于 鑫，丁 晨，林 曉，朱 偉，黃春艷

(牡丹江醫(yī)學(xué)院免疫教研室，黑龍江 牡丹江 157011 )

LncRNA H19、HT-29、Proliferation、Apoptosis結(jié)腸癌是常見消化系統(tǒng)的惡性腫瘤，其早期發(fā)現(xiàn)治愈率較高，但是由于早期缺乏特異性癥狀，導(dǎo)致大部分結(jié)腸癌患者確診時(shí)已是晚期，死亡率增加[1]。所以，臨床上迫切需要找到敏感度和特異度高的早期診斷指標(biāo)。近年來，LncRNA因固有性質(zhì)和易于獲取等特性，可能成為理想的早期診斷指標(biāo)。LncRNA H19是不編碼蛋白的長鏈RNA，其在結(jié)腸癌患者中發(fā)現(xiàn)過表達(dá)，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[2]，但是在結(jié)腸癌中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究，因此，本研究利用HT-29細(xì)胞作為研究對象，通過外源性降低LncRNA H19表達(dá)水平，觀察細(xì)胞增殖和凋亡情況并對其機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29購于上海細(xì)胞培養(yǎng)研究所，培養(yǎng)于含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。取對數(shù)期細(xì)胞接種6孔板，按照脂質(zhì)體LipofactamineTM2000試劑盒(美國Invitrogen)規(guī)程，將Smart silencer NC、Smart silencer H19、siR-NC、siR-STAT1、siR-NC+ Smart silencer H19、siR-STAT1+Smart silencer H19分別轉(zhuǎn)染至HT-29細(xì)胞，6 h后棄去液體，加入正常培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h進(jìn)行后續(xù)檢測，不同處理因素重復(fù)三次平行實(shí)驗(yàn)行。

1.2 RNA提取和Real time PCR取各組細(xì)胞1×106，嚴(yán)格按照Trizol試劑盒(美國Omega公司)的操作流程提取HT-29細(xì)胞總RNA后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(瑞士羅氏公司)將RNA合成cDNA。通過使用SYBR Green mix(瑞士羅氏)試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測。反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 60 s，一個(gè)循環(huán)，延伸95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)，以GAPDH為內(nèi)參，參照2-△△Ct法計(jì)算LncRNA H19、STAT1、Bcl-2、Bax表達(dá)量，不同處理因素重復(fù)三次平行實(shí)驗(yàn)。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 細(xì)胞增殖檢測將各組細(xì)胞濃度調(diào)至為4×104mL，取100 μL細(xì)胞接種至96孔培養(yǎng)板，加入20 μL的MTT(5 mg/mL)溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入150 μL二甲基亞砜，低速振蕩，使晶體充分溶解。選擇波長為490 nm，酶標(biāo)儀檢測每孔吸光度值(Optical density,OD)。細(xì)胞增殖能力與OD值成正比。不同處理因素重復(fù)三次平行實(shí)驗(yàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用GraphpadPrism 8軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，兩樣本數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)分析兩組之間差異，并對兩組以上差異進(jìn)行方差分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Smart silencer H19下調(diào) LncRNA H19表達(dá)Real time PCR檢測轉(zhuǎn)染24 h后，Smart silencer H19組LncRNA H19相對表達(dá)量(0.45±0.01)明顯低于空白組(1.00±0.00，P<0.01)和Smart silencer NC組(1.02±0.02，P<0.01)。

2.2 LncRNA H19促進(jìn)HT-29細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡Smart silencer H19組細(xì)胞在24 h、48 h、72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD值均小于空白組、Smart silencer NC組(P空<0.05，Psmart silencer NC<0.05)，見表2；與smart silencer NC組和空白組相比，細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后smart silencer H19組Bcl-2表達(dá)下調(diào)，而Bax表達(dá)上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P空<0.01，Psmart silencer NC<0.01)，見圖1。

表2 MTT檢測細(xì)胞增殖結(jié)果(OD值)

圖1 LncRNA H19影響凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

2.3 Smart silencer H19下調(diào)STAT1表達(dá)Smart silencer H19組轉(zhuǎn)染24 h后STAT1相對表達(dá)量(0.77±0.03)顯著低于smart silencer NC組(1.05±0.06，P<0.01)和空白組(1.00±0.00，P<0.01)。

2.4 STAT1促進(jìn)HT-29細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)染24 h后siR-STAT1組STAT1相對表達(dá)量(0.41±0.04)明顯低于空白組(1.00±0.00，P<0.01)、siR-NC組(1.03±0.07，P<0.01)；siR-STAT1組在在24 h、48 h、72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD值均低于空白組、siR-NC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P空<0.05，PsiR-NC<0.05)，見表3；與空白組、siR-NC組相比，siR-STAT1組轉(zhuǎn)染24h后明顯下調(diào)Bcl-2表達(dá)，而上調(diào)Bax表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P空<0.01，PsiR-NC<0.01)，見圖2。

表3 MTT檢測細(xì)胞增殖結(jié)果(OD)

