祁鶴興，蘆光新*，李宗仁，徐成體，德科加，周孝娟，王英成，馬桂花

（1.青海大學農(nóng)牧學院，青海 西寧810016；2.青海大學畜牧獸醫(yī)科學院，青海 西寧810016）

青貯玉米（Zea mays）是指在適宜收獲期內(nèi)收獲包括果穗在內(nèi)的地上全部綠色植株，經(jīng)切碎、加工，適宜用青貯發(fā)酵的方法來制作青貯飼料以飼喂牛、羊等草食牲畜的一種玉米［1-2］。它與一般普通（籽粒）玉米相比具有生物產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富、氣味芳香、消化率較高、干物質(zhì)和水分含量適宜等特點［3］。青海屬于青藏高原玉米產(chǎn)區(qū)，玉米生產(chǎn)發(fā)展速度快、潛力大，特別是青貯玉米依其高產(chǎn)、高值、高質(zhì)的優(yōu)勢，已成為青海玉米發(fā)展的一個優(yōu)勢趨向［4］。

但是，青貯玉米葉斑病的發(fā)生制約著青貯產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。2018-2019年，本研究組在青海省海東市民和縣、西寧市湟中縣和大通縣、黃南藏族自治州尖扎縣青貯玉米種植區(qū)進行病害調(diào)查時發(fā)現(xiàn)鏈格孢葉枯病發(fā)生普遍，危害較大，而玉米常見病害大小斑病、灰斑病等偶有發(fā)生，對青貯玉米危害不大。鏈格孢屬真菌種類多且寄主范圍廣泛，嚴重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量，長期以來給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大損失［5-8］。鏈格孢菌致病主要是通過產(chǎn)生多種致病毒素，引起寄主植物病變［6，9］。鏈格孢屬真菌能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)各異的毒素化合物，使植物出現(xiàn)萎蔫、水浸狀、褪綠、壞死等癥狀［10-12］。鏈格孢產(chǎn)生的毒素對哺乳動物也有一定毒性，對同一生態(tài)環(huán)境中的其他生物也有影響［13］。人及動物攝入被鏈格孢毒素污染的谷物及飼料，可導致急性或慢性中毒，且某些鏈格孢毒素還有致畸、致癌、致突變作用［14-17］。

青貯玉米作為家畜飼料，高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)是生產(chǎn)目標。青貯玉米由于受到鏈格孢屬真菌的侵染，在青貯過程中可能對有益乳酸菌、酵母和其他霉菌產(chǎn)生影響［18-24］，并且在青貯過程中病原真菌也可能大量繁殖，進一步產(chǎn)生大量毒素化合物，對畜牧業(yè)生產(chǎn)造成影響。目前，國內(nèi)對玉米鏈格孢葉枯病的研究還較少，僅對云南?。?5］、黑龍江省［26］、甘肅省［27］和海南省［28］的玉米鏈格孢葉枯病有過報道。青海省青貯玉米鏈格孢葉枯病病原菌組成和致病力情況尚不清楚。因此為厘清青貯玉米鏈格孢葉枯病病原菌多樣性，本研究分離培養(yǎng)了大量病原菌，對其進行形態(tài)學和分子生物學鑒定，并進行致病力分析，旨在為后續(xù)研究青貯玉米與鏈格孢互作，利用鏈格孢毒素進行青貯玉米抗病性鑒定和開展綜合防治等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

于2018年8-9月在青海省西寧市大通縣景陽鎮(zhèn)甘樹灣村和海東市民和縣馬場垣鄉(xiāng)團結(jié)村青貯玉米種植區(qū)采集青貯玉米葉枯病病葉，于2019年9月在西寧市湟中縣田家寨李家臺村和黃南藏族自治州尖扎縣康楊鎮(zhèn)河灘村采集青貯玉米葉枯病病葉（表1）。在各采樣區(qū)內(nèi)，采用五點取樣法采集青貯玉米葉枯病葉片，保持葉片干燥通風，及時帶回實驗室分離病原菌。青貯玉米品種：金皇828、鐵研53號和中單2號由青海大學畜牧獸醫(yī)科學院提供。目前市面上尚無抗鏈格孢葉枯病的玉米品種，因此選用的3個品種分別是感病、中抗、高抗玉米大、小斑病的品種。

表1 采樣地信息Table 1 Information of sample sites

1.2 培養(yǎng)基配制

病原菌的分離使用2%水瓊脂培養(yǎng)基（2%WA）：瓊脂20 g，用蒸餾水定容至1 L；菌株培養(yǎng)使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：葡糖糖20 g，馬鈴薯200 g，瓊脂18 g，用蒸餾水定容至1 L。121℃高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

