王海濤，李亭亭，黃勛，馬潤(rùn)林,4，劉秋月

遺傳修飾技術(shù)在綿羊分子設(shè)計(jì)育種中的應(yīng)用

王海濤1,2，李亭亭3，黃勛1,2，馬潤(rùn)林1,2,4，劉秋月1

1. 中國(guó)科學(xué)院種子創(chuàng)新研究院，北京 100101 2. 中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，分子發(fā)育生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101 3. 浙江農(nóng)林大學(xué)，杭州 3113004. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

利用遺傳修飾技術(shù)可以使動(dòng)物在遺傳水平發(fā)生改變，實(shí)現(xiàn)在個(gè)體內(nèi)表達(dá)外源基因或?qū)ζ鋬?nèi)源基因的功能造成影響。在動(dòng)物育種中，可以利用遺傳修飾技術(shù)在分子水平進(jìn)行設(shè)計(jì)并實(shí)現(xiàn)品種的快速改良。從傳統(tǒng)的遺傳修飾技術(shù)、病毒載體、精子載體等介導(dǎo)的遺傳修飾技術(shù)到新型人工核酸酶介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，尤其是CRISPR/Cas9為代表的人工核酸酶的運(yùn)用使得基因編輯動(dòng)物的制備變得更加高效快捷，并迅速在多個(gè)物種中得到應(yīng)用。這些方法也已經(jīng)拓展到了綿羊()遺傳育種領(lǐng)域。利用遺傳修飾技術(shù)在綿羊中進(jìn)行分子育種比傳統(tǒng)的育種方式具有更大的優(yōu)勢(shì)，可以使用多種策略直接對(duì)性狀進(jìn)行快速改良，并且可以加快育種進(jìn)程。本文詳細(xì)介紹了遺傳修飾技術(shù)在綿羊中的研究歷程，探討了通過(guò)遺傳修飾技術(shù)進(jìn)行綿羊分子設(shè)計(jì)育種的可能性，并提出以上技術(shù)和方法在綿羊育種中面臨的問題和挑戰(zhàn)。

綿羊；遺傳修飾；基因編輯；動(dòng)物育種

綿羊()是畜牧業(yè)中重要的農(nóng)業(yè)動(dòng)物之一，約在1萬(wàn)年前即被人類所馴化[1]，主要為人類提供皮毛、肉類和奶制品等。為了獲得具有優(yōu)良性狀的綿羊品種，人們通過(guò)各種方式進(jìn)行品種的選育，期望獲得具有較高肉奶產(chǎn)量、生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)皮毛或具有較高抗病能力的綿羊品種。傳統(tǒng)的育種方式是通過(guò)表型選擇將優(yōu)良性狀個(gè)體進(jìn)行保留。整個(gè)過(guò)程需要對(duì)其親本進(jìn)行選種，包括選定親本品系、確定雜交組合、雜交代數(shù)等。為了固定表型，需要采用適當(dāng)?shù)慕唬粫?huì)引起動(dòng)物的表型退化、品質(zhì)衰退等。雜交產(chǎn)生的后代也會(huì)出現(xiàn)性狀分離的現(xiàn)象，育種過(guò)程非常緩慢且復(fù)雜。

自基因的概念提出以來(lái)，分子生物學(xué)和基因工程理論和技術(shù)獲得了較大的發(fā)展，明確了遺傳變異可以引起性狀的改變。因此，可以通過(guò)對(duì)基因進(jìn)行修飾或編輯實(shí)現(xiàn)新品種培育。通過(guò)物理或化學(xué)誘變可以在動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)誘變育種[2]，但誘變產(chǎn)生的基因突變往往是隨機(jī)性的，并且會(huì)產(chǎn)生無(wú)育種價(jià)值的性狀或不利于育種的性狀。遺傳修飾育種直接針對(duì)調(diào)控性狀的基因，通過(guò)轉(zhuǎn)基因或基因編輯等方式對(duì)基因進(jìn)行分子設(shè)計(jì)，在保留品種固有優(yōu)良性狀的基礎(chǔ)上，引入新性狀，改善劣勢(shì)性狀，而且可以突破品種的局限，將其他物種的性狀引入，從而克服物種間的生殖隔離，把不同物種的優(yōu)質(zhì)性狀集合和重組，實(shí)現(xiàn)定向選擇育種。分子設(shè)計(jì)育種相比傳統(tǒng)育種在可預(yù)見性和選擇上有了極大的提高。

通過(guò)遺傳修飾在動(dòng)物中進(jìn)行分子設(shè)計(jì)育種，理論上僅需要一個(gè)世代就能獲得穩(wěn)定遺傳的品系，可以大大縮短育種時(shí)間，降低育種成本。通過(guò)直接對(duì)基因進(jìn)行操作，在獲得的基因修飾個(gè)體中就能獲得穩(wěn)定的基因型。基因修飾操作的過(guò)程對(duì)個(gè)體的要求較低，需要品種內(nèi)具有典型性狀的個(gè)體提供體細(xì)胞、胚胎或卵細(xì)胞即可?；蛐揎梻€(gè)體的制備需要代孕母畜，但代孕受體的選擇標(biāo)準(zhǔn)也較為寬松，不需要本品種內(nèi)的最優(yōu)個(gè)體，可以用物種內(nèi)其他品種中具有優(yōu)良繁殖能力的個(gè)體，拓寬了選擇范圍，同時(shí)保有一定數(shù)量的受體即可。通過(guò)規(guī)模化的基因修飾，可以在短時(shí)間內(nèi)獲得一定數(shù)量的基因修飾動(dòng)物群體。通過(guò)將獲得的純合子進(jìn)行交配，對(duì)群體進(jìn)行擴(kuò)繁，可以在幾代之內(nèi)就建立相當(dāng)規(guī)模的穩(wěn)定遺傳品系，相較于雜交育種縮短了時(shí)間，提高了效率。

1 遺傳修飾技術(shù)在綿羊中的應(yīng)用

在綿羊等大動(dòng)物中，遺傳育種對(duì)性狀的改良主要包括改善原有性狀以及引入新性狀。可以轉(zhuǎn)入外源基因序列以獲得原物種不具備的表型或功能。遺傳修飾的方式最初為外源基因的隨機(jī)插入或同源重組介導(dǎo)的插入或刪除，同時(shí)需要借助受精卵顯微注射或體細(xì)胞核移植(somatic cell nuclear transfer, SCNT)的方式獲得遺傳修飾綿羊。在自然情況下同源重組發(fā)生的概率極低，只有10–6[3]，遺傳修飾細(xì)胞的篩選難度較大，適合在干細(xì)胞中進(jìn)行篩選，而綿羊的干細(xì)胞體系目前并不成熟。因此，提高同源重組效率成為分子設(shè)計(jì)育種中的關(guān)鍵。

