禹 陽，林 歡，王云鵬，馬佩勇，賈趙東，謝一芝，邊小峰

(1. 江蘇省農業(yè)科學院 糧食作物研究所，南京 210014；2. 淮陰工學院 生命科學與食品工程學院，江蘇淮安 223003)

在中國，甘薯作為僅次于水稻、小麥和玉米的主要糧食作物，不僅富含人們日常所需的各種營養(yǎng)成分，還含有大量功能性成分，如綠原酸(Chlorogenic acid，CGA)、黃酮類、脫氫表雄酮等[1]。

綠原酸是植物苯丙素類次生代謝產物之一，具有多種生物活性，如抗氧化、抗病毒、抑菌、調節(jié)糖脂代謝等[2-4]。狹義上，綠原酸指由咖啡酸(Caffeic acid)與奎寧酸(Quinic acid)組成的咖啡單寧酸(5-O-Caffeoylquinic acid)[5]。綠原酸在植物中通常以多種異構體形式共存，因此廣義上的綠原酸系指由奎寧酸與反式肉桂酸(trans-Cinnamic acids)縮合而成的酯類化合物家族，常見的反式肉桂酸有咖啡酸、p-香豆酸(p-Coumaric acid)和阿魏酸(Ferulic acid)[6-7]。甘薯可食用部位中均含有綠原酸，包括葉、莖、葉柄及儲藏根，其中葉中含量較高[8-9]。

目前，已報道的綠原酸合成途徑在不同植物間存在一定差異，但基本包括苯丙氨酸解氨酶(L-phenylalanin ammonia-lyase，PAL)、肉桂酰-4-羥化酶(Cinnidine-4-hydroxylase，C4H)、4-羥基桂皮酰輔酶A連接酶(4-coumaroyl-CoA-ligase，4CL)、羥基桂皮酰輔酶A莽草酸/奎尼酸羥基桂皮酰轉移酶(Hydroxycinnamoyl-CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyl transferase，HCT)、香豆酸羥基化酶(p-Coumarate3-hydroxylase，C3H)、羥基桂皮酰輔酶A奎尼酸羥基轉移酶(Hydroxycinnamoyl-CoA quinate hydroxycinnamoyl transferase，HQT)和UDP葡萄糖肉桂酸葡萄糖基轉移酶(UDP glucose: cinnamate glucosyl transferase，UGCT)等關鍵酶基因[10]。

有關甘薯綠原酸的研究多集中于其提取和生物活性，對其合成調控尚未見報道，其合成過程中參與的重要酶、關鍵基因和調控因子都急需分析研究。基于轉錄組分析及同源克隆，Yu等[11]已從甘薯栽培種(‘蘇薯16號’，由江蘇省農業(yè)科學院選育)中分離克隆了部分甘薯綠原酸合成途徑相關酶基因?；诖耍狙芯恳?種不同類型甘薯品種為材料，通過分析不同甘薯品種可食用部位中綠原酸含量和合成途徑相關基因的表達差異，探討甘薯可食用部位中綠原酸合成與相關基因組織表達的關系，為培育高綠原酸含量甘薯品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與樣品準備

供試品種包括3個葉菜用型甘薯品種‘福薯7-6’(Fushu 7-6，F(xiàn)7-6)‘福菜薯18號’(Fucaishu No.18，F(xiàn)C18)及‘寧菜薯1號’(Ningcaishu No.1，NC1)和3個鮮食型甘薯品種‘蘇薯16號’(Sushu No.16，S16)‘寧紫薯1號’(Ningzishu No.1，NZ1)及‘寧紫薯4號’(Ningzishu No.4，NZ4)(表1)。

表1 6個供試品種概況Table 1 Six tested-cultivars

試驗材料于2018年5月28日在江蘇省農業(yè)科學院試驗地栽插，種植和田間管理按常規(guī)方法進行。每品種3行，每行10株，行株距為 80 cm×25 cm。綠原酸含量測定樣品采集：于8月1日地上莖葉封壟后采收莖尖(第5片完全葉以上部位)，10月25日收獲儲藏根。選取長勢一致、無病蟲害的莖尖和儲藏根為試驗材料，105 ℃殺青30 min，65 ℃烘干后粉碎，過40目篩后密封低溫保存?zhèn)溆??；虮磉_分析樣品采集：于8月1日每品種隨機選取5株長勢一致、無病蟲害的植株，分別采取莖尖(第5片完全葉以上部位，Stem-apex)和儲藏根(Storage root)，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱，備用。