1.3 病原菌的分離、純化與保存

在病斑的病健交界處剪取0.5 cm×0.5 cm大小的組織，置于3.5%次氯酸鈉溶液中消毒1 min，用無菌水沖洗3次，再用無菌濾紙吸干，放在含0.1%氨芐青霉素的水瓊脂平板上，置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。用無菌水將長出的分生孢子洗下配成濃度為2×104個·mL-1的孢子懸浮液，使用移液槍吸取約200μL孢子懸浮液于2%水瓊脂平板上涂抹均勻，在超凈工作臺中晾干，于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至孢子萌發(fā)，在體視顯微鏡下用挑針挑取萌發(fā)的單個分生孢子至PDA平板。將分離到的單孢菌株采用濾紙片保存法，置于-20℃冰箱長期保存［29］。

1.4 病原菌的分類鑒定

1.4.1 菌株形態(tài)學鑒定 將分離得到的單孢代表菌株接種于PDA平板上，置于25℃培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)7 d，挑取分生孢子制成臨時玻片，在40×光學顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)。菌株在PDA平板上生長5 d后，用直徑0.5 mm的滅菌打孔器取菌餅放置在PDA平板中。每株菌株3次重復，并且每皿培養(yǎng)基的厚度要保持一致。放置于25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 d后，觀察菌落形態(tài)。

1.4.2 菌株基因組DNA的提取 采用CATB法提取基因組DNA［30］，步驟如下：1）刮取在PDA平板上培養(yǎng)了5 d的菌落氣生菌絲，置于DNA提取離心管中，用細胞破碎儀（MP FastPrep?-24，美國）破碎細胞。2）在離心管中加入2×CTAB抽提液600μL，混合均勻，65℃孵育30 min，每隔10 min顛倒混勻1次。3）孵育完成后，取出離心管，待其冷卻至室溫后，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），充分混勻后，12000 r·min-1、4℃離心15 min。4）吸取500μL上清液于1.5 mL滅菌離心管中，加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），充分混勻后12000 r·min-1、4℃、離心15 min。之后再吸取400μL上清液重復抽提1次。5）取上清液300μL，加入0.6倍體積的異丙醇，-20℃沉淀30 min。6）12000 r·min-1、4℃、離心15 min。7）棄上清液，用70%的乙醇洗沉淀2次，烘干，用25μL的TE/RNase溶解，-20℃保存。

1.4.3 菌株rDNA-ITS序列分析 擴增引物為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。反應體系（25μL）：2×PCR Mix（Takara）12.5μL；引物ITS1（25 pmol）1.0μL，引物ITS4（25 pmol）1.0μL；模板DNA（30μg.L-1）1.0μL；雙蒸水補足至25μL。PCR反應程序：95℃5 min，95℃1 min，55℃1 min，72℃2 min，30個循環(huán)，72℃10 min。用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物，PCR擴增產(chǎn)物純化后直接送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)公司進行測序。雙向測序，使用軟件MAFFT對正反向序列進行拼接，拼接序列用MEGA V.6.0.6軟件進行校正。使用PAUP*v.4.0 alpha軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用啟發(fā)式算法（heuristic searches）進行運算。以Mucor racemosus（GenBank登錄號：MT 530270）作為外群，運算重復1000次。19株參照菌株序列下載自NCBI數(shù)據(jù)庫。177株菌株GenBank登錄號為MW008873-MW009049。

1.5 菌株致病力測定

將菌株接種至PDA培養(yǎng)基平板，25℃培養(yǎng)7 d，用0.025%吐溫20溶液洗下分生孢子并制備濃度為1×105個·mL-1的孢子懸浮液。在直徑為12 cm塑料花盆中加入營養(yǎng)土種植青貯玉米。后剪取4～6葉期青貯玉米心葉中下部，采用離體劃傷法進行接種，用于接種的3種青貯玉米品種分別為金皇828、鐵研53號和中單2號。每株菌重復接種3個葉片，每個葉片均勻劃傷2處，在劃傷處接種10μL孢子懸浮液，以接種無菌水為對照，重復3次。25℃黑暗保濕培養(yǎng)24 h，之后25℃光照培養(yǎng)5～7 d，觀察青貯玉米葉片的發(fā)病情況。葉片發(fā)病嚴重度等級劃分標準：0級：無可見病斑；1級：病斑＜0.10 cm；3級：0.10 cm＜病斑＜0.25 cm；5級：0.25 cm＜病斑＜0.5 cm；7級：0.5 cm＜病斑＜1 cm；9級：1 cm＜病斑。

致病力情況：病情指數(shù)為0，不致??；病情指數(shù)為0～45，弱致病力；病情指數(shù)為45～75，中等致病力；病情指數(shù)為75～100，強致病力。

