蘇 旭，史維俊，王 靜，吳華彰

(蚌埠醫(yī)學(xué)院 1.生命科學(xué)學(xué)院癌癥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.第一附屬醫(yī)院胃腸外科，安徽 蚌埠 233030)

胃癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一。據(jù)世界癌癥報(bào)告統(tǒng)計(jì)，2015年全球胃癌的發(fā)病率與死亡率分別居于所有惡性腫瘤中的第5位和第3位[1]。我國(guó)更是胃癌的高發(fā)地區(qū)，全球胃癌患者約有42%來(lái)自于中國(guó)[2]。近年來(lái)，雖通過(guò)手術(shù)治療、放化療、靶向藥物等多種治療方法，患者生存期延長(zhǎng)，生活質(zhì)量有所提高。然而，早期胃癌的檢出率很低，大多數(shù)患者在診斷時(shí)已是晚期階段，失去了治療的最佳時(shí)機(jī)[3]。因此，識(shí)別胃癌進(jìn)展和預(yù)后新的分子靶點(diǎn)[4]，開(kāi)展有效的胃癌靶向治療是迫切需要的。隨著基因組學(xué)、表觀基因組學(xué)的發(fā)展，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)進(jìn)入精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代，通過(guò)對(duì)胃癌的生物信息學(xué)分析，已有大量關(guān)于胃癌發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥及預(yù)后相關(guān)分子標(biāo)記物的研究報(bào)道，并且研究開(kāi)發(fā)出分子靶向藥物改變了胃癌的臨床治療模式，如靶向表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor receptor，EGFR)藥物、PI3K信號(hào)通路抑制劑、PARP抑制劑等[5-8]。由此可見(jiàn)，基因組學(xué)大數(shù)據(jù)深度挖掘是尋找胃癌診斷、治療及相關(guān)靶點(diǎn)的新型研究手段。在此項(xiàng)研究中，利用生物信息學(xué)技術(shù)分析胃癌中PDGFRB的表達(dá)情況[9]，探究PDGFRB與胃癌患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)聯(lián)，聚焦其在胃癌中可能參與的生物學(xué)過(guò)程，了解PDGFRB對(duì)胃癌發(fā)生發(fā)展和預(yù)后的影響及臨床價(jià)值，以期為胃癌的早期診斷和靶向治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載與整理TCGA是美國(guó)國(guó)家癌癥研究所(National Cancer Institute)和美國(guó)人類(lèi)基因組研究所(National Human Genome Research Institute)共同監(jiān)督的一個(gè)項(xiàng)目，目前已經(jīng)收錄了60多種的腫瘤類(lèi)型。本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載RNA-seq數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)(https://www.cancer.gov/)，包括正常胃粘膜上皮樣本32例及胃癌患者樣本375例。利用Perl軟件進(jìn)行基因ID的轉(zhuǎn)換和臨床數(shù)據(jù)信息的提取，構(gòu)建基因表達(dá)矩陣，隨后采用R語(yǔ)言根據(jù)log(FC)>1，F(xiàn)DR<0.05[10]的篩選標(biāo)準(zhǔn)初步篩選胃癌組織中的差異表達(dá)基因，并對(duì)差異基因進(jìn)行熱圖和火山圖的繪制。

1.2 目的基因的篩選為研究差異表達(dá)的基因?qū)ξ赴┗颊叩挠绊?，?duì)表達(dá)上調(diào)的差異基因進(jìn)一步篩選分析，設(shè)置篩選標(biāo)準(zhǔn)：log(FC)>1.3，6

1.3 PDGFRB基因的差異表達(dá)及臨床病理特征的相關(guān)性分析為分析PDGFRB基因表達(dá)水平和臨床病理特征的相關(guān)性，使用Perl軟件將目的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床病理數(shù)據(jù)相結(jié)合，構(gòu)建成包含目的基因信息和臨床信息的表達(dá)矩陣。隨后，利用R軟件獲得目的基因在胃癌組織和正常胃黏膜組織中的差異表達(dá)，通過(guò)在線(xiàn)分析軟件UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)分析PDGFRB表達(dá)水平與與胃癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期和組織亞型等臨床病理特征的相關(guān)性。

1.4 獨(dú)立預(yù)后分析將臨床數(shù)據(jù)表達(dá)矩陣導(dǎo)入R軟件，利用survival程序包進(jìn)行Cox回歸分析PDGFRB基因表達(dá)水平與胃癌患者生存率、年齡、分期和TMN分期等預(yù)后因素的相關(guān)性。利用在線(xiàn)分析網(wǎng)站Kaplan-Meier Plotter(https://kmplot.com/)分析PDGFRB基因分別在高表達(dá)和低表達(dá)胃癌患者中的生存情況。

