陳碩然，李紅玉，安 寧，王庚午，孫兆義

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011；2.南部戰(zhàn)區(qū)海軍第一醫(yī)院，廣東 湛江 524000；3.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院眼三科，黑龍江 牡丹江 157011)

翼狀胬肉是眼部結(jié)膜組織受外界刺激而引起的一種慢性炎癥增生性眼表疾病。翼狀胬肉多發(fā)生在室外工作者，常常影響外觀，也可能會(huì)破壞淚膜引起干眼，且逐漸增生的組織接近瞳孔區(qū)時(shí)會(huì)導(dǎo)致視力下降，對(duì)患者的生活水平有一定的影響。IGF-2是對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡影響較大的一類指標(biāo)，且IGF-2的過(guò)表達(dá)通常與預(yù)后不良有關(guān)[1]。COX-2是負(fù)責(zé)致炎物質(zhì)前列腺素合成的限速酶[2]，其中炎癥的微環(huán)境誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和癌癥侵襲[3]。翼狀胬肉作為一類組織過(guò)度增殖性疾病，對(duì)其細(xì)胞增殖情況的研究則更為重要。本研究的目的是通過(guò)觀察正常結(jié)膜組織、原發(fā)性和復(fù)發(fā)性胬肉組織中IGF-2及COX-2表達(dá)水平的差異，旨在進(jìn)一步探討原發(fā)性和復(fù)發(fā)性翼狀胬肉中IGF-2及COX-2二者表達(dá)的相關(guān)性，為本病的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)，以及預(yù)防、治療、防止術(shù)后復(fù)發(fā)提供重要的研究?jī)r(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018年11月至2020年10月間于牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院一分院眼科行胬肉切除的患者55例55眼，其中原發(fā)性翼狀胬肉(原發(fā)組)35例35眼，復(fù)發(fā)性翼狀胬肉(復(fù)發(fā)組)20例20眼。男26例，女29例(年齡在43～67歲之間)。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：?jiǎn)蝹?cè)翼狀胬肉均位于鼻側(cè)；胬肉頭部侵入角膜大于3.0 mm；所有受試者均知情同意并接受相關(guān)檢查，排除其他眼表疾病；無(wú)眼部手術(shù)、外傷史；無(wú)眼部近期用藥史；無(wú)假性翼狀胬肉。正常結(jié)膜組選取患有結(jié)膜松弛癥的白內(nèi)障囊外摘除患者10例10眼，男5例，女5例(年齡在42～68歲之間)，于近翼狀胬肉發(fā)生區(qū)位置的角膜緣獲得正常結(jié)膜組織。取材前均經(jīng)患者知情同意。

1.2 試劑兔抗人IGF-2單克隆一抗抗體(稀釋度1∶50)、兔抗人COX-2多克隆一抗抗體(稀釋度1∶50)購(gòu)自美國(guó)SAB公司、DAB試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色術(shù)后組織標(biāo)本采用4%甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋、切片等處理，進(jìn)行染色步驟。切片于65 ℃恒溫箱下烘烤2 h以上，進(jìn)行二甲苯及梯度酒精脫蠟、3%過(guò)氧化氫10 min、檸檬酸鈉煮沸15 min抗原修復(fù)操作，PBS沖洗，滴加5% BSA后37 ℃烘干箱封閉1 h，擦干后滴加IGF-2及COX-2一抗，4 ℃冰箱保存過(guò)夜。每張切片用PBS清洗，滴加二抗，37 ℃孵育1 h，后PBS沖洗，DAB試劑顯色5 min，蘇木素復(fù)染10 min，鹽酸乙醇及蒸餾水洗片，梯度酒精及二甲苯脫水，中性樹脂封片，正置顯微鏡觀察。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置染色對(duì)照，將已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，選用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，其余實(shí)驗(yàn)步驟不變。

1.4 染色結(jié)果判定染色結(jié)果以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒作為陽(yáng)性表達(dá)，切片在光鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，計(jì)算陽(yáng)性率，即5個(gè)高倍視野下陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的比率并取平均值。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞率以及陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)相加之和作為判定標(biāo)準(zhǔn)[4]，高倍視野中陽(yáng)性細(xì)胞率：<5%記為0分、6%～25%記為1分、26%～50%記為2分、51%～75%記為3分、76%～100%記為4分。5個(gè)視野平均陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度：無(wú)陽(yáng)性染色記為0分、淺黃色記為1分、深黃色記為2分、棕黃色記為3分。二者得分相加，可以確定綜合得分：0～3分為陰性、4～5分為弱陽(yáng)性(+)、6～7分為強(qiáng)陽(yáng)性(++)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)使用SPSS 25.0軟件分析，組間率比較采用卡方檢驗(yàn)，IGF-2與COX-2之間表達(dá)相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)，用r表示(其中0<|r|≤0.19為極低相關(guān)性；0.20≤|r|≤0.39為低度相關(guān)性；0.40≤|r|≤0.69為中度相關(guān)性；0.70≤|r|≤0.89為高度相關(guān)性；0.90≤|r|≤1.00為極高相關(guān)性)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IGF-2在三組中的表達(dá)情況顯微鏡下結(jié)果顯示，IGF-2在翼狀胬肉組織中陽(yáng)性染色主要定位于上皮層的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，且復(fù)發(fā)組表達(dá)強(qiáng)于原發(fā)組，而在正常結(jié)膜組中呈陰性表達(dá)(圖1)。IGF-2在原發(fā)組和復(fù)發(fā)組中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為54.3%和85%，明顯高于正常結(jié)膜組(0%)，各組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 IGF-2在三組中的表達(dá)情況