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯玉米鏈格孢葉枯病病原菌種類

從4個采樣地共分離得到177株病原菌，其中從尖扎縣、田家寨鎮(zhèn)、民和縣和大通縣分別分離得到19、57、38和63株菌株。結(jié)合菌落形態(tài)特征、分生孢子形態(tài)特征和菌株rDNA-ITS序列比對和分析，177株病原菌均為鏈格孢屬真菌。按序列相似性大于97%的菌株歸于同一個種的規(guī)則［31］，交鏈格孢（Alternaria alternata）、Alternaria sp、極細鏈格孢（A.tenuissima）和致密鏈格孢（A.compacta）個數(shù)最多，分別為50、38、31和27株，分離率分別為28.2%、21.5%、17.5%和15.2%。其次為蕓薹鏈格孢（A.brassicae）、狹卵鏈格孢（A.angustiovoidea）、茄鏈格孢（A.solani）、A.tamaricis、香蔥鏈格孢（A.porri），分別為9、7、5、5和2株，分離率分別為5.1%、4.0%、2.8%、2.8%和1.1%。喬木鏈格孢（A.arborescens）、A.quercicola和A.infectoria菌株個數(shù)最少，均為1株，分離率均為0.6%（圖1）。不同種的菌落形態(tài)和分生孢子形態(tài)特征存在差異，如圖2所示，菌株JZYM-2與A.infectoria的序列相似性為99.47%，該菌株菌絲較為發(fā)達，呈淺青黃色，分生孢子略呈黃色，橫、縱格明顯。菌株TJZYM-I與交鏈格孢的序列相似性為99.45%，該菌株菌絲發(fā)達，呈棕黑色，分生孢子橫、縱格明顯，孢體較大。菌株JZYM-14與茄鏈格孢的序列相似性為99.62%，該菌株菌絲淡青色，生長緩慢，分生孢子呈淺黃褐色且橫、縱格明顯，孢體較長。

圖1 青貯玉米鏈格孢葉枯病病菌的種類及其分離率Fig.1 Species and separation rate of the pathogens associated with Alternaria leaf blight in silage maize

圖2 青貯玉米鏈格孢葉枯病病原菌代表菌株菌落形態(tài)和分生孢子形態(tài)Fig.2 Colony and conidium morphology of represent pathogens associated with Alternaria leaf blight in silage maize

2.2 青貯玉米鏈格孢葉枯病病原菌rDNA-ITS序列分析

根據(jù)形態(tài)特征和rDNA-ITS序列分析結(jié)果，合并形態(tài)和序列相同的菌株，選取52株代表菌株，將所測得代表菌株的rDNA-ITS序列在GenBank中與已知的rDNA-ITS序列進行BLASTs相似性比較分析，以已在NCBI公布rDNA-ITS序列的19株菌株作為參考菌株，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定菌株的分類地位（圖3）。從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，共計71株菌株以大于等于88.00%的支持率被分為11個分支。菌株JZYM-4、TJZYM-344、和JZYM-18等8株菌株與交鏈格孢（A.alternata）在同一個發(fā)育分支上，親緣關(guān)系最近，rDNA-ITS序列相似性均大于99.00%；菌株JZYM-14和TJZYM-117等4株菌株與茄鏈格孢（A.solani）在同一發(fā)育分支上，親緣關(guān)系最近；菌株JZYM-23、DT 18123-A和DT 1855-A與A.tamaricis在同一發(fā)育分支上，親緣關(guān)系最近；菌株DT 1810-B和DT 18137-B與香蔥鏈格孢（A.porri）在同一發(fā)育分支上，親緣關(guān)系最近，rDNA-ITS序列相似性均大于99.00%；菌株JZYM-2、JZYM-3和DT 1824-B分別與A.infectoria、A.quercicola和喬木鏈格孢（A.arborescens）在同一個發(fā)育分支上，親緣關(guān)系最近，rDNA-ITS序列相似性分別為99.47%、99.82%和99.07%。

圖3 52株青貯玉米鏈格孢葉枯病病原菌代表菌株基于r DNA-ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The plylogenetic tree of represent pathogens associated with Alternaria leaf blight in silage maize was inferred from r DNAITSsequences

2.3 青貯玉米鏈格孢葉枯病病原菌致病力分析

采用離體葉片劃傷接種法對155株鏈格孢葉枯病病菌致病力進行測定，共測定了這些菌株對金皇828、鐵研53號和中單2號3種青貯玉米的致病力。接種后發(fā)病病斑與田間發(fā)病癥狀一致，呈橢圓形、近圓形水漬狀病斑，病健交界明顯。接種發(fā)病病斑經(jīng)保濕培養(yǎng)36 h后，用10×光學顯微鏡能觀察到分生孢子和菌絲形態(tài)，從發(fā)病病斑分離得到的菌株與野生型菌株菌落形態(tài)一致（圖4）。