在以人工核酸酶為代表的基因編輯技術(shù)出現(xiàn)后，以CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated 9)系統(tǒng)為代表的基因編輯逐漸成為遺傳修飾的常用方法。人工核酸酶系統(tǒng)通過(guò)提高DNA雙鏈斷裂效率來(lái)提高同源重組的效率，其原理為：當(dāng)基因組中出現(xiàn)雙鏈缺口時(shí)，啟動(dòng)基因組損傷修復(fù)機(jī)制，包括非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)修復(fù)，或者存在同源供體的情況下，啟動(dòng)同源重組修復(fù)(homology- directed repair, HDR)，將外源基因引入至重組區(qū)域[4]。因此，提高基因組中雙鏈斷裂的效率，就能提高同源重組的能力，從而提高基因打靶效率，可以使隨機(jī)的重組效率由原來(lái)的10–7～10–6提高至10–2～10–1。借助新型基因編輯工具，不僅能實(shí)現(xiàn)外源基因在受體中穩(wěn)定高效的表達(dá)，還可以實(shí)現(xiàn)基因組中序列的缺失、堿基替換和插入等，造成移碼突變、氨基酸轉(zhuǎn)換等?；蚓庉嫻ぞ叩某霈F(xiàn)極大地豐富了遺傳修飾的方法和策略。遺傳修飾技術(shù)發(fā)展及在綿羊中的應(yīng)用進(jìn)程如圖1所示。

制備遺傳修飾大動(dòng)物涉及多種原理和技術(shù)的應(yīng)用以及繁雜的操作流程(圖2)。原理方面涉及隨機(jī)插入、同源重組、DNA堿基修復(fù)、轉(zhuǎn)座子、RNAi轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等分子生物學(xué)基礎(chǔ)概念。將這些概念轉(zhuǎn)化為實(shí)際可操作的技術(shù)，首先需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臉?gòu)建相應(yīng)質(zhì)粒載體，其次要實(shí)現(xiàn)載體向細(xì)胞、胚胎甚至個(gè)體的轉(zhuǎn)移。操作技術(shù)包括：脂質(zhì)體/病毒/精子等方法進(jìn)行載體遞送，mRNA或蛋白質(zhì)的直接顯微注射，體細(xì)胞核移植技術(shù)等獲得基因被修飾的個(gè)體?？傮w可分為以下3部分：(1)獲得目的基因序列并通過(guò)限制性內(nèi)切酶的酶切連接，制備攜帶外源基因或具有敲除、點(diǎn)突變或干擾等功能的載體。例如具有同源重組功能的載體，以及表達(dá)外源基因、轉(zhuǎn)座子酶、siRNA、鋅指核酸酶(zinc finger nucleases, ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator- like effector nucleases, TALEN)或CRISPR/Cas9等元件的載體，或者體外獲得具有基因修飾功能的mRNA或蛋白質(zhì)。(2)通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染、病毒遞送或顯微注射等方式將載體、mRNA或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入體細(xì)胞或早期胚胎中，對(duì)供體細(xì)胞或受精卵基因組進(jìn)行遺傳修飾。(3)發(fā)生基因修飾的供體細(xì)胞或受精卵再通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)或胚胎移植技術(shù)移入受體動(dòng)物子宮內(nèi)，從而獲得包括綿羊在內(nèi)的多種遺傳修飾動(dòng)物。

圖1 遺傳修飾技術(shù)及其在綿羊中應(yīng)用的里程碑事件

圖2 制備遺傳修飾綿羊流程圖

制備遺傳修飾綿羊之前，需要確定候選基因，通過(guò)載體構(gòu)建獲得具有各種候選基因修飾功能的載體。通過(guò)載體轉(zhuǎn)染或各種遞送方式，在供體細(xì)胞或受精卵中載體表達(dá)并對(duì)基因組進(jìn)行修飾或編輯。獲得的遺傳修飾胚胎移植入受體母羊中發(fā)育并獲得遺傳修飾綿羊。

1.1 傳統(tǒng)的遺傳修飾方法

在高效基因編輯技術(shù)建立以前，在綿羊中主要通過(guò)基因組本身的同源重組或外源片段隨機(jī)插入對(duì)基因進(jìn)行修飾，并結(jié)合顯微注射或體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得遺傳修飾個(gè)體。使用這種遺傳修飾方式，在基因組中發(fā)生基因編輯或重組的效率較低，插入位點(diǎn)具有隨機(jī)性，并且容易產(chǎn)生嵌合體等特點(diǎn)。通過(guò)顯微注射和體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)基因綿羊研究結(jié)果見表1。與最早獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠()類似，第一只轉(zhuǎn)基因綿羊也是通過(guò)顯微注射獲得。1985年，研究者將人生長(zhǎng)激素基因(human growth hormone,)通過(guò)顯微注射注入綿羊胚胎，通過(guò)胚胎移植入代孕受體中獲得第一只轉(zhuǎn)基因綿羊[6]。在后續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)，人們通過(guò)顯微注射制備了多種轉(zhuǎn)基因綿羊，如轉(zhuǎn)羊生長(zhǎng)激素基因的綿羊[18,19]以及轉(zhuǎn)Visna病毒糖蛋白綿羊等[20]。

克隆羊多莉的誕生標(biāo)志著哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆技術(shù)的建立[9]。利用體細(xì)胞篩選獲得穩(wěn)定整合外源基因的單克隆細(xì)胞作為細(xì)胞核供體，經(jīng)過(guò)核移植和胚胎移植技術(shù)產(chǎn)下預(yù)期性狀的克隆后代，同時(shí)不存在顯微注射產(chǎn)生嵌合的問題。研究人員最早通過(guò)此方法獲得了能夠在羊乳中表達(dá)人凝血因子的轉(zhuǎn)基因綿羊[10]。2001年英國(guó)的羅斯林研究所通過(guò)同源重組結(jié)合體細(xì)胞克隆技術(shù)獲得了(ovine prion protein)和(α(1,3)galactosyl transferase)定點(diǎn)敲除的綿羊[30]。該技術(shù)獲得的細(xì)胞供體是通過(guò)同源重組獲得的基因敲除單克隆細(xì)胞，因此再通過(guò)體細(xì)胞核移植獲得的克隆后代均為陽(yáng)性個(gè)體。McCreath等[31]也通過(guò)同源重組及體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得了(ovine α1(I) procollagen)定點(diǎn)插入(α1-antitrypsin)的基因修飾綿羊。