圖2 STAT1影響凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

2.5 STAT1參與LncRNA H19 影響HT-29細(xì)胞增殖和凋亡siR-STAT1+smart silencer H19組在24 h、48 h、72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD值均小于siR-NC+smart silencer H19組和空白組(P空<0.05，PsiR-NC+smart silencer<0.05)，見表4；與空白組、siR-NC+Smart silence H19組相比，siR-STAT1+smart silencer H19組轉(zhuǎn)染24 h后明顯下調(diào)Bcl-2表達(dá)，而上調(diào)Bax表達(dá)(P空<0.01，PsiR-NC+smart silencer<0.01)，見圖3。

表4 MTT檢測細(xì)胞增殖結(jié)果

圖3 STAT1參與LncRNA H19 影響凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

結(jié)腸癌是死亡率較高的惡性腫瘤，篩查和診斷的主要手段是結(jié)腸鏡檢查，但很多人對結(jié)腸鏡檢查具有排斥心理，因此，臨床上需要找到易于獲取、重復(fù)采樣的診斷方式?；贚ncRNA的穩(wěn)定性和組織、細(xì)胞特異性，其可能成為癌癥的早期診斷的生物學(xué)指標(biāo)，并且越來越多的研究證實(shí)LncRNA異常表達(dá)在臨床上具有應(yīng)用的價(jià)值。LncRNA是長度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，起初被認(rèn)為是生物“噪音”，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)LncRNA能夠以DNA、RNA或者蛋白結(jié)合的方式發(fā)揮生物學(xué)功能，尤其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起到重要調(diào)控作用，成為近年來腫瘤的研究熱點(diǎn)。越來越多研究報(bào)道表明LncRNA在惡性腫瘤中異常表達(dá)，通過各種機(jī)制調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等，從而發(fā)揮致癌或抑癌的作用[3]。已有研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA H19與腫瘤的增殖、凋亡、侵襲、預(yù)后等相關(guān)，其介導(dǎo)腫瘤進(jìn)展的方式主要是作為“分子海綿”，調(diào)控miRNA從而影響靶基因表達(dá)。在不同類型的腫瘤中發(fā)揮不同的作用機(jī)制，例如：在肺癌細(xì)胞中，LncRNA H19過表達(dá)且抑制miR-200a表達(dá)水平從而促進(jìn)細(xì)胞增殖[4]，而在肝細(xì)胞癌中，LncRNA H19表達(dá)下調(diào)，抑制細(xì)胞增殖[5]。即使在同一類型腫瘤中LncRNA H19也可以通過靶向不同miRNA發(fā)揮不同的調(diào)控作用。然而，關(guān)于H19在結(jié)腸癌中作用機(jī)制研究報(bào)道較少。在結(jié)腸癌患者中LncRNA H19高表達(dá)，并利用結(jié)腸癌細(xì)胞體外探究其作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)可以靶向miRNA141，激活β-連環(huán)蛋白，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞活力增加[6]，也可以通過miRNA675/RB5[7]或miR-675/EHZ2[8]信號途徑調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖。因此，本研究利用外源性smart silencer敲低HT-29細(xì)胞中LncRNA H19表達(dá)，結(jié)果顯示，smart silencer H19可降低細(xì)胞增殖能力和Bcl-2表達(dá)，而增加Bax表達(dá)。以上結(jié)果證實(shí)LncRNA H19可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖而抑制細(xì)胞凋亡，與已知報(bào)道結(jié)果一致。

STAT1是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子家族之一，不但與增殖、分化、凋亡等生理過程密切相關(guān)，而且參與腫瘤形成、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及抗藥性，其可以通過調(diào)控血管生成因子、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，如：Bax、Bcl-2、caspases等，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡，也可以通過增強(qiáng)抗原呈遞能力和細(xì)胞毒作用的方式參與腫瘤免疫調(diào)節(jié)，促進(jìn)腫瘤被免疫系統(tǒng)清除[9]。然而，近年來研究發(fā)現(xiàn)STAT1也具有促癌作用。在結(jié)腸癌患者中STAT1表達(dá)水平明顯高于正常結(jié)腸組織，而且通過不同路徑促進(jìn)或抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。例如：STAT1下調(diào)miR-181a表達(dá)，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖[10]，而STAT1/CCL5路徑促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖[11]。另外，研究發(fā)現(xiàn)，STAT1參與LncRNA調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡[12-13]?；谏鲜鰣?bào)道，為了進(jìn)一步探討LncRNA H19調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的作用機(jī)制，我們進(jìn)行STAT1敲低實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，敲低STAT1導(dǎo)致細(xì)胞增殖減少，同時(shí)改變Bcl-2、Bax表達(dá)，并且STAT1敲低可增強(qiáng)LncRNA H19敲低對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡蛋白相關(guān)表達(dá)的影響。

綜上所述，LncRNA H19可能通過影響STAT1表達(dá)，調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和凋亡，但是涉及的詳細(xì)的調(diào)控機(jī)制還仍不清楚，有待進(jìn)一步研究。