接種結(jié)果表明155株病原菌都可以侵染這3種青貯玉米，但是菌株致病力存在差異。如大通分離菌株DT 18131-B接種鐵研53號、金皇828、中單2號后病情指數(shù)分別為85.19、97.53和82.72，該菌株致病力強；民和分離菌株MH 1862-B接種這3個品種后病情指數(shù)分別為62.96、65.43和63.10，該菌株致病力中等；尖扎分離菌株JZYM-218接種這3個品種后病情指數(shù)分別為40.74、23.46和24.07，該菌株為弱致病力。大部分菌株對這3種青貯玉米的致病力存在差異，如民和分離菌株MH 1829-B對鐵研53號致病力很強（病情指數(shù)為82.72%），對金皇828和中單2號的致病力依次減弱（病情指數(shù)分別為67.90和37.78）（圖4，表2）。155株菌株接種鐵研53號、金皇828和中單2號后強致病力菌株分別有68、69和64株；中等致病力菌株分別有56、60和58株；弱致病力菌株分別有31、26和33株（圖5）。

表2 病原菌接種青貯玉米病情指數(shù)和致病力分析Table 2 Pathogenicity analysis of pathogens associated with Alternaria leaf blight in silage maize

圖4 青貯玉米鏈格孢葉枯病病原菌科赫氏法則驗證Fig.4 Verification of Koch’s postulate of the pathogens associated with Alternaria leaf blight in silage maize

圖5 青貯玉米鏈格孢葉枯病的代表病原菌接種Fig.5 Inoculation of r epresent pathogens associated with Alternaria leaf blight in silage maize

續(xù)表2 Continued Table2

3 討論

已有研究表明近十年來，我國玉米病害除了大斑病、小斑病和灰斑病外，新發(fā)生的病害鏈格孢葉枯病也日趨嚴重［26］。本研究通過對分離得到的青貯玉米葉部病害病原菌的鑒定發(fā)現(xiàn)，鏈格孢屬為病原菌優(yōu)勢屬，而平臍蠕孢屬（Bipolaris）和彎孢屬（Curvularia）數(shù)量很少（數(shù)據(jù)未列出）。因此結(jié)合前期田間癥狀觀察和后期對病原菌的分類鑒定，發(fā)現(xiàn)青海省青貯玉米葉部病害中鏈格孢葉枯病最為嚴重。4個采樣點的海拔高度、土壤類型、平均氣溫、年均降水量和種植背景都存在差異，因此對177株菌株的研究結(jié)果可以反映青海省青貯玉米鏈格孢葉枯病病原菌的整體情況。

鏈格孢屬真菌存在共同侵染現(xiàn)象，2019年，Rajarammohan等［32］報道2株交鏈格孢菌株（A.alternata）和1株蕓薹鏈格孢菌株（A.brassicae）可以共同侵染油菜（Brassica napus）。2016年，Hou等［33］報道長柄鏈格孢（A.longipes）和交鏈格孢（A.alternata）可共同引起煙草（Nicotiana tabacum）褐斑病。2019年，Ayad等［34］報道，茄鏈格孢（A.solani），A.protenta，A.grandis和A.linariae可共同引起阿爾及利亞馬鈴薯（Solanum tuberosum）和番茄（Lycopersicon esculentum）早疫病。本研究也發(fā)現(xiàn)青貯玉米鏈格孢葉枯病是由多種鏈格孢屬真菌共同侵染造成的，青貯玉米鏈格孢葉枯病病原菌菌落和孢子形態(tài)多樣，交鏈格孢（A.alternata）、Alternaria sp、極細鏈格孢（A.tenuissima）和致密鏈格孢（A.compacta）為病原菌優(yōu)勢種。

對155株病原菌致病力的測定結(jié)果表明，病原菌存在致病力分化現(xiàn)象。已有研究報道表明鏈格孢屬真菌存在致病力分化現(xiàn)象，如2010年鄭寰宇［35］對馬鈴薯早疫病菌（A.solani）的研究和2013年邵旭平等［36］對甘肅省蘋果（Malus domestica）鏈格孢葉斑病病原蘋果鏈格孢（A.mali）進行研究時都發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象。青貯玉米葉片接種發(fā)病后病斑呈現(xiàn)萎蔫、水浸狀、褪綠、壞死等癥狀，推測病原真菌毒素在致病過程中起到重要作用。

4 結(jié)論

2018-2019 年，通過2年的實地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，青貯玉米鏈格孢葉枯病在青海本地普遍發(fā)生，本研究對177株病原菌進行了初步鑒定，為后續(xù)開展病害防治和流行學研究等提供了基礎(chǔ)。用于致病力測定的3種青貯玉米品種鐵研53號、金皇828和中單2號對鏈格孢葉枯病病原菌的抗性較差，因此后續(xù)進行抗性品種的選育工作對于防治該病害至關(guān)重要。