表1 通過(guò)顯微注射和體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得的遺傳修飾綿羊

顯微操作技術(shù)理論上可以在任何能獲得卵細(xì)胞的動(dòng)物中進(jìn)行操作，甚至可以在胚盤下腔注射以獲得遺傳修飾禽類，而體細(xì)胞核移植只能對(duì)兩棲類、魚類和哺乳類卵細(xì)胞進(jìn)行操作。通過(guò)顯微注射技術(shù)制備遺傳修飾動(dòng)物時(shí)，在原核形成到第一次卵裂之間進(jìn)行顯微操作，才能盡可能的避免產(chǎn)生嵌合體。早期獲得遺傳修飾動(dòng)物的效率較低，使得顯微注射獲得的個(gè)體大多數(shù)為野生型或嵌合體。而體細(xì)胞核移植技術(shù)可以將大量的篩選工作在細(xì)胞水平進(jìn)行，避免在出生的后代中產(chǎn)生大量陰性個(gè)體或嵌合體。

1.2 精子載體、慢病毒載體、轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的遺傳修飾

顯微注射或體細(xì)胞核移植技術(shù)是將遺傳修飾載體導(dǎo)入早期胚胎或細(xì)胞的傳統(tǒng)方式，此后又發(fā)展出利用精子或病毒等生物載體的導(dǎo)入方式。精子載體法的原理為，通過(guò)將精子與DNA共孵育后，將攜帶DNA的精子受精，從而獲得基因修飾的受精卵；或者在綿羊睪丸中直接注射外源載體，載體進(jìn)入精子后再進(jìn)行交配獲得基因修飾后代。多個(gè)團(tuán)隊(duì)分別通過(guò)這種方法制備了(solute carrier family 7 member 11)[34]、(peroxisome proliferator-activated receptor gamma)[35]和(lipoprotein lipase)[36]的轉(zhuǎn)基因綿羊，并獲得了具有表型的F1后代。但這種方法的重復(fù)性較差且效率較低。

慢病毒載體介導(dǎo)的基因修飾依賴于病毒感染細(xì)胞的能力，通過(guò)將慢病毒注射到綿羊卵子或胚胎，實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移。通過(guò)慢病毒載體感染，已獲得了轉(zhuǎn)(green fluorescent protein)轉(zhuǎn)基因羊[37～39]以及具有更高產(chǎn)毛性能的轉(zhuǎn)(fibroblast growth factor 5)綿羊[40]。結(jié)合顯微注射和慢病毒載體的方法，也獲得了轉(zhuǎn)入外源基因表達(dá)量較高的后代[41,42]。病毒載體遞送質(zhì)粒相對(duì)于顯微注射法和體細(xì)胞核移植方法相對(duì)簡(jiǎn)單，甚至在小鼠中可以直接通過(guò)鼻腔或氣管滴入的方法遞送到肺部進(jìn)行基因編輯[43]，但這一方法在大動(dòng)物中還未見報(bào)道。此外，使用病毒載體法獲得遺傳修飾動(dòng)物在安全性方面也會(huì)受到限制。

在基因組中存在具有特殊功能的序列，也可被用于實(shí)現(xiàn)綿羊中基因遺傳修飾。例如構(gòu)建表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的質(zhì)粒載體并結(jié)合其他遞送方法，即利用轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座活性將序列插入基因組中特定區(qū)域，在綿羊中已有報(bào)道(表2)。Bevacqua等[44]通過(guò)Tn5或SB (sleeping beauty)轉(zhuǎn)座子載體結(jié)合顯微注射成功獲得了遺傳修飾綿羊個(gè)體；Hu等[45]則通過(guò)SB轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的RNAi獲得了(myostatin)敲低的綿羊個(gè)體。

一般情況下，精子載體和慢病毒載體介導(dǎo)的遺傳修飾技術(shù)不需要依賴精密的儀器設(shè)備和復(fù)雜的技術(shù)操作，相比顯微操作和體細(xì)胞和移植技術(shù)成本較低。利用轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的遺傳修飾，是在高效精確的人工核酸酶技術(shù)規(guī)模運(yùn)用之前的有效修飾方法。人工核酸酶技術(shù)出現(xiàn)后，憑借在修飾效率上的巨大優(yōu)勢(shì)，成為了在農(nóng)業(yè)動(dòng)物中的遺傳修飾的主要方法。然而，技術(shù)的創(chuàng)新無(wú)法突破動(dòng)物生殖方式的局限，畜禽動(dòng)物本身的生殖方式?jīng)Q定了對(duì)其進(jìn)行遺傳修飾操作時(shí)，可選擇的載體遞送方式以及修飾難度存在差異。例如，哺乳動(dòng)物可獲得卵母細(xì)胞并在體外進(jìn)行受精，從而將受精卵與顯微注射、轉(zhuǎn)染等操作體系配合。而禽類的生殖方式?jīng)Q定了受精卵在離開母體之前，已經(jīng)經(jīng)過(guò)卵裂等發(fā)育階段成為多細(xì)胞的胚胎，此外，禽類的蛋殼也加大了對(duì)其卵或胚胎進(jìn)行遺傳修飾操作的難度。

表2 綿羊中使用病毒載體、精子載體或轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的遺傳修飾研究

1.3 人工核酸酶介導(dǎo)的基因精準(zhǔn)編輯

如前面所述，通過(guò)顯微注射和體細(xì)胞核移植技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)或內(nèi)源基因的打靶，但外源基因的插入是隨機(jī)的，打靶的效率也很低。隨著人工核酸酶被證實(shí)可以運(yùn)用于遺傳修飾后，動(dòng)物的基因修飾已經(jīng)從最初單一的、隨機(jī)性的轉(zhuǎn)基因向基因組的精準(zhǔn)敲入、敲除和點(diǎn)突變快速發(fā)展，甚至可以實(shí)現(xiàn)時(shí)間和組織特異性的基因編輯。目前通過(guò)顯微注射和SCNT結(jié)合常用的人工核酸酶技術(shù)獲得基因編輯綿羊的方法如圖3所示，所報(bào)道獲得的基因編輯綿羊如表3所示。

1.3.1 ZFN介導(dǎo)的基因編輯

Lee等[8]于1989年首次報(bào)道了鋅指結(jié)構(gòu)，后來(lái)逐漸發(fā)展為可用于基因編輯的鋅指核酸酶技術(shù)。ZFN系統(tǒng)通過(guò)序列識(shí)別結(jié)構(gòu)域和切割結(jié)構(gòu)域發(fā)揮作用。其中，鋅指蛋白由Cys2-His2蛋白單元組成，可以與基因序列上的3個(gè)堿基識(shí)別[65]。根據(jù)靶基因序列，將多個(gè)蛋白單元串聯(lián)組裝而成的鋅指蛋白即可對(duì)其識(shí)別，串聯(lián)結(jié)構(gòu)越長(zhǎng)，就越有識(shí)別的特異性[66]。起切割作用的為I酶，在鋅指蛋白的引導(dǎo)下切割基因序列[67]。而I通常形成二聚體，因此可以對(duì)序列造成雙鏈斷裂，進(jìn)而啟動(dòng)基因修復(fù)機(jī)制[68]。帶有ZFN表達(dá)元件的質(zhì)粒載體正是通過(guò)這種機(jī)制對(duì)細(xì)胞基因組進(jìn)行編輯。ZFN首次在非洲爪蟾()中被應(yīng)用[12]，此后在果蠅()[69]等動(dòng)物中均被成功使用。

