陳 杰，王 嫣，張維敏，趙 笛，張凌瑗，詹啟敏

北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所分子腫瘤學(xué)研究室，惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100142

食管癌是常見(jiàn)的消化道腫瘤，中國(guó)是食管癌高發(fā)國(guó)家之一，世界上超過(guò)50%的食管癌發(fā)生在中國(guó)［1-3］?，F(xiàn)階段中國(guó)食管癌患者5年生存率為30.3%。食管癌有兩種主要的病理學(xué)類(lèi)型，分別為食管鱗癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）。在中國(guó)，食管癌的類(lèi)型主要為ESCC，占95%以上。臨床上治療ESCC的一線化療藥物主要為順鉑，但是其效果不佳，極易出現(xiàn)耐藥。此外，ESCC分子分型不明確，導(dǎo)致很多基于分子靶點(diǎn)開(kāi)展的靶向治療的效果仍存在爭(zhēng)議。因此，闡明誘導(dǎo)ESCC進(jìn)展的分子機(jī)制將為治療ESCC提供有效的分子靶點(diǎn)。

缺氧是介導(dǎo)實(shí)體瘤進(jìn)展的重要因素［4］。臨床研究［5］顯示，缺氧與腫瘤患者不良預(yù)后密切相關(guān)。在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中，缺氧能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞代謝改變、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）及腫瘤干細(xì)胞形成，使腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，并產(chǎn)生放化療抵抗［6-8］。研究［9］發(fā)現(xiàn)，缺氧能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自分泌細(xì)胞因子，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。本研究將篩選缺氧誘導(dǎo)ESCC細(xì)胞中細(xì)胞因子表達(dá)譜，并重點(diǎn)研究白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-7對(duì)缺氧情況下ESCC進(jìn)展的影響。

1 材料和方法

1.1 試劑與耗材

IL-7中和抗體（貨號(hào)：MAB207）及IL-7酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（貨號(hào)：HS750）均購(gòu)自美國(guó)R&D公司，細(xì)胞因子陣列蛋白芯片（貨號(hào)：AAH-CYT-6）及蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）定量ELISA活性檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：PELAKT-S473-T-1）購(gòu)自美國(guó)RayBiotech公司，MTS檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：G3580）購(gòu)自美國(guó)Progema公司，RPMI-1640培養(yǎng)基（貨號(hào)：A1049101）及胎牛血清（貨號(hào)：10099）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，transwell侵襲小室（貨號(hào)：CLS3422）購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人ESCC細(xì)胞系KYSE410和KYSE30均由惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)胞在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。常氧培養(yǎng)條件為：37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%。缺氧培養(yǎng)條件為：37 ℃、N2體積分?jǐn)?shù)為94%、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、O2體積分?jǐn)?shù)為1%。

1.3 細(xì)胞因子陣列蛋白芯片檢測(cè)細(xì)胞因子分泌

將KYSE410細(xì)胞分別置于常氧及缺氧條件下培養(yǎng)。24 h后，收集上清液，將1 mL細(xì)胞上清液與包被細(xì)胞因子抗體的蛋白芯片于4 ℃過(guò)夜溫育。之后棄上清液，加入洗液清洗蛋白芯片后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素（horseradish peroxidase-streptavidin，HRP-SA）室溫溫育2 h后，洗去HRP-SA，加入顯色液曝光顯影。

1.4 MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔3 000個(gè)細(xì)胞的密度均勻接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，置于缺氧培養(yǎng)環(huán)境并加入磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）及IL-7中和抗體。48 h后，每孔加入10 μL MTS溶液。使用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處每孔的吸光度（D）值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次取平均值。

1.5 侵襲遷移實(shí)驗(yàn)

將KYSE410及KYSE30在不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中于常氧培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。12 h后，收集細(xì)胞，以每孔10 000/200 μL的密度接種于覆蓋（侵襲實(shí)驗(yàn)）或不覆蓋基質(zhì)膠（遷移實(shí)驗(yàn)）的transwell小室的上室，下室中加入1 mL含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，缺氧培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h后取出小室，甲醇固定5 min，結(jié)晶紫染色30 min后，擦去上室內(nèi)的細(xì)胞。顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次取平均值。

1.6 ELISA法檢測(cè)IL-7分泌及AKT活性

在檢測(cè)IL-7分泌的過(guò)程中，將KYSE410及KYSE30細(xì)胞分別置于常氧及缺氧培養(yǎng)條件下。24 h后，收集上清液，將20 μL樣本與80 μL樣本稀釋液混勻后，加入96孔板中，室溫溫育2 h后，洗掉樣本。逐步加入一抗稀釋液、洗脫、加入HRP-SA、洗脫、加入顯色液、置于室溫避光溫育30 min后，加入終止液，混勻后酶標(biāo)儀檢測(cè)D值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

