在小鼠肝臟中超量表達(dá)不僅能夠顯著抑制高脂喂養(yǎng)引發(fā)的胰島素抵抗，而且可以降低肥胖小鼠的高血糖[20,21]；人體細(xì)胞周期素依賴(lài)性激酶抑制蛋白(CDKIs)成員p27的缺失導(dǎo)致脂肪細(xì)胞數(shù)量的增加，F(xiàn)-box蛋白S期激酶Skp2能夠識(shí)別p27并對(duì)其進(jìn)行降解；并且在的基因敲除小鼠中，皮下細(xì)胞和內(nèi)臟的脂肪細(xì)胞數(shù)量下降了50%，表明Skp2具有促進(jìn)脂肪的作用[22]。在本研究中，選取了F-box家族成員PPA作為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)片段缺失突變體表現(xiàn)為小脂滴增多，而超量表達(dá)導(dǎo)致大脂滴增加，并且突變體中超量表達(dá)能夠回復(fù)突變體脂滴減小的表型，這與的作用是相似的表明了F-box家族蛋白確實(shí)參與了脂質(zhì)代謝調(diào)控。

一般而言，F(xiàn)-box蛋白通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑介導(dǎo)靶蛋白的降解，目前已報(bào)道的靶蛋白包括轉(zhuǎn)錄因子Prd和著絲粒組蛋白CID，它們調(diào)控著體節(jié)發(fā)育和著絲粒定位[17,19]，但未見(jiàn)報(bào)道與脂肪相關(guān)的靶蛋白。已有的研究表明，在HeLa細(xì)胞中敲除E3泛素連接酶編碼基因?qū)е轮呜S度增加，MARCHF6的泛素化底物包括Perilipin2 (PLIN2)、膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NPC1和膽固醇合成限速酶LDM，這些蛋白直接參與脂滴組成或膽固醇合成[23,24]。此外，泛素–蛋白酶體途徑參與調(diào)控脂質(zhì)代謝通路的多個(gè)關(guān)鍵酶。在小鼠肝臟中，脂肪甘油三酯脂酶ATGL是一種主要的甘油三酯分解酶，能夠?qū)⒏视腿シ纸獬捎坞x脂肪酸。研究表明，E3泛素連接酶COP1靶向降解ATGL，敲除小鼠的脂滴數(shù)量顯著減少，而超量表達(dá)引發(fā)小鼠脂滴數(shù)量的增加，表明COP1的功能是抑制脂肪分解[25]。此外，在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中抑制蛋白酶體活性后，乙酰輔酶A羧化酶ACC的mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)，但脂肪酸合成酶FASN的mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)，說(shuō)明泛素蛋白酶體途徑能夠調(diào)控脂肪酸合成[26]。作為SCF泛素化復(fù)合體的組分，具有富亮氨酸重復(fù)序列，該結(jié)構(gòu)域能夠識(shí)別底物蛋白，推測(cè)其底物蛋白可能與脂質(zhì)合成或者脂滴結(jié)構(gòu)形成相關(guān)。也有研究報(bào)道，F(xiàn)-box蛋白可以與其他蛋白結(jié)合形成復(fù)合體發(fā)揮作用，在釀酒酵母中，F(xiàn)-box蛋白Ctf13與Skp1、Cep3形成核心，這個(gè)由3種蛋白組成的核心與Ndc10結(jié)合，形成著絲粒復(fù)合體CBF3，該復(fù)合體對(duì)動(dòng)粒的組裝至關(guān)重要[9,27]。本研究發(fā)現(xiàn)具有促進(jìn)脂肪儲(chǔ)存的功能，而其下游的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還有待進(jìn)一步研究。

致謝：

感謝中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所黃勛研究員提供的果蠅工具株和表達(dá)載體；感謝廣州霍夫曼免疫研究所焦仁杰教授和四川大學(xué)華西醫(yī)院陳海洋教授提供的sgRNA載體構(gòu)建和基因敲除方案。

[1] Fahy E, Cotter D, Sud M, Subramaniam S. Lipid classification, structures and tools., 2011, 1118 (11): 637–647.

[2] Welte MA, Gould AP. Lipid droplet functions beyond energy storage., 2017, 1862(10 Pt B): 1260–1272.

[3] Welte MA. Expanding roles for lipid droplets., 2015, 25(11): R470–R481.