圖3 人工核酸酶技術(shù)制備基因編輯綿羊的方法示意圖

ZFN、TALEN或Cas9載體主要通過(guò)顯微注射或體細(xì)胞核移植遞送入體細(xì)胞或受精卵中，在細(xì)胞中介導(dǎo)DNA雙鏈斷裂(DNA double strand break, DSB)，經(jīng)過(guò)細(xì)胞內(nèi)同源重組修復(fù)(HDR)或非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)可以對(duì)內(nèi)源基因進(jìn)行編輯或引入外源基因，獲得的基因編輯細(xì)胞經(jīng)過(guò)體細(xì)胞核移植(SCNT)獲得后代，基因編輯胚胎則通過(guò)胚胎移植入受體中獲得后代。

表3 人工核酸酶技術(shù)介導(dǎo)的基因編輯在綿羊遺傳修飾中的應(yīng)用

Salabi等[14]在綿羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞中通過(guò)ZFN對(duì)進(jìn)行了編輯并篩選獲得了陽(yáng)性克隆，繼而驗(yàn)證在衛(wèi)星細(xì)胞中的功能。Zhang等[47]在綿羊成纖維細(xì)胞中成功敲除了基因，并通過(guò)ZFN mRNA的顯微注射獲得了基因編輯胚胎。但目前未見有通過(guò)ZFN獲得基因編輯綿羊的報(bào)道。ZFN的使用比被動(dòng)的同源重組在效率上有了較大的提高，但由于其設(shè)計(jì)復(fù)雜、特異性較差、有細(xì)胞毒性以及容易脫靶等原因，逐漸被后來(lái)的其他人工核酸酶所取代。

1.3.2 TALEN介導(dǎo)的基因編輯

轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶是在植物病原體黃單胞菌()中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)物的基礎(chǔ)上建立的[11]，其結(jié)構(gòu)和原理與ZFN相似，包括具有識(shí)別功能的TALE蛋白和切割功能的I酶。TALE具有結(jié)合DNA的功能，其中含有的重復(fù)串聯(lián)區(qū)域包含34個(gè)氨基酸，第12和13位點(diǎn)的氨基酸對(duì)于識(shí)別特定的堿基起關(guān)鍵作用[70]。在TALE導(dǎo)向下，I對(duì)基因組的特定區(qū)域進(jìn)行切割。TALEN以二聚體的形式發(fā)揮雙鏈切割作用，因此通常制作1對(duì)TALEN載體。自TALEN運(yùn)用到果蠅中以來(lái)[13]，在綿羊中的應(yīng)用主要靶向綿羊基因。通過(guò)TALEN mRNA注射受精卵[15]，或體細(xì)胞核移植均獲得了編輯綿羊，且在表型上與野生型呈現(xiàn)差異[48,49]。相比ZFN，TALEN在特異性方面有所提高，但TALE分子較大、制備依然復(fù)雜，需要的成本和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

1.3.3 CRISPR/Cas介導(dǎo)的基因編輯

CRISPR/Cas系統(tǒng)憑借其簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì)、更高的效率，為基因編輯帶來(lái)了革命性的突破。CRISPR全稱為成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列。Cas為CRISPR相關(guān)基因編碼的特異切割DNA分子的核酸酶，于1987年在細(xì)菌和古細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)，具有發(fā)揮細(xì)菌免疫功能的作用[7]。CRISPR/Cas系統(tǒng)分為I、II和III，其中Cas9屬于II型系統(tǒng)，僅需要一種蛋白參與即可完成序列切割[71]。II型系統(tǒng)包含4種分子，其中crRNA和tracrRNA組成的雙鏈復(fù)合體引導(dǎo)Cas9蛋白在序列上特定位置切割。在實(shí)際應(yīng)用中，通過(guò)4個(gè)堿基將crRNA和tracrRNA連接，形成向?qū)NA (single-guide RNA, sgRNA)表達(dá)框。一個(gè)Cas9載體包含了sgRNA表達(dá)框和Cas9蛋白。由于生物體內(nèi)含有RNase，只需要將20 bp的sg序列連入載體中，就能獲得可以在細(xì)胞內(nèi)切割DNA序列的全部元件，sg序列則為切割提供引導(dǎo)。sg序列雖然依賴于相鄰的PAM序列(5?-NGG-3?序列)，但在基因組中，NGG序列普遍存在，平均每128 bp序列中就可以找到一個(gè)位點(diǎn)[71]。CRISPR/Cas系統(tǒng)在2013年被證實(shí)可用于哺乳動(dòng)物的基因編輯，此后使用CRISPR/Cas9進(jìn)行動(dòng)物基因編輯的研究出現(xiàn)井噴式的成果。利用顯微注射技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)Cas9 mRNA及其sgRNA同時(shí)被注入受精卵中，獲得基因編輯的綿羊。Crispo等[17]和Han等[50]利用該方法分別獲得了編輯的綿羊，其與野生型綿羊相比表現(xiàn)出明顯的體重差異。Wang等[51]則獲得了多個(gè)基因(和)同時(shí)編輯的綿羊，顯示出Cas9系統(tǒng)的強(qiáng)大編輯能力。此外，通過(guò)Cas9系統(tǒng)結(jié)合顯微注射獲得了[52]及[53]基因編輯綿羊。另外，還實(shí)現(xiàn)了綿羊Rosa26位點(diǎn)的外源基因定點(diǎn)插入[54]。CRISPR系統(tǒng)也可以與SCNT技術(shù)結(jié)合制備基因編輯綿羊，如對(duì)基因編輯的綿羊[55]以及編輯的綿羊[56]。

1.3.4 單堿基編輯系統(tǒng)(base editing)