在檢測(cè)AKT活性的過(guò)程中，將KYSE410及KYSE30細(xì)胞分別置于常氧及缺氧培養(yǎng)條件下。24 h后，收集細(xì)胞，用裂解液裂解蛋白，將蛋白裂解液（約20 μg/孔）加入96孔板后，按照試劑盒使用說(shuō)明檢測(cè)腫瘤細(xì)胞AKT活性（磷酸化AKT Ser473的D值/總AKT的D值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次取平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 7.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以的形式表示。獨(dú)立兩組間比較使用非配對(duì)t檢驗(yàn)。量效關(guān)系使用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧誘導(dǎo)ESCC細(xì)胞中細(xì)胞因子及趨化因子表達(dá)譜改變

缺氧微環(huán)境可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞因子分泌增強(qiáng)，但是缺氧對(duì)ESCC細(xì)胞中細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)控仍未可知。為明確缺氧調(diào)控ESCC細(xì)胞中哪些細(xì)胞因子，本研究采用細(xì)胞因子陣列蛋白芯片技術(shù)分析常氧狀態(tài)下ESCC細(xì)胞系KYSE410與缺氧狀態(tài)下KYSE410中的細(xì)胞因子表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)缺氧處理24 h后，KYSE410細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，如IL-10、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-7、單核細(xì)胞趨化蛋白2（monocyte chemoattractant protein 2，MCP2）、C-C趨化因子配體（C-C motif chemokine ligand，CCL）5、CCL17、CCL18及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等。這些細(xì)胞因子均與腫瘤進(jìn)展關(guān)系密切，參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、血管新生及免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用。其中，ESCC細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下IL-7的分泌增高最為明顯（圖1）。

圖1 缺氧誘導(dǎo)KYSE410細(xì)胞中細(xì)胞因子表達(dá)譜改變Fig.1 Hypoxia induced the expression profile of cytokines and chemokines of KYSE410 cell

2.2 缺氧誘導(dǎo)ESCC細(xì)胞中IL-7分泌增強(qiáng)

進(jìn)一步研究缺氧是否可以介導(dǎo)ESCC細(xì)胞中IL-7分泌增多，以常氧條件培養(yǎng)的KYSE410、KYSE30細(xì)胞系為常氧組，缺氧24 h培養(yǎng)的KYSE410、KYSE30細(xì)胞系為缺氧組，并通過(guò)ELISA法分析兩個(gè)細(xì)胞系中IL-7的分泌情況。ELISA法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺氧顯著誘導(dǎo)ESCC細(xì)胞系中IL-7的分泌。對(duì)照組KYSE410細(xì)胞IL-7分泌量為（275.70±82.98）pg/mL，實(shí)驗(yàn)組KYSE410細(xì)胞IL-7分泌量為（2 451.00±87.90）pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；對(duì)照組KYSE30細(xì)胞IL-7分泌量為（325.80±85.46）pg/mL，實(shí)驗(yàn)組KYSE410細(xì)胞IL-7分泌量為（2 653.00±126.70）pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖2）。

圖2 缺氧誘導(dǎo)KYSE410及KYSE30細(xì)胞中IL-7分泌增強(qiáng)Fig.2 Hypoxia induced the IL-7 secretion from KYSE410 and KYSE30 cells

2.3 IL-7中和抗體抑制缺氧狀態(tài)下ESCC細(xì)胞的增殖

在缺氧狀態(tài)下（48 h），以PBS為對(duì)照，采用不同濃度的IL-7中和抗體（5、10 μg/mL）處理KYSE410及KYSE30細(xì)胞。MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-7中和抗體能夠劑量依賴(lài)性地抑制ESCC細(xì)胞系增殖。對(duì)照組KYSE410細(xì)胞相對(duì)增殖率（與本組比較）為1.000±0.055，IL-7中和抗體（5 μg/mL）處理KYSE410細(xì)胞組相對(duì)增殖率（與對(duì)照組比較）為0.610±0.026，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。IL-7中和抗體（10 μg/mL）處理KYSE410細(xì)胞組相對(duì)增殖率（與對(duì)照組比較）為0.326±0.022，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。對(duì)照組KYSE30細(xì)胞相對(duì)增殖率（與本組比較）為1.000±0.036，IL-7中和抗體（5 μg/mL）處理KYSE30細(xì)胞組相對(duì)增殖率（與對(duì)照組比較）為0.673±0.019，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。IL-7中和抗體（10 μg/mL）處理KYSE30細(xì)胞組相對(duì)增殖率（與對(duì)照組比較）為0.359±0.017，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖3）。