1.5 PDGFRB基因的富集分析利用Perl軟件輸出應(yīng)用于目的基因富集分析的表達(dá)數(shù)據(jù)集文件(.gct)和表型數(shù)據(jù)文件(.cls)，進(jìn)行GSEA軟件的下載安裝(https://www.gsea-msigdb.org/)和Java 8運(yùn)行環(huán)境[12]，將表達(dá)數(shù)據(jù)集文件和表型數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入GSEA，對(duì)PDGFRB基因的信號(hào)通路進(jìn)行KEGG富集分析，篩選富集分析標(biāo)準(zhǔn)為(P<0.005，F(xiàn)DR<0.005)。

1.6 PDGFRB基因與潛在靶基因的相關(guān)性分析將目的基因PDGFRB輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，并選擇Homo sapiens類(lèi)別的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建目的基因蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。將目的基因與潛在靶基因的基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入R軟件，分析目的基因與潛在靶基因的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織中差異表達(dá)基因的篩選對(duì)375例胃癌和32例胃粘膜樣本中基因的差異表達(dá)情況進(jìn)行篩選分析，初步篩選出胃癌樣本中差異化表達(dá)基因2676個(gè)，其中在胃癌組織中高表達(dá)和低表達(dá)的基因分別為1110和1566個(gè)，見(jiàn)圖1。

圖1 胃癌組織中基因差異表達(dá)分析

2.2 胃癌組織中目的基因PDGFRB的篩選胃癌是多基因異常導(dǎo)致的復(fù)雜性疾病，為研究差異表達(dá)基因?qū)ξ赴┗颊叩挠绊?，根?jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)：log(FC)>1.3，6

表1 候選基因與胃癌患者臨床病理特征相關(guān)性分析

2.3 PDGFRB基因在胃癌中的差異表達(dá)及臨床病理相關(guān)性分析為進(jìn)一步探討PDGFRB基因是否可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展，通過(guò)R語(yǔ)言中的limma[13]和beeswarm[14]程序包對(duì)PDGFRB基因的表達(dá)矩陣進(jìn)行差異化分析顯示，相對(duì)于正常胃粘膜組織，PDGFRB基因在胃癌組織中顯著高表達(dá)(圖2A)(P<0.001)。對(duì)32例配對(duì)胃癌及癌旁組織分析發(fā)現(xiàn)，PDGFRB基因表達(dá)水平在胃癌組織中顯著增高(圖2B)(P<0.001)。UALCAN在線(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)，PDGFRB基因在胃癌組織中顯著高表達(dá)(圖2C)，且表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期及亞型顯著相關(guān)(圖2D、2E、2F)(P<0.001)。以上結(jié)果表明，PDGFRB基因可能作為重要的潛在癌基因參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。

圖2 PDGFRB基因在胃癌中的差異表達(dá)及臨床病理相關(guān)性分析

2.4 PDGFRB基因與胃癌患者的獨(dú)立預(yù)后分析為進(jìn)一步確定PDGFRB基因可以作為調(diào)控胃癌發(fā)生和影響預(yù)后的潛在靶基因，Cox回歸分析顯示，PDGFRB基因表達(dá)水平與胃癌患者年齡、分期和TMN分期等獨(dú)立預(yù)后因素顯著相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表2)。另外，K-M Plot在線(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)，PDGFRB基因表達(dá)水平與胃癌患者總生存率(OS)(圖3A、3B)、首次進(jìn)展期生存率(FP)(圖3C)、后進(jìn)展期生存率(PPS)(圖3D)顯著相關(guān)(P<0.01)。

表2 PDGFRB基因與胃癌患者的獨(dú)立預(yù)后分析

圖3 PDGFRB基因表達(dá)與胃癌患者預(yù)后顯著相關(guān)

2.5 PDGFRB基因多GSEA富集分析為探索PDGFRB基因調(diào)控胃癌惡性進(jìn)展的分子機(jī)制，利用GSEA富集分析軟件對(duì)PDGFRB基因進(jìn)行信號(hào)通路富集分析。結(jié)果顯示，在富集的相關(guān)信號(hào)通路中，PDGFRB基因在Wnt信號(hào)通路中富集相關(guān)性居于首位且富集分?jǐn)?shù)最高(P<0.01)(表3、圖4)。