2016年，Komor等[72]開發(fā)了基于Cas9系統(tǒng)的單堿基編輯系統(tǒng)，該技術(shù)被評(píng)為雜志年度十大科學(xué)技術(shù)突破之一，在基因治療、遺傳育種等領(lǐng)域具有應(yīng)用的潛力。通過(guò)將失活或只有單鏈切割活性的dCas9 (deactivated Cas, dCas)及nCas9 (nickase Cas, nCas)與嘧啶或嘌呤脫氨酶結(jié)合，單堿基編輯器可以精準(zhǔn)的將胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶(T)，或?qū)⑾汆堰?A)轉(zhuǎn)化為鳥嘌呤(G)，分別稱之為胞嘧啶堿基編輯器(cytosine base editors, CBE)和腺嘌呤堿基編輯器(adenine base editors, ABE)[73]。單堿基編輯器不需要依賴基因組雙鏈斷裂的產(chǎn)生，也無(wú)需供體DNA參與編輯，因此簡(jiǎn)化了基因編輯步驟。在綿羊中，Zhou等[57]通過(guò)CBE系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了基因的C>T轉(zhuǎn)換，獲得了具有更快生長(zhǎng)速度的基因編輯灘羊，為培育快長(zhǎng)型綿羊品系奠定了基礎(chǔ)。單堿基編輯系統(tǒng)將動(dòng)物的遺傳修飾從最初的整個(gè)基因的插入或大片段的敲除縮小到單個(gè)堿基的操作水平，對(duì)動(dòng)物中由單堿基突變導(dǎo)致性狀變異的位點(diǎn)進(jìn)行基因編輯。但單堿基編輯系統(tǒng)目前僅可以實(shí)現(xiàn)堿基的轉(zhuǎn)換(transition)而無(wú)法實(shí)現(xiàn)堿基的顛換(transversion)，只能對(duì)符合堿基轉(zhuǎn)換類型的特定突變進(jìn)行編輯，限制其對(duì)任意性狀的操作。此外，Jin等[74]及Zuo等[75]分別在不同物種中發(fā)現(xiàn)單堿基編輯系統(tǒng)存在嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)，應(yīng)用時(shí)可能存在較大風(fēng)險(xiǎn)。其中，Zuo等[75]還建立了名為GOTI (genome-wide off-target analysis by two-cell embryo injection)的脫靶檢測(cè)技術(shù)，能夠顯著提高單堿基編輯時(shí)脫靶檢測(cè)的敏感性，可以在全基因組范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)以往檢測(cè)手段不易發(fā)現(xiàn)的脫靶位點(diǎn)。該方法為減少單堿基編輯技術(shù)應(yīng)用的風(fēng)險(xiǎn)提供保障，利于該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

目前，除Cas9及單堿基編輯系統(tǒng)外，還有多種CRISPR相關(guān)的基因編輯工具被開發(fā)出來(lái)。例如，具有更高編輯效率的Cas12系統(tǒng)，具有靶向RNA編輯功能的Cas13系統(tǒng)，能夠編輯單鏈DNA的Cas14系統(tǒng)[76]以及更小分子量的CasⅩ[77]等。除Cas9之外，目前尚未見到其他CRISPR/Cas系統(tǒng)在綿羊中應(yīng)用的報(bào)道，但這些研究為綿羊的分子育種提供了較新的思路和方法。

2 利用遺傳修飾在綿羊中進(jìn)行分子設(shè)計(jì)育種的主要方向

在馴化初期，人類飼養(yǎng)綿羊作為主要肉類來(lái)源，因此馴化方向大多為肉用品種。此后，為了獲得羊毛等副產(chǎn)品，人們又馴化出產(chǎn)毛量、毛色各異的地方綿羊品種。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的人工馴化，現(xiàn)在的綿羊品種與其祖先在體型外貌、行為、生殖能力等方面顯示了巨大差異，并在品種間出現(xiàn)顯著變異。人工選擇會(huì)在基因組上留下與動(dòng)物性狀相關(guān)的選擇信號(hào)或分子標(biāo)記。通過(guò)遺傳修飾在綿羊中進(jìn)行分子育種，不僅使育種時(shí)間大為縮短，也可以將多種優(yōu)良性狀聚合，一次實(shí)現(xiàn)多個(gè)性狀的改良。在綿羊中，通過(guò)遺傳修飾進(jìn)行分子設(shè)計(jì)育種主要體現(xiàn)在增強(qiáng)抗病抗逆能力，包括抗病毒、細(xì)菌及寄生蟲能力和抗寒、抗高溫高濕能力；改良生產(chǎn)性狀，包括肉產(chǎn)量、肉品質(zhì)、奶品質(zhì)；改善羊毛產(chǎn)量和品質(zhì)，包括毛長(zhǎng)度、產(chǎn)量和強(qiáng)度；提高繁殖力，包括排卵數(shù)和產(chǎn)羔數(shù)等方面；制備動(dòng)物模型，包括人類疾病模型或制備藥品等。利用遺傳修飾在綿羊中進(jìn)行分子設(shè)計(jì)育種的應(yīng)用方向如圖4所示。

2.1 通過(guò)分子設(shè)計(jì)育種改善羊毛性狀

從克隆羊多莉出生到現(xiàn)在的20多年間，國(guó)內(nèi)外針對(duì)上述性狀開展了多項(xiàng)遺傳改良方面的研究。在提高羊毛性狀方面，Damak等[26,78]獲得的轉(zhuǎn)基因綿羊F1代的羊毛產(chǎn)量提高了6.2%，但F2代的羊毛產(chǎn)量提高效果卻不顯著。Bawden等[28]將毛角蛋白II基因在皮質(zhì)中特異性表達(dá)，獲得的轉(zhuǎn)基因羊毛結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，外觀富有光澤且卷曲度下降。多項(xiàng)獲得基因編輯綿羊的研究都證實(shí)轉(zhuǎn)基因個(gè)體羊毛產(chǎn)量比野生型綿羊有顯著提高[38,45]。Zhang等[58]通過(guò)顯微注射和Cas9技術(shù)敲除了基因獲得毛色發(fā)生變化的基因編輯綿羊。He等[34]通過(guò)睪丸注射進(jìn)行基因編輯也獲得了毛色變化的綿羊。

2.2 通過(guò)分子設(shè)計(jì)育種改變?nèi)猱a(chǎn)量及品質(zhì)

在改善綿羊產(chǎn)肉量及肉品質(zhì)方面是研究者投入精力最多的領(lǐng)域。Amdas等[19]獲得的轉(zhuǎn)生長(zhǎng)激素基因綿羊可過(guò)量表達(dá)生長(zhǎng)激素，使生長(zhǎng)速度增加同時(shí)減少脂肪含量。牛生長(zhǎng)激素[21]以及人生長(zhǎng)激素[6]都曾被轉(zhuǎn)入綿羊中以提高綿羊生長(zhǎng)速度。在提高產(chǎn)肉量方面，基因是大部分研究者選擇的靶基因。敲除的綿羊大部分能獲得生長(zhǎng)速度較快、體重顯著增加以及肌纖維增大的表型。Proudfoot等[16]、Crispo等[17]、Hu等[45]、Zhao等[48]、Li等[49]、Han等[50]以及Zhang等[56]通過(guò)TALEN或Cas9等方法結(jié)合顯微注射或體細(xì)胞核移植獲得了敲除綿羊，且取得預(yù)期表型。通過(guò)Cas9介導(dǎo)的基因單堿基編輯綿羊同樣表現(xiàn)出顯著提升的生長(zhǎng)速度[57]。綿羊肉品質(zhì)的改良主要集中在減少肌間脂肪含量和改善脂肪成分方向，主要通過(guò)導(dǎo)入外源基因和對(duì)脂肪代謝相關(guān)通路中成員進(jìn)行編輯來(lái)實(shí)現(xiàn)。目前，已獲得了[35]、[36]和[33,79]的轉(zhuǎn)基因綿羊。