圖3 IL-7中和抗體抑制缺氧狀態(tài)下KYSE410及KYSE30細(xì)胞的增殖Fig.3 IL-7 neutralizing antibody inhibited proliferation of KYSE410 and KYSE30 cells under hypoxia

2.4 IL-7中和抗體抑制缺氧狀態(tài)下ESCC細(xì)胞的侵襲及遷移

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，隨著IL-7中和抗體（5、10 μg/mL）濃度的增高，缺氧狀態(tài)下，ESCC細(xì)胞系KYSE410及KYSE30侵襲及遷移能力顯著降低。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組KYSE410細(xì)胞相對(duì)侵襲率（與本組比較）為1.000±0.117，IL-7中和抗體（5 μg/mL）處理KYSE410細(xì)胞組相對(duì)侵襲率（與對(duì)照組比較）為0.388±0.070，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。IL-7中和抗體（10 μg/mL）處理KYSE410細(xì)胞組相對(duì)侵襲率（與對(duì)照組比較）為0.174±0.025，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。對(duì)照組KYSE30細(xì)胞相對(duì)侵襲率（與本組比較）為1.000±0.090，IL-7中和抗體（5 μg/mL）處理KYSE30細(xì)胞組相對(duì)侵襲率（與對(duì)照組比較）為0.433±0.040，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。IL-7中和抗體（10 μg/mL）處理KYSE30細(xì)胞組相對(duì)侵襲率（與對(duì)照組比較）為0.210±0.037，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖4A）。遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組KYSE410細(xì)胞相對(duì)遷移率（與本組比較）為1.000±0.162，IL-7中和抗體（5 μg/mL）處理KYSE410細(xì)胞組相對(duì)遷移率（與對(duì)照組比較）為0.450±0.080，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。IL-7中和抗體（10 μg/mL）處理KYSE410細(xì)胞組相對(duì)遷移率（與對(duì)照組比較）為0.163±0.028，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。對(duì)照組KYSE30細(xì)胞相對(duì)遷移率（與本組比較）為1.000±0.100，IL-7中和抗體（5 μg/mL）處理KYSE30細(xì)胞組相對(duì)遷移率（與對(duì)照組比較）為0.272±0.063，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。IL-7中和抗體（10 μg/mL）處理KYSE30細(xì)胞組相對(duì)遷移率（與對(duì)照組比較）為0.160±0.049，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖4B）。

圖4 IL-7中和抗體抑制缺氧狀態(tài)下KYSE410及KYSE30細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移Fig.4 IL-7 antibody inhibited invasion or migration of KYSE410 and KYSE30 cells under hypoxia

2.5 IL-7中和抗體抑制缺氧狀態(tài)下ESCC細(xì)胞中信號(hào)分子AKT的活性

本研究通過(guò)ELISA法分析缺氧對(duì)ESCC細(xì)胞系中AKT活性的影響，結(jié)果顯示，缺氧24 h后，ESCC細(xì)胞系KYSE410及KYSE30中AKT Ser473活性顯著上調(diào)（圖5A）。對(duì)照組KYSE410細(xì)胞AKT活性為0.454±0.019，實(shí)驗(yàn)組KYSE410細(xì)胞AKT活性為0.744±0.047，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），對(duì)照組KYSE30細(xì)胞AKT活性為0.462±0.037，實(shí)驗(yàn)組KYSE30細(xì)胞AKT活性為0.809±0.064，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖5A）。外加IL-7中和抗體能夠有效地抑制KYSE410及KYSE30細(xì)胞中AKT Ser473的磷酸化激活（圖5B）。對(duì)照組KYSE410細(xì)胞AKT活性為0.756±0.058，IL-7中和抗體（5 μg/mL）處理KYSE410細(xì)胞組AKT活性為0.441±0.038，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。IL-7中和抗體（10 μg/mL）處理KYSE410細(xì)胞組AKT活性為0.214±0.028，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。對(duì)照組KYSE30細(xì)胞AKT活性為0.815±0.082，IL-7中和抗體（5 μg/mL）處理KYSE30細(xì)胞組AKT活性為0.472±0.04，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。IL-7中和抗體（10 μg/mL）處理KYSE30細(xì)胞組AKT活性為0.234±0.029，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖5B）。

圖5 IL-7中和抗體抑制缺氧狀態(tài)下KYSE410及KYSE30細(xì)胞中AKT活性Fig.5 IL-7 antibody inhibited the AKT activity of KYSE410 and KYSE30 cells under hypoxia

