李 冀，于成龍，趙 玉，劉赫迪，于建渤

(1.黑龍江省腫瘤疾病防治重點實驗室；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院病理診斷中心，黑龍江 牡丹江 157011)

光學(xué)分子影像學(xué)技術(shù)能夠?qū)崟r監(jiān)測腫瘤模型中腫塊的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移情況，同時對抗腫瘤藥物療效做出評定[1-3]?；铙w成像技術(shù)是對發(fā)生在活體內(nèi)的各種生物現(xiàn)象進(jìn)行無創(chuàng)性可視化的分析方法。近年來，具有分子水平成像能力的圖像診斷技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了長足的發(fā)展[4]。本研究擬構(gòu)建NK/T細(xì)胞淋巴瘤裸鼠模型，旨在探討生物發(fā)光物質(zhì)在NK/T細(xì)胞淋巴瘤裸鼠模型中的變化，并探索吉西他濱用藥后光學(xué)分子影像學(xué)技術(shù)在淋巴瘤診療的新應(yīng)用。

1 材料與方法

1．1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雌性BALB/C裸鼠10只，4～5周齡，體重8～10 g，北京維通利華實驗動物中心提供。飼養(yǎng)在SPF級超凈層流室，恒溫(24～26 ℃)飼養(yǎng)，墊料、籠具、飼料及飲水均經(jīng)過高壓滅菌和紫外線照射處理。

1.1.2 材料 細(xì)胞株 NK92-Luc購自美國 ATCC 公司；RPMI-1640 培養(yǎng)液和胎牛血清購于美國Gibco 生物公司；人白細(xì)胞介素-2 (IL-2) 購于 R&D公司；螢火蟲熒光素酶D-Luciferin 購自美國Selleck生物科技公司；異氟烷購自湖北鴻運隆生物公司。

1.1.3 儀器設(shè)備 小動物活體成像儀Berthold Technology-NightOwl LB983；倒置熒光顯微鏡為尼康 TS100-F。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) NK92-Luc細(xì)胞培養(yǎng)在含10% FBS、1% PBS、89% RPMI-1640、100 U IL-2及1.5 μg/mL嘌呤霉素培養(yǎng)基中，培養(yǎng)瓶放入37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱。根據(jù)細(xì)胞生長情況，更換培養(yǎng)液，取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2 NK92-Luc細(xì)胞體外生物發(fā)光活性檢測 取對數(shù)生長期的NK92-Luc細(xì)胞懸浮于4 mL RPMI 1640培養(yǎng)液中，100 μL/孔接種于96孔板中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量分別為每孔100、200、400、800、1600、3200、6400、12800、25600個，每孔設(shè)置兩個復(fù)孔，共3組；其中兩組每孔加入1 μL熒光素酶底物 (15 mg/mL)；另一組不加熒光素酶底物作為陰性對照。靜置5 min，小動物活體成像儀Berthold Technology-NightOwl LB983檢測NK92-Luc細(xì)胞體外發(fā)光情況，分析發(fā)光強度和細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系。

1.3 NK92-Luc裸鼠皮下腫瘤模型的構(gòu)建及鑒定

1.3.1 構(gòu)建NK92-Luc淋巴瘤裸鼠皮下腫瘤模型 取對數(shù)生長期NK92-Luc細(xì)胞懸液，移入15 mL離心管，離心 (1000 r/min，5 min)，棄上清；PBS洗滌兩次，適量PBS重懸，細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，按照1×107個細(xì)胞/只接種密度，配置細(xì)胞懸液；將裸鼠固定在超凈工作臺中，75%乙醇消毒裸鼠左側(cè)季肋皮膚，按每只100 μL腫瘤細(xì)胞懸液(含1×107個細(xì)胞)接種于裸鼠左側(cè)季肋皮下，觀察裸鼠飲食水、活動正常，2～3 d后于左季肋部觀察到米粒大小隆起，此為建模成功。

1.3.2 小動物活體成像 將NK92-Luc裸鼠腫瘤模型隨機(jī)分為對照組(PBS組)，實驗組(吉西他濱組)。對照組：每隔兩天皮下注射100 μL/只PBS；實驗組：每隔兩天皮下注射100 μL/只吉西他濱(含吉西他濱50 μg)。首次給藥前及給藥后第5天、第8天、第11天用小動物活體成像儀Berthold Technology-NightOwl LB983成像分析。方法：腹腔注射50 μL熒光素酶底物(1 mg/mL)，記錄注射熒光素酶底物時間；注射熒光素酶第7 min時將裸鼠放入麻醉箱中進(jìn)行異氟烷吸入性麻醉，注射熒光素酶第9 min時將實驗組放入活體成像儀暗箱平臺成像；采用儀器配備的indigo軟件對圖像和數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，統(tǒng)計分析腫瘤治療后發(fā)光強度(參數(shù)：曝光時間5 min/次)。

1.3.3 腫瘤體積測量 使用游標(biāo)卡尺于給藥前及給藥后第5天、第8天、第11天測量兩組裸鼠腫瘤最長徑和最短徑，計算腫瘤體積(體積=1/2長徑×短徑2)；繪制裸鼠腫瘤動態(tài)生長曲線。