圖4 利用遺傳修飾在綿羊中進(jìn)行分子設(shè)計(jì)育種的應(yīng)用方向

通過(guò)對(duì)性狀相關(guān)的基因進(jìn)行修飾，在綿羊中可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)方向的應(yīng)用，例如生產(chǎn)性狀，包括肉產(chǎn)量、肉質(zhì)、生長(zhǎng)速度等；毛纖維性狀，包括羊毛產(chǎn)量、結(jié)構(gòu)、毛色等；繁殖性狀，包括產(chǎn)羔數(shù)等；高抗病能力；制備人類疾病模型；通過(guò)乳腺反應(yīng)器生產(chǎn)藥物等。

2.3 通過(guò)分子設(shè)計(jì)育種進(jìn)行綿羊抗病及疾病模型研究

抗病育種研究主要包括針對(duì)病原體進(jìn)行干擾、針對(duì)內(nèi)源病原體受體進(jìn)行敲除、轉(zhuǎn)入具有病毒抗原的基因以及誘導(dǎo)動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗體4個(gè)方面。Denning等[30]通過(guò)基因敲除獲得了4只單等位基因敲除綿羊。Clements等[20]制備了轉(zhuǎn)入羊髓鞘脫落病毒核衣殼蛋白基因的綿羊，在該綿羊血液中檢測(cè)到了vvENV糖蛋白的抗體。Deng等[80]通過(guò)睡美人轉(zhuǎn)座子將口蹄疫病毒VP1蛋白轉(zhuǎn)入綿羊中，轉(zhuǎn)基因綿羊在體外攻毒實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出抗病能力。此外，基因也被轉(zhuǎn)入綿羊中獲得具有抗病能力的轉(zhuǎn)基因綿羊[32]。

在生物醫(yī)藥或人類疾病模型制備方面，主要包括綿羊乳腺生物反應(yīng)器制備藥物或建立人類疾病模型綿羊。從20世紀(jì)90年代起，出現(xiàn)了多個(gè)轉(zhuǎn)人凝血因子綿羊的報(bào)道，并可以在綿羊乳腺中獲得人凝血因子，用于治療血友病等血液疾病。2000年，McCreath等[31]將人α-1-抗胰蛋白基因定點(diǎn)整合在綿羊的基因中，獲得了首例基因打靶綿羊。人突變體轉(zhuǎn)基因綿羊的建立為人亨廷頓舞蹈癥的研究提供了疾病模型[27,46]。在動(dòng)物疾病模型領(lǐng)域，Denning等[30]獲得的敲除綿羊?yàn)楫惙N器官移植的研究奠定了基礎(chǔ)。Williams等[52]將基因進(jìn)行編輯，獲得了模擬人HPP (Hypophosphatasia)綜合征的綿羊模型。Vilarino等[53]獲得了基因敲除綿羊，同樣出現(xiàn)胰腺缺失的表型。Fan等[56]獲得的基因編輯綿羊，表現(xiàn)出與人囊性纖維化相似的表型。Menchaca等[61]將突變型通過(guò)Cas9介導(dǎo)的單鏈同源重組轉(zhuǎn)入綿羊中，獲得了耳聾模型的綿羊。Ma等[64]將褪黑激素(melatonin)基因轉(zhuǎn)入綿羊中，獲得了在乳腺中表達(dá)褪黑激素的轉(zhuǎn)基因綿羊。

2.4 通過(guò)分子設(shè)計(jì)育種改善綿羊繁殖性能

綿羊的繁殖性狀是羊?qū)嶋H生產(chǎn)中最受關(guān)注的性狀。影響綿羊產(chǎn)羔的主效基因?yàn)?，即骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMPR1B在A746G位置發(fā)生了氨基酸突變，該突變能顯著提高綿羊的產(chǎn)羔能力[59]。目前已有Cas9介導(dǎo)的基因編輯綿羊[59,60]，但其后代的產(chǎn)羔表型還未見報(bào)道。

除上述獲得的已知功能的基因修飾綿羊，還有部分綿羊中定位清晰但功能不完全明確的主效基因，也可做為后續(xù)基因編輯的研究對(duì)象，如與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的(bone morphogenetic protein 15)、(growth differentiation factor 9)等[81]；與綿羊椎骨數(shù)相關(guān)的(vertebrae development homolog)基因[82]；與改善肉質(zhì)相關(guān)的(melanocortin-4 receptor)基因[83]和(fatty acid-binding protein 4)[84]等。目前已經(jīng)在綿羊中開展遺傳修飾研究的基因及其相關(guān)功能見表4。這些研究為綿羊分子設(shè)計(jì)育種提供了可行的思路。

近年來(lái)，我國(guó)肉羊規(guī)?；B(yǎng)殖比例一直在提升，隨著養(yǎng)殖方式的轉(zhuǎn)變，生長(zhǎng)快、繁殖能力強(qiáng)且飼料轉(zhuǎn)化率高的舍飼肉羊品種將會(huì)愈發(fā)受市場(chǎng)認(rèn)可。但生長(zhǎng)、繁殖以及代謝這些性狀均為多基因控制復(fù)雜性狀，如何在傳統(tǒng)育種理論基礎(chǔ)上更好引入分子育種概念是需要探索的。一方面針對(duì)這些重要經(jīng)濟(jì)性狀的部分功能明確的主效基因，可直接利用以上的遺傳修飾方法快速獲得性能突出的基因編輯動(dòng)物做為育種新材料；另一方面對(duì)于目前尚不確定的功能位點(diǎn)，可以通過(guò)這些遺傳修飾手段直接在目標(biāo)動(dòng)物中驗(yàn)證功能位點(diǎn)的有效性，進(jìn)一步促進(jìn)育種過(guò)程中分子標(biāo)記輔助選擇的準(zhǔn)確度。