表3 PDGFRB基因GSEA富集分析結(jié)果

圖4 PDGFRB基因通路富集分析

2.6 PDGFRB基因與潛在靶基因的相關(guān)性分析為進(jìn)一步分析PDGFRB基因通過(guò)調(diào)控Wnt信號(hào)通路影響胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，利用STRING在線(xiàn)分析網(wǎng)站構(gòu)建PDGFRB基因蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，蛋白質(zhì)之間的連接線(xiàn)越多，相互關(guān)聯(lián)性越強(qiáng)，分析顯示PDGFRB基因與Wnt2、PLCB2之間具有強(qiáng)關(guān)聯(lián)性(圖5A)，且PDGFRB基因與Wnt2、PLCB2的表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.001)(圖5B、5C)。

圖5 PDGFRB基因相關(guān)的蛋白互作及相關(guān)通路中的分子相關(guān)性分析

3 討論

胃癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和致死率最高的癌癥之一，近半數(shù)的胃癌發(fā)生于東亞地區(qū)，尤其是中國(guó)、韓國(guó)、日本及蒙古國(guó)[15]。胃癌的發(fā)生也是多因子、多步驟相互作用的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，了解胃癌的發(fā)生發(fā)展對(duì)于其診斷和治療非常重要[16]。隨著基因組學(xué)、表觀基因組學(xué)的發(fā)展，通過(guò)對(duì)胃癌的生物信息學(xué)分析，越來(lái)越多的胃癌潛在基因治療靶點(diǎn)被研究發(fā)現(xiàn)，為診斷和治療胃癌提供了一個(gè)新的方向[17]。

本研究通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中胃癌差異化表達(dá)基因的生存、預(yù)后及臨床病理相關(guān)性分析，通過(guò)UALCAN在線(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)，PDGFRB基因在胃癌組織中顯著高表達(dá)，其表達(dá)水平與胃癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期和組織亞型顯著相關(guān)。采用Cox回歸分析顯示，PDGFRB基因可能參與胃癌發(fā)生發(fā)展，且可能是胃癌診斷、治療和預(yù)后潛在的生物標(biāo)志物。為進(jìn)一步分析PDGFRB基因在調(diào)節(jié)胃癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制，通過(guò)GSEA單基因富集分析發(fā)現(xiàn)，PDGFRB基因在Wnt信號(hào)通路上顯著富集[18-20]。利用在線(xiàn)網(wǎng)站STRING構(gòu)建PDGFRB蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，該蛋白互作網(wǎng)絡(luò)可以更好地理解PDGFRB與其它蛋白之間的功能關(guān)聯(lián)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有60個(gè)預(yù)測(cè)的功能蛋白與PDGFRB相互作用，其中兩種蛋白基因被證實(shí)與胃癌的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后有關(guān)。于是通過(guò)R語(yǔ)言對(duì)PDGFRB與這兩種基因進(jìn)行相關(guān)性分析，得出PDGFRB基因與Wnt2[21]、PLCB2[22]表達(dá)呈正相關(guān)，這提示PDGFRB基因可能通過(guò)促進(jìn)Wnt2/PLCB2信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，激活Wnt信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞惡性增殖從而促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。研究表明，Wnt信號(hào)通路與人類(lèi)腫瘤相關(guān)，如肺癌[23]、肝癌[24]、結(jié)腸癌[25]等。Wnt信號(hào)通路激活，促進(jìn)細(xì)胞增殖以及存活而不進(jìn)入分化，持續(xù)性的激活Wnt信號(hào)通路使得信號(hào)通路中的其他信號(hào)分子有可能發(fā)生突變，例如永久性失活A(yù)PC復(fù)合物，即“遺傳調(diào)控門(mén)控基因”缺失，進(jìn)一步激活Wnt信號(hào)通路，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[26-30]。

綜上所述，PDGFRB基因在胃癌組織中高表達(dá)提示其可能作為重要的潛在癌基因參與胃癌的發(fā)生發(fā)展；PDGFRB基因與臨床病理特征顯著相關(guān)，可作為評(píng)價(jià)胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；PDGFRB基因可能通過(guò)促進(jìn)Wnt2/FZD1信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，激活Wnt信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞惡性增殖從而促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。本研究采用生物信息學(xué)方法對(duì)PDGFRB基因進(jìn)行了深入分析，分析結(jié)果可為胃癌的實(shí)驗(yàn)研究提供一個(gè)重要的研究方向，由于生物信息學(xué)分析方法利用了網(wǎng)絡(luò)芯片數(shù)據(jù)和在線(xiàn)數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站，缺乏相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作為支持驗(yàn)證，存在一定的局限性。因此，PDGFRB在胃癌發(fā)生發(fā)展中的具體功能及其作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證。