1.2 甘薯綠原酸提取及測定

1.2.1 綠原酸標準曲線的繪制 綠原酸標準品購于Sigma公司，準確稱取5.00 mg，加50%甲醇超聲溶解定容于50 mL容量瓶。制成的標準液經紫外分光光度計200～400 nm波長掃描，得到綠原酸的最大吸收峰327 nm。將0.1 mg/mL的綠原酸標準品溶液分別稀釋成1,2,5,10,20 μg/mL，在吸收光波長327 nm處測定其吸光度。以標準液濃度(mg/mL)為橫坐標x，吸光值為縱坐標y，作出綠原酸標準曲線：y= 59.411x+ 0.023(R2=0.995 6)。

1.2.2 樣品綠原酸含量的測定 參照前人報道的甘薯綠原酸提取方法[12-13]，并進行部分改善，具體操作如下：稱取0.2 g樣品干粉置于具塞錐形瓶中，加50%甲醇20 mL，浸提24 h后50 ℃超聲30 min，0.45 μm有機濾膜抽濾，濾液另存于50 mL具塞容量瓶中，濾渣加50%甲醇20 mL，重復超聲30 min并抽濾。合并兩次濾液，用50%甲醇定容后放于冰箱內待用。取待測液3 mL并稀釋10倍，平行制備3 次，在327 nm處測定提取液吸光值，平行進樣3次。根據(jù)標準曲線計算樣品提取液濃度，按下式計算綠原酸含量：

綠原酸含量=(x×10×V×10-3)/m×100%

x代表樣品提取液濃度(mg/mL)；10為稀釋倍數(shù)；V代表樣品提取液定容體積(50 mL)；m代表樣品質量(g)。

1.3 樣品總RNA提取及cDNA第一鏈合成

使用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒(北京天根)提取總RNA后，用NanoDrop 2000紫外-可見分光光度計(Thermo Fisher USA)檢測RNA濃度及質量，1%瓊脂糖電泳檢測RNA完整性。所有樣品提取的總RNA OD260nm/OD230nm值為1.9～2.1，OD260nm/OD280nm為1.9～2.0，質量濃度為360～650 ng/μL，且28S、18S帶型整齊，無拖尾。取1 μg RNA作為模板，使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara)反轉錄合成第一鏈cDNA， -20 ℃保存。

1.4 引物設計

根據(jù)NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)已提交的甘薯綠原酸合成相關酶基因的cDNA序列，IbPAL1(GenBank：MN823653)、IbPAL2(GenBank：D78640.1)、IbC4H(GenBank：GQ373157.2)、Ib4CL(GenBank：AB469557.1)、IbHCT(GenBank：AB035183.1)、IbC3H(GenBank：MT792533)、IbHQT(GenBank：AB576769.1)和IbUGCT(GenBank：AB909370.1)，利用GenScript網(wǎng)站(https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool)在線設計qRT-PCR引物[11]。引物片段長度80～150 bp，Tm值52～ 60 ℃，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見表2。

表2 qRT-PCR引物序列Table 2 Gene-specific primers used for gene expression analysis

1.5 甘薯綠原酸合成途徑相關基因qRT-PCR分析

將反轉錄合成的cDNA稀釋5倍后作為模板，利用SYBR premix Ex TaqTM(TaKaRa)試劑盒，在ABI StepOnePlus上擴增進行qRT-PCR反應。擴增程序為: 95 ℃ 60 s 預變性；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s， 60 ℃ 1 min。qRT-PCR反應所得的擴增曲線均呈“S”形，循環(huán)閾值處于擴增曲線的對數(shù)期，溶解曲線均表現(xiàn)為單峰。以IbTublin基因的表達量作為內參，計算出目的基因的相對表達量。樣本和內參分別設3次重復。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