與豬()相比，綿羊中進(jìn)行遺傳修飾的研究無(wú)論在數(shù)量和質(zhì)量上都比較低。其原因首先在于兩個(gè)物種的養(yǎng)殖數(shù)量和研究重要性方面差距較大；其次從技術(shù)層面，豬為多胎動(dòng)物且養(yǎng)殖規(guī)模較大，卵母細(xì)胞相對(duì)容易獲得，體外培養(yǎng)體系更成熟，且細(xì)胞對(duì)體外環(huán)境的耐受性更好；另外豬的遺傳修飾模型除了涉及畜牧業(yè)，還常作為疾病模型或器官移植來(lái)源延伸到醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，因此更多的團(tuán)隊(duì)以豬為研究對(duì)象。相比較而言，綿羊繁殖能力低于豬，較難獲得大量的卵母細(xì)胞。目前在綿羊中進(jìn)行遺傳修飾操作的目的主要為品種遺傳改良，在疾病模型等領(lǐng)域研究較少。但是，綿羊也是醫(yī)學(xué)中神經(jīng)生物學(xué)以及脊柱發(fā)育研究等方面的良好研究對(duì)象，未來(lái)的綿羊分子設(shè)計(jì)育種研究也可以更多的應(yīng)用于建立醫(yī)用模型。

表4 重要性狀基因在基因修飾綿羊中的研究

3 遺傳修飾技術(shù)在綿羊中應(yīng)用的問題及展望

分子設(shè)計(jì)育種代表著未來(lái)種業(yè)的發(fā)展方向，近年來(lái)在遺傳修飾技術(shù)方面發(fā)展迅速，但總體看來(lái)家畜分子育種尤其是綿羊分子育種的研究還處于初級(jí)階段，距離商業(yè)化以及實(shí)際生產(chǎn)還有較長(zhǎng)路要走。其中的問題主要包括功能基因研究不夠明確，生產(chǎn)效率低且成本高，生產(chǎn)周期長(zhǎng)以及較難通過(guò)生物安全評(píng)價(jià)等。

3.1 功能基因選擇和表達(dá)調(diào)控研究不夠明確

分子生物學(xué)和基因組學(xué)研究經(jīng)過(guò)幾十年的迅猛發(fā)展，已經(jīng)取得了矚目的成就，但是對(duì)于畜禽大動(dòng)物尤其是綿羊而言，由于基因組的解析、基因功能的挖掘以及基因表達(dá)調(diào)控模式探究等方面的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于人類以及模式動(dòng)物，只有極少數(shù)性狀被定位到了致因突變并闡明了遺傳機(jī)理。而且綿羊和其他家畜的重要經(jīng)濟(jì)性狀大多為數(shù)量性狀，這類性狀存在多基因協(xié)同或拮抗表達(dá)或者存在印記效應(yīng)等，導(dǎo)致遺傳操作的難度較大。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因方法的隨機(jī)插入可能造成表達(dá)不穩(wěn)定，影響其他基因的表達(dá)；生長(zhǎng)相關(guān)基因敲除或突變，會(huì)造成動(dòng)物癱瘓或器官發(fā)育異常；繁殖相關(guān)基因突變，會(huì)造成母畜不育或難產(chǎn)等。這些問題僅通過(guò)革新基因編輯技術(shù)并不能從根本上解決。在畜禽大動(dòng)物上，可以通過(guò)可靠的遺傳資源群體、準(zhǔn)確的表型數(shù)據(jù)測(cè)定并結(jié)合現(xiàn)有的大數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳定位分析，同時(shí)利用分子生物學(xué)手段解析致因基因及突變的調(diào)控機(jī)理，最終利用合理的基因編輯手段獲得分子設(shè)計(jì)個(gè)體。但這個(gè)過(guò)程周期長(zhǎng)且耗費(fèi)大，需要團(tuán)隊(duì)合作。目前，已發(fā)現(xiàn)的可能影響綿羊表型的基因及其相應(yīng)的功能突變見表5。

3.2 制備遺傳修飾動(dòng)物的生產(chǎn)效率低且成本較高

在綿羊、山羊()和豬等大動(dòng)物中，無(wú)論是通過(guò)顯微操作技術(shù)還是體細(xì)胞核移植技術(shù)制備遺傳修飾動(dòng)物，都存在效率偏低的問題。通過(guò)顯微注射方法獲得基因編輯個(gè)體時(shí)，會(huì)存在產(chǎn)生的基因編輯個(gè)體嵌合現(xiàn)象，即產(chǎn)生的基因編輯后代個(gè)體中包含不同的基因型。其原因在于受精卵注射核酸后，沒有立即對(duì)胚胎進(jìn)行編輯，而在胚胎卵裂后才對(duì)不同細(xì)胞各自進(jìn)行編輯而產(chǎn)生不同的基因型，因此，應(yīng)盡快在受精后立即進(jìn)行顯微注射，以提高胚胎發(fā)育早期發(fā)生基因編輯的概率，從而降低產(chǎn)生嵌合后代的概率。此外，對(duì)注射核酸的總量及濃度也需要優(yōu)化調(diào)整。在綿羊、山羊和豬中通過(guò)顯微注射獲得遺傳修飾動(dòng)物的效率均可達(dá)到10%以上甚至更高，而體細(xì)胞核移植技術(shù)克隆效率低，且去核過(guò)程會(huì)對(duì)細(xì)胞質(zhì)造成較大損傷。通過(guò)克隆胚胎獲得基因編輯綿羊、山羊和豬的效率往往不超過(guò)5%，實(shí)驗(yàn)獲得綿羊、山羊和豬個(gè)體的效率統(tǒng)計(jì)見表6。

為了提高遺傳修飾動(dòng)物的效率，找到引發(fā)效率低下的原因是關(guān)鍵。不同動(dòng)物物種之間，影響遺傳修飾的因素以及陽(yáng)性個(gè)體獲得效率存在顯著差異。研究顯示，體細(xì)胞核移植制備克隆動(dòng)物的主要障礙包括移植后胚胎存活率低且容易流產(chǎn)，其主要原因?yàn)轶w細(xì)胞重編程過(guò)程中的多種表觀修飾障礙。在豬中，(retrotransposon-like-1)的甲基化異常是以豬誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent, iPS)為供體時(shí)克隆成功與否的重要影響因素，的敲除和代償實(shí)驗(yàn)證明克隆動(dòng)物的關(guān)鍵因素在于的表達(dá)是否正常[104]。制備克隆猴()的難點(diǎn)也在于胚胎發(fā)育過(guò)程中的甲基化修飾，例如存在H3K9三甲基化，當(dāng)添加了H3K9me3去甲基化酶KDM4D和組蛋白去乙?；窰DAC抑制劑TSA后，獲得了世界首例體細(xì)胞克隆猴[105]，表明在克隆猴過(guò)程中在培養(yǎng)體系中添加表觀遺傳修飾的抑制劑可以提高克隆效率。在克隆猴制備過(guò)程中供體細(xì)胞的選擇也比較關(guān)鍵，使用卵丘細(xì)胞做供體的克隆猴出生后不久便死亡，而使用胎兒成纖維細(xì)胞做供體時(shí)獲得了存活的克隆猴。此外，外源因子對(duì)重構(gòu)胚的發(fā)育也有影響。褪黑激素是一種抗氧化劑，具有清除活性氧的作用，通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，可減少DNA損傷，在體細(xì)胞核移植的胚胎發(fā)育液中添加褪黑激素等可以提高豬重構(gòu)胚的發(fā)育潛能，進(jìn)而提高克隆效率[106]。在綿羊中，也有通過(guò)在供體細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中添加表觀修飾抑制劑KDM4D提高克隆胚胎體外發(fā)育能力的報(bào)道[107]，表明表觀修飾對(duì)動(dòng)物克隆胚胎發(fā)育的影響存在普遍性，通過(guò)改善這些影響，可以提高獲得克隆動(dòng)物的效率。要根本解決克隆效率低的問題，對(duì)大動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程調(diào)控方式以及關(guān)鍵效應(yīng)通路等的基礎(chǔ)研究至關(guān)重要。