A:Quantitative ELISA assay was used to evaluate theDvalue of pAKT Ser473/theDvalue of total AKT (AKT activity) in KYSE410 and KYSE30 cells under normoxic or hypoxic condition for 24 h.B:Quantitative ELISA assay was applied to examine the AKT activity in KYSE410 and KYSE30 cells treated with PBS (control solvent),or IL-7 antibody (5,10 μg/mL),under hypoxia for 24 h.**:P＜0.001,compared with normoxia;***:P＜0.001,compared with control group

3 討論

本研究顯示，缺氧可誘導(dǎo)ESCC細(xì)胞中多種細(xì)胞因子及趨化因子的自分泌表達(dá)，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-7、IL-10、MCP2及CCL5等。其中，TNF-α、IL-1β及IL-10是慢性炎癥與腫瘤關(guān)聯(lián)的重要細(xì)胞因子，這些因子的多態(tài)性與腫瘤進(jìn)展關(guān)系密切［10］。IL-6能夠通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞可塑性、介導(dǎo)化療耐藥，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。腫瘤微環(huán)境釋放的CCL5，能夠通過(guò)作用于腫瘤細(xì)胞中相應(yīng)受體CCR5，介導(dǎo)腫瘤的多種惡性表型［11］。因此，細(xì)胞因子的活性增強(qiáng)是調(diào)控腫瘤進(jìn)展的重要因素之一。

本研究重點(diǎn)闡明了IL-7作為缺氧誘導(dǎo)細(xì)胞因子，介導(dǎo)ESCC進(jìn)展及相關(guān)分子機(jī)制。IL-7能夠產(chǎn)生廣泛免疫效應(yīng)，在免疫細(xì)胞活化過(guò)程、產(chǎn)生免疫應(yīng)答效應(yīng)、調(diào)控自身免疫性疾病及抗纖維化中具有重要作用，是細(xì)胞因子研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)因子。在腫瘤學(xué)領(lǐng)域，IL-7與腫瘤關(guān)系復(fù)雜。其中，IL-7參與多種免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤生長(zhǎng)增殖的調(diào)控。在嵌合抗原受體T（chimeric antigen receptor T，CAR-T）細(xì)胞免疫療法中，CAR-T細(xì)胞中高表達(dá)的IL-7能夠增加免疫細(xì)胞在局部實(shí)體瘤的浸潤(rùn)并增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的抗癌效應(yīng)［12］。但是，IL-7的受體IL-7R是一個(gè)重要的癌基因，IL-7/IL-7R軸能夠通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖并抵抗凋亡［13］。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，加入IL-7重組蛋白能夠通過(guò)激活前列腺癌細(xì)胞中AKT/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而增強(qiáng)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-3及MMP-9分泌，促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞侵襲能力的增強(qiáng)［14］。本研究顯示，缺氧ESCC細(xì)胞中自分泌產(chǎn)生的IL-7能夠介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，拮抗IL-7的功能顯示，抑制缺氧狀態(tài)下ESCC細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，證實(shí)IL-7是介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞在缺氧微環(huán)境中進(jìn)展的重要細(xì)胞因子。

研究［15］顯示，細(xì)胞因子介導(dǎo)腫瘤進(jìn)展主要與激活腫瘤細(xì)胞中的信號(hào)通路有關(guān)。IL-6可以通過(guò)激活JAK家族激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與激活轉(zhuǎn)錄因子通路促進(jìn)多種腫瘤進(jìn)展，且此信號(hào)軸是腫瘤治療中重要的靶點(diǎn)信號(hào)軸。多種細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1、IL-8、MIP2及CCL2等，均與腫瘤細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路的激活及多種惡性細(xì)胞表型的形成密切相關(guān)［16］。有研究［17-18］顯示，IL-7能夠通過(guò)激活信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，如磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/AKT通路及JAK1/Stat5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。AKT是介導(dǎo)ESCC進(jìn)展最重要的信號(hào)分子，本研究結(jié)果顯示，拮抗IL-7的功能能夠顯著抑制缺氧條件下ESCC細(xì)胞中AKT的活性，但I(xiàn)L-7能否也通過(guò)調(diào)控其他信號(hào)分子，進(jìn)而誘導(dǎo)ESCC進(jìn)展仍有待于進(jìn)一步研究。

本研究通過(guò)蛋白芯片技術(shù)研究缺氧介導(dǎo)ESCC細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá)情況，并研究了IL-7對(duì)缺氧促進(jìn)ESCC進(jìn)展的影響及相關(guān)分子機(jī)制，為深入研究缺氧-細(xì)胞因子軸介導(dǎo)腫瘤進(jìn)展提供了新思路。