[4] Filipe A, Mclauchlan J. Hepatitis C virus and lipid droplets: finding a niche., 2015, 21(1): 34–42.

[5] Inloes JM, Hsu KL, Dix MM, Viader A, Masuda K, Takei T, Wood MR, Cravatt BF. The hereditary spastic paraplegia-related enzyme DDHD2 is a principal brain triglyceride lipase., 2014, 111(41): 14924–14929.

[6] Xu X, Park JG, So JS, Lee AH. Transcriptional activation of Fsp27 by the liver-enriched transcription factor CREBH promotes lipid droplet growth and hepatic steatosis., 2015, 61(3): 857–869.

[7] Wilfling F, Wang HJ, Haas JT, Krahmer N, Gould TJ, Uchida A, Cheng JX, Graham M, Christiano R, Fr?hlich F, Liu XR, Buhman KK, Coleman RA, Bewersdorf J, Farese RV, Walther TC. Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets., 2013, 24(4): 384–399.

[8] Krahmer N, Guo Y, Wilfling F, Hilger M, Lingrell S, Heger K, Newman HW, Schmidt-supprian M, Vance DE, Mann M, Farese RV, Walther TC. Phosphatidylcholine synthesis for lipid droplet expansion is mediated by localized activation of CTP:phosphocholine cytidylyl-transferase., 2011, 14(4): 504–515.

[9] Wang XY, Sun LP, Zhang JF, Li H, Lv WQ, Zhang QQ. F-box proteins and their functions., 2008, 20(5): 807–811.王秀燕, 孫莉萍, 張建鋒, 李輝, 呂文清, 張其清. F-box蛋白家族及其功能. 生命科學(xué), 2008, 20(5): 807–811.

[10] Kipreos ET, Pagano M. The F-box protein family., 2000, 1(5): REVIEWS3002.

[11] Chen K, Cheng HH, Zhou RJ. Molecular mechanisms and functions of autophagy and the ubiq-uitin-proteasome pathway., 2012, 34(1): 5–18.陳科, 程漢華, 周榮家. 自噬與泛素化蛋白降解途徑的分子機(jī)制及其功能. 遺傳, 2012, 34(1): 5–18.

[12] Xie CM, Wei WY, Sun Y. Role of SKP1-CUL1-F-box- protein (SCF) E3 ubiquitin ligases in skin cancer., 2013, 40(3): 97–106.

[13] Sohn JH, Lee YK, Han JS, Jeon YG, Kim JI, Choe SS, Kim SJ, Yoo HJ, Kim JB. Perilipin 1 (Plin1) deficiency promotes inflammatory responses in lean adipose tissue through lipid dysregulation., 2018, 293(36): 13974–13988.

[14] Ju LP, Han JF, Zhang XY, Deng YJ, Yan H, Wang CR, Li XH, Chen SQ, Alimujiang M, Li X, Fang QC, Yang Y, Jia WP. Obesity-associated inflammation triggers an autophagy- lysosomal response in adipocytes and causes degradation of perilipin 1., 2019, 10(2): 121.

[15] Dui W, Lu W, Ma J, Jiao RJ. A systematic phenotypic screen of F-box genes through a tissue-specific RNAi- based approach in., 2012, 39(8): 397–413.

[16] Clark E, Akam M. Odd-paired controls frequency doubling insegmentation by altering the pair-rule gene regulatory network., 2016, 5: e18215.

[17] Raj L, Vivekanand P, Das TK, Badam E, Fernandes M, Finley RL, Brent R, Appel LF, Hanes SD, Weir M. Targeted localized degradation of Paired protein indevelopment., 2000, 10(20): 1265–1272.

[18] Heun P, Erhardt S, Blower MD, Weiss S, Skora AD, Karpen GH. Mislocalization of thecentromere- specific histone CID promotes formation of functional ectopic kinetochores., 2006, 10(3): 303–315.

[19] Moreno-moreno O, Medina-giró S, Torras-llort M, Azorín F. The F box protein partner of paired regulates stability ofcentromeric histone H3, CenH3(CID)., 2011, 21(17): 1488–1493.