在實(shí)驗(yàn)操作方面，現(xiàn)有的受精卵電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)可以將sgRNA及Cas9的mRNA共轉(zhuǎn)入受精卵中，并通過(guò)Cas9作用對(duì)受精卵進(jìn)行編輯，這是獲得基因編輯動(dòng)物的簡(jiǎn)化方法[108]。顯微操作和體細(xì)胞核移植過(guò)程需要的顯微操作設(shè)備，成本較高，同時(shí)需要專門的技術(shù)人員操作，增加了培訓(xùn)和時(shí)間成本。對(duì)于提供受體動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)場(chǎng)，需要專門預(yù)留一定數(shù)量的優(yōu)質(zhì)后備母羊，在飼養(yǎng)成本上有所增加。

3.3 基因編輯新品種的生物安全評(píng)價(jià)和應(yīng)用

通過(guò)分子設(shè)計(jì)育種獲得的家畜要實(shí)現(xiàn)商業(yè)化所面臨的最大問題為生物安全評(píng)價(jià)。以CRISPR/Cas系統(tǒng)代表的人工核酸酶介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)已經(jīng)成為遺傳修飾的主流方法。我國(guó)對(duì)基因修飾動(dòng)植物(包括轉(zhuǎn)基因和基因編輯)的生物安全評(píng)價(jià)非常嚴(yán)格，目前在我國(guó)批準(zhǔn)上市的只有抗番木瓜環(huán)斑花葉病毒(papaya ringspot virus)的轉(zhuǎn)基因木瓜()和抗棉鈴蟲的轉(zhuǎn)基因棉花()。轉(zhuǎn)基因生物安全主要針對(duì)遺傳修飾動(dòng)植物是否會(huì)破壞生態(tài)平衡，是否會(huì)影響人們的健康等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)。目前還沒有確切的證據(jù)證實(shí)基因修飾動(dòng)植物在生物安全方面有安全隱患。例如轉(zhuǎn)基因牛產(chǎn)生的重組乳鐵蛋白飼喂小鼠實(shí)驗(yàn)中，長(zhǎng)期的飼喂未使小鼠出現(xiàn)顯著的臨床癥狀和行為異常[109]。遺傳修飾生物的排泄物是否會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生威脅也未有定論。即便如此，仍然需要制定完善的評(píng)價(jià)體系，針對(duì)食物毒性、過(guò)敏性、抗生素及營(yíng)養(yǎng)成分代謝等方面進(jìn)行安全評(píng)估。雖然基因編輯技術(shù)等遺傳修飾方法在育種應(yīng)用中受到了爭(zhēng)議，但不可忽視其巨大的應(yīng)用前景。在有嚴(yán)格的生物安全評(píng)價(jià)為保障基礎(chǔ)上，分子設(shè)計(jì)育種代表著未來(lái)家畜育種的發(fā)展方向，能夠促進(jìn)畜牧業(yè)發(fā)展。

目前，由于生物安全評(píng)價(jià)的限制，通過(guò)遺傳修飾育種獲得的動(dòng)物品種目前很難開展大規(guī)模的育種研究，更不可能實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。美國(guó)食品藥品監(jiān)督局分別在2009年、2014年和2015年批準(zhǔn)了基因修飾山羊、兔()和雞生產(chǎn)的藥物上市，而真正得以進(jìn)入食品領(lǐng)域的遺傳修飾動(dòng)物僅為2015年批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)生長(zhǎng)激素三文魚()和2020年批準(zhǔn)的敲除的基因編輯豬。目前批準(zhǔn)上市的品種僅僅是眾多研究成果的冰山一角，期望未來(lái)有越來(lái)越多的分子育種動(dòng)物產(chǎn)品走進(jìn)人們的視野。

在綿羊和其他農(nóng)業(yè)動(dòng)物中，仍然存在大量的遺傳變異位點(diǎn)未被解析。在未來(lái)的研究中，需要對(duì)適合育種的重要經(jīng)濟(jì)性狀位點(diǎn)進(jìn)行持續(xù)挖掘并結(jié)合不斷改進(jìn)的分子設(shè)計(jì)育種工具，創(chuàng)制和培育出能夠滿足人們健康生活質(zhì)量需求的動(dòng)物新品種。

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Application of genetic modification technologies in molecular design breeding of sheep

Haitao Wang1,2, Tingting Li3, Xun Huang1,2, Runlin Ma1,2,4, Qiuyue Liu1

Genetic modification technologies can be used for modifying animal genome to express exogenous genes or affect the function of endogenous genes. In animal breeding, genetic modification technologies allow the rapid generation of germplasms with beneficial traits. It includes traditional genetic modification, virus or sperm carrier-mediated genetic modification and nuclease-mediated genome editing, especially the CRISPR/Cas9, one of the artificial nuclease genome editing technologies, have been applied in genome editing in many domestic animals including sheep (). Compared with conventional strategies used for animal breeding, there is great value for sheep breeding improvement by using genome editing technology, which is more effective and timesaving. In this review, we summarize the approaches of genetic modification in sheep and discuss the possibility of molecular design and breeding of sheep by genome editing technologies. We also identify the potential bottlenecks and challenges of these technologies in sheep breeding.

sheep; genetic modification; genome editing; animal breeding

2021-03-08;

2021-04-14

中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)(A類)(編號(hào)：XDA24030205)資助[Supported by the Strategic Priority Research Program of Chinese Academy of Sciences (No. XDA24030205)]

王海濤，博士，博士后，研究方向：農(nóng)業(yè)動(dòng)物基因編輯。E-mail: wanght@genetics.ac.cn

馬潤(rùn)林，博士，研究員，研究方向：免疫功能基因組學(xué)與免疫遺傳學(xué)。E-mail: rlma@ucas.ac.cn

劉秋月，博士，副研究員，研究方向：肉羊遺傳育種。E-mail: qyliu@genetics.ac.cn

10.16288/j.yczz.21-087

2021/5/6 10:33:00

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20210430.1638.002.html

(責(zé)任編委: 姜雨)