1.3.4 HE染色鑒定腫瘤 處死小鼠，取腫塊部位，放入10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用 SPSS 23.0統(tǒng)計軟件，計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，行t檢驗，P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NK92-Luc培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果在顯微鏡下，NK92-Luc細(xì)胞在培養(yǎng)基中懸浮生長，成簇生長，細(xì)胞呈圓形、類圓形(見圖1)。

圖1 NK92-Luc細(xì)胞形態(tài)(A：×40；B：×200)

2.2 NK92-Luc細(xì)胞體外生物發(fā)光活性檢測用熒光素酶檢測NK92-Luc細(xì)胞發(fā)光活性(圖2)，生物發(fā)光活性與細(xì)胞數(shù)呈正比(圖3)。

圖2 NK92-Luc細(xì)胞發(fā)光活性)

圖3 生物發(fā)光強度與NK92-Luc細(xì)胞數(shù)量關(guān)系

2.3 吉西他濱對裸鼠腫瘤生長的影響

2.3.1 兩組活體成像結(jié)果 注射后第3天肉眼未見明顯腫塊，但是生物發(fā)光成像已經(jīng)可以檢測到皮下腫瘤細(xì)胞的生物發(fā)光信號：隨著時間延長，生物發(fā)光信號顯示腫瘤的體積逐漸增大；實驗組腫瘤體積小于對照組體積，見圖4。

圖4 兩組裸鼠腫瘤生長情況的活體成像圖

2.3.2 兩組腫瘤體積結(jié)果 隨著時間延長，兩組裸鼠腫瘤體積逐漸增大。給藥后5 d、8 d、11 d對照組腫瘤體積大于實驗組，差異具有顯著性(P<0.05)，見表1。

表1 兩組腫瘤體積變化(cm3)

2.4 HE染色結(jié)果肉眼所見，瘤體為圓形或類圓形腫塊，腫瘤外周有纖維組織包繞，切面灰紅灰白、魚肉狀，質(zhì)嫩較脆，易出血。HE染色見明顯的淋巴樣細(xì)胞增生，呈彌漫性生長、常累及血管，見圖5。

圖5 裸鼠皮下腫瘤HE染色結(jié)果(A:×100, B:×400)

3 討論

淋巴瘤是淋巴細(xì)胞及其前體細(xì)胞克隆性增生而形成的一類腫瘤，也是機(jī)體免疫系統(tǒng)的免疫細(xì)胞發(fā)生的一類腫瘤，可原發(fā)于淋巴結(jié)和結(jié)外淋巴組織。其來源于血液淋巴系統(tǒng)的惡性腫瘤,是世界范圍內(nèi)十大惡性腫瘤之一。亞洲人群多見，外周T細(xì)胞淋巴瘤為我國發(fā)病最常見類型，約占1/3。最常累及上呼吸道附近，其它包括皮膚、腸道等。成人為主，男性較女性多見[5]。隨著社會發(fā)展，淋巴瘤發(fā)病年齡呈明顯年輕化趨勢，發(fā)病率逐年上升，5年生存率不足50%[6]。

活體生物發(fā)光成像技術(shù)是一種新型影像檢測技術(shù)。生物發(fā)光現(xiàn)象依賴于酶與底物相互作用產(chǎn)生的一種化學(xué)變化，采用熒光素酶，底物隨熒光素酶(例如D-熒光素酶)的類型而變化[7]。此技術(shù)，為研究腫瘤生物學(xué)和治療提供了一種科學(xué)方法[8]。近年來，活體生物發(fā)光成像技術(shù)在生命科學(xué)中的多種領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，現(xiàn)已成為研究實驗動物通用工具之一[9]。此技術(shù)能夠無創(chuàng)、連續(xù)、時時監(jiān)測腫瘤的變化，為相關(guān)動物實驗的研究提供科學(xué)依據(jù)[10]。

吉西他濱(Gemcitabine)是一種胞嘧啶核苷類似物，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于臨床治療，臨成為床一線化療藥物之一對多種癌癥具有明顯的抗腫瘤作用。本研究選擇NK92-Luc 細(xì)胞，采用左側(cè)季肋皮下接種的方式構(gòu)建裸鼠皮下腫瘤，4 d后于左季肋部觀察到米粒大小隆起，成功建立腫瘤模型；采用測量體積的方式觀察腫瘤的生長情況；在給藥后第5、8、11天通過小動物活體成像儀觀察腫瘤生物發(fā)光成像情況。發(fā)現(xiàn)隨著吉西他濱治療時間增加，實驗組裸鼠腫瘤體積明顯小于對照組。說明吉西他濱對腫瘤的生長起到了抑制作用。本實驗也證明利用生物發(fā)光成像技術(shù)，對進(jìn)一步研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供了簡單方便可行的方法。綜上所述，本研究以NK92-Luc 細(xì)胞、裸鼠皮下腫瘤模型為研究對象，成功構(gòu)建裸鼠皮下腫瘤模型，通過活體成像技術(shù)，動態(tài)觀測腫瘤的發(fā)展變化，初步探索 NK/T 細(xì)胞淋巴瘤診斷新方法，具有重要的科學(xué)價值和臨床意義。