甘薯綠原酸合成酶基因的相對表達量計算采用2-△△CT法[14]。采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析(P<0.05為顯著水平)。

2 結果與分析

2.1 不同類型甘薯品種可食用部位綠原酸含量變化

結果表明(圖1)，6個品種的莖尖綠原酸含量均高于其儲藏根中的，莖尖中綠原酸含量平均為1.248%，儲藏根中平均為0.281%，差異極顯著。同一類型甘薯品種之間，莖尖中綠原酸含量高的品種其儲藏根中含量相對較低：如在葉菜用型甘薯品種中，‘寧菜薯1號’的莖尖綠原酸含量最高，但其儲藏根中的最低；鮮食型甘薯品種中結果與此類似。

相同部位綠原酸含量在不同品種之間差異顯著，‘寧紫薯4號’的儲藏根中綠原酸含量最高，而‘蘇薯16號’的莖尖富含更多綠原酸。此外，無論在莖尖還是儲藏根，3個鮮食型甘薯的平均綠原酸含量均高于3個葉菜用型的：前者莖尖和儲藏根平均綠原酸含量分別為1.437%和0.413%；而后者的則分別為1.118%和0.150%。

2.2 甘薯綠原酸合成途徑基因在不同甘薯品種中的組織表達模式分析

在3個葉菜用型甘薯品種中，綠原酸合成相關基因均富集于莖尖表達，尤其是‘福菜薯18號’和‘福薯7-6’(圖2-A～C)。鮮食型品種中部分酶基因的表達模式出現(xiàn)差異：‘蘇薯16號’中Ib4CL相對在其儲藏根中高表達，IbC4H、IbHQT和IbUGCT雖在莖尖相對表達略高，但與儲藏根并無明顯差異(圖2-D)；‘寧紫薯1號’中IbUGCT在儲藏根中的表達量顯著高于莖尖，除Ib4CL、IbHCT和IbC3H高表達于莖尖外，其他酶基因在莖尖和儲藏根中的表達差異不顯著(圖2-E)；‘寧紫薯4號’中IbPAL2不同于其他酶基因，在儲藏根中的表達水平明顯高于莖尖(圖2-F)。此結果說明，不同品種可食用部位中綠原酸含量的差異可能與其合成相關酶基因的組織特異性表達有關。

3 討論與結論

本研究通過對國內6個甘薯品種可食用部位的綠原酸含量進行分析發(fā)現(xiàn)，甘薯莖尖綠原酸含量比儲藏根中更高，此結果與之前相關報道一致[15-16]。綠原酸含量在不同甘薯品種之間存在顯著差異，值得注意是，與國內葉菜用甘薯主推品種之一的‘福菜薯18號’相比，葉菜用型品種‘寧菜薯1號’和鮮食型品種‘蘇薯16號’‘寧紫薯1號’的莖尖綠原酸含量水平均較高。此外，作為兼含花青素和胡蘿卜素的新型紫甘薯品種[17]，‘寧紫薯4號’儲藏根中的綠原酸含量在參試品種中居最高。

目前關于植物綠原酸的生物合成已有許多報道[18-21]，從不同植物中克隆鑒定出了一些相關酶基因。研究表明，綠原酸合成途徑相關酶基因的表達水平會影響綠原酸合成[11,22-25]。本研究對8個甘薯綠原酸合成途徑相關酶基因在6個不同甘薯品種中的組織表達模式分別進行了分析，結果表明甘薯中綠原酸合成相關酶基因大多集中于莖尖表達，該結果與綠原酸在甘薯莖尖中含量較高相一致。同時，區(qū)別于3個葉菜用型品種，部分酶基因在3個鮮食型品種的組織表達差異較小，甚至集中于儲藏根表達。尤其在‘寧紫薯4號’中，IbPAL2在其儲藏根中的相對表達量顯著高于莖尖，可能與‘寧紫薯4號’儲藏根中綠原酸含量較高有關。這些結果說明，綠原酸合成途徑相關酶基因的組織表達特征很大程度上決定綠原酸在甘薯可食用部位中的積累，但具體的酶基因功能及其機制還有待于進一步研究。