圖1 IGF-2在三組中的表達(dá)情況(×400)

2.2 COX-2在三組中的表達(dá)情況顯微鏡下結(jié)果顯示，COX-2在翼狀胬肉組織中的陽(yáng)性染色主要定位于上皮層中的細(xì)胞質(zhì)中，且復(fù)發(fā)組表達(dá)強(qiáng)于原發(fā)組，在正常結(jié)膜組中僅在部分上皮層呈陽(yáng)性表達(dá)(圖2)。COX-2在原發(fā)組和復(fù)發(fā)組中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為65.7%和90.0%，明顯高于正常結(jié)膜組(10%)，各組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2 COX-2在三組中的表達(dá)情況

圖2 COX-2在三組中的表達(dá)情況(×400)

2.3 IGF-2與COX-2在翼狀胬肉中表達(dá)的相關(guān)性Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)分析顯示，IGF-2與COX-2在翼狀胬肉表達(dá)中呈中度正相關(guān)性(r=0.513)，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，見表3。

表3 IGF-2與COX-2在翼狀胬肉中的相關(guān)性表達(dá)

3 討論

翼狀胬肉是眼科門診最常見的眼表疾病之一，多表現(xiàn)為顳側(cè)球結(jié)膜向角膜生長(zhǎng)的纖維血管樣組織，是種易受外界刺激而引起的慢性炎癥增生性疾病，在全球發(fā)病率約為12%[5]。目前多項(xiàng)研究證實(shí)[6]，暴露在室外的人群高發(fā)，是由于室外活動(dòng)人群接觸紫外線較多且受風(fēng)沙、粉塵的影響。有學(xué)者研究認(rèn)為[7]，紫外線的照射可以引起角膜緣干細(xì)胞屏障的損傷，還可導(dǎo)致結(jié)膜組織中多種因子表達(dá)從而引發(fā)蛋白結(jié)構(gòu)的改變。此病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病因多包括環(huán)境因素、病毒感染、氧化應(yīng)激損傷、增殖與凋亡、炎癥與免疫機(jī)制、角膜緣干細(xì)胞缺陷[8]，其中的增殖與凋亡機(jī)制越來(lái)越引起廣泛學(xué)者的關(guān)注重視。IGF-2也被稱為生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素，是一種蛋白質(zhì)類激素，屬于胰島素家族的成員，位于11p15.5號(hào)染色體上[9]，屬于最早發(fā)現(xiàn)的印跡基因之一?；蛴≯E是指來(lái)自父親或母親的遺傳基因在子代遺傳上進(jìn)行不對(duì)稱選擇而導(dǎo)致單等位基因表達(dá)的現(xiàn)象，多通過(guò)表觀遺傳機(jī)制以DNA差異性甲基化為主來(lái)完成。人類IGF-2基因僅從父系遺傳的等位基因中表達(dá)，IGF-2因子參與調(diào)控細(xì)胞增殖及惡性轉(zhuǎn)化，也與細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)、分化、遷移等相關(guān)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[10-11]，IGF-2在許多腫瘤組織中均存在高表達(dá)，如胃癌、大腸癌、肝癌、膀胱癌等，IGF-2可以通過(guò)以下幾種途徑促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[12]：促增殖作用、抑制凋亡、IGF-2可直接或間接通過(guò)增加VEGF的合成促進(jìn)腫瘤血管形成、增強(qiáng)基質(zhì)金屬蛋白酶-2的表達(dá)[13]。翼狀胬肉作為一種組織炎性增殖性疾病，而IGF-2作為細(xì)胞增殖及凋亡影響較大的一類指標(biāo)，推測(cè)其可能與翼狀胬肉疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。COX-2作為已知的誘導(dǎo)腫瘤血管生成的關(guān)鍵分子，參與許多腫瘤中的發(fā)生、發(fā)展，可能的途徑包括：促進(jìn)前列腺素2合成、抑制調(diào)亡、改變細(xì)胞附著于底物的能力、抑制DNA修復(fù)[14]，其中COX-2也參與眼部疾病的炎癥發(fā)生和新生血管形成。已有研究證實(shí)[15]，原發(fā)性翼狀胬肉上皮中存在COX-2陽(yáng)性表達(dá)，這也同樣解釋了翼狀胬肉炎性增殖的行為。

本研究結(jié)果顯示，IGF-2及COX-2在原發(fā)組和復(fù)發(fā)組中呈陽(yáng)性表達(dá)，明顯高于正常結(jié)膜組織，且復(fù)發(fā)組表達(dá)強(qiáng)于原發(fā)組，表明了兩種因子參與了翼狀胬肉疾病的發(fā)生過(guò)程。本研究通過(guò)Spearman等級(jí)相關(guān)分析得出，IGF-2與COX-2的表達(dá)具有正相關(guān)性，提示兩者在翼狀胬肉的發(fā)展中具有協(xié)同關(guān)系。通過(guò)以上研究論述，我們發(fā)現(xiàn)了IGF-2及COX-2在翼狀胬肉的發(fā)病機(jī)制中具有重要的意義。在臨床中，減少翼狀胬肉細(xì)胞中的IGF-2及COX-2的表達(dá)，可有助于抑制翼狀胬肉的發(fā)展并降低其術(shù)后復(fù)發(fā)率，對(duì)預(yù)防和治療翼狀胬肉提供了重要參考價(jià)值。