白雨鑫，孫立新，劉 勇，李欣欣，吳 琦，郭素芬，潘艷明，成永霞

(牡丹江醫(yī)學院基礎醫(yī)學院病理學與病理生理學教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

糖尿病心肌病(Diabetic Cardiomyopathy，DCM)是發(fā)生于糖尿病患者但不能用冠心病等器質性病因解釋的一種心肌病變[1]，主要表現(xiàn)為心肌結構紊亂，心功能障礙甚至出現(xiàn)心力衰竭。近年來對DCM的發(fā)病機制有較為深入的研究，通過查閱文獻得知miRNA-21對于心血管系統(tǒng)疾病會產生一定的影響，并發(fā)現(xiàn)抑制miRNA-21 表達對心肌損傷具有一定的保護作用[2]。同時，心肌纖維化做為糖尿病性心肌病的主要病理表現(xiàn)[3]，愈來愈引發(fā)關注，因此，本實驗將立足于觀察miRNA-21對糖尿病心肌纖維化的影響，對糖尿病性心肌病的發(fā)病機制進行深入探究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取6周齡SPF級SD大鼠，共32只，體重(180±20)g，購自遼寧長生生物有限公司，動物飼養(yǎng)于牡丹江醫(yī)學院醫(yī)藥研究中心SPF級動物房，自由攝取飼料和水，12 h晝夜交替照明。本實驗已經通過牡丹江醫(yī)學院動物倫理委員會審查并獲得批準。

1.1.2 實驗試劑與儀器 鏈脲佐菌素(STZ)購自Sigma公司(美國)；高脂高糖飼料(酪蛋白、玉米淀粉、玉米糊精、糖、纖維素、豆油等)；由小黍有泰(北京)生物科技有限公司加工制備；SPF級大鼠維持飼料由遼寧長生生物技術股份有限公司加工制備；逆轉錄試劑盒和SYBR Green