[20] Zhao JJ, Xiong XL, Li Y, Liu X, Wang T, Zhang H, Jiao Y, Jiang JJ, Zhang HJ, Tang QQ, Gao X, Li XJ, Lu Y, Liu B, Hu C, Li XY. Hepatic F-box protein FBXW7 maintains glucose homeostasis through degradation of fetuin-A., 2018, 67(5): 818–830.

[21] Zhang C, Chen F, Feng L, Shan Q, Zheng GH, Wang YJ, Lu J, Fan SH, Sun CH, Wu DM, Li MQ, Hu B, Wang QQ, Zhang ZF, Zheng YL. FBXW7 suppresses HMGB1- mediated innate immune signaling to attenuate hepatic inflammation and insulin resistance in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease., 2019, 25(1): 29.

[22] Cooke PS, Holsberger DR, Cimafranca MA, Meling DD, Beals CM, Nakayama K, Nakayama KI, Kiyokawa H. The F box protein S phase kinase-associated protein 2 regulates adipose mass and adipocyte number., 2007, 15(6): 1400–1408.

[23] Scott NA, Sharpe LJ, Capell-Hattam IM, Gullo SJ, Luu W, Brown AJ. The E3 ubiquitin ligase MARCHF6 as a metabolic integrator in cholesterol synthesis and beyond., 2021, 1866(1): 158837.

[24] Scott NA, Sharpe LJ, Capell-hattam IM, Gullo SJ, Luu W, Brown AJ. The cholesterol synthesis enzyme lanosterol 14α-demethylase is post-translationally regulated by the E3 ubiquitin ligase MARCH6., 2020, 477(2): 541–555.

[25] Ghosh M, Niyogi S, Bhattacharyya M, Adak M, Nayak DK, Chakrabarti S, Chakrabarti P. Ubiquitin ligase COP1 controls hepatic fat metabolism by targeting ATGL for degradation., 2016, 65(12): 3561–3572.

[26] Liu LL, Guo AW, Li QQ, Wu PF, Yang YJ, Chen FF, Li SH, Guo PJ, Zhang Q. The regulation of ubiquitination in milk fat synthesis in bovine., 2020, 42(6): 548–555.劉莉莉, 郭愛(ài)偉, 李青青, 吳培福, 楊亞晉, 陳粉粉, 李素華, 郭盤(pán)江, 張勤. 泛素化途徑在奶牛乳脂生成過(guò)程中的調(diào)控作用. 遺傳, 2020, 42(6): 548–555.

[27] Leber V, Nans A, Singleton MR. Structural basis for assembly of the CBF3 kinetochore complex., 2018, 37(2): 269–281.

The F-box genepromotes lipid storage in

Guangwu Yang, Yuan Tian

Lipid is one of the important components of living organisms. The precise regulation and homeostasis maintenance of lipid metabolism are essential to human health. The ubiquitination pathway regulates lipid metabolism by degrading lipid-related proteins.encodes an F-box protein, which is a member of the SCF ubiquitination complex. Previous studies reported thatregulated the body segmentation and the correct localization of centromere histones, while its function in lipid metabolism has not been reported. In this study,was used to explore the function ofin lipid storage.The subcellular localization of PPA was detected by fusion with green fluorescent protein. The deletion mutant ofwas constructed via CRISPR/Cas9 technology. The morphological changes of lipid droplets in deletion mutants andoverexpression flies were analyzed by BODIPY 493/503 or Nile red staining.Further,was overexpressed in the deletion mutant to verify its function.The results showed that PPA-GFP fusion protein were localized in the nuclei of salivary gland and fat body. Compared with the control flies, the lipid droplets indeletion mutants became smaller, and overexpression ofexhibited larger lipid droplets. Overexpression ofin the deletion mutant could restore the lipid droplets to normal state. In summary, this study demonstrated thatcould promote lipid storage in.

lipid storage; lipid droplets; CRISPR/Cas9;

2021-03-05;

2021-04-28

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31600962)和貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：[2017]1043)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31600962) and Guizhou Provincial Science and Technology Foundation (No. [2017]1043)]

楊光武，在讀碩士研究生，專(zhuān)業(yè)方向：發(fā)育生物學(xué)。E-mail: ygw1996426@163.com

田嫄，博士，副教授，研究方向：果蠅脂肪代謝。E-mail: ytian1@gzu.edu.cn

10.16288/j.yczz.21-084

2021/5/7 14:44:00

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20210507.1031.002.html

(責(zé)任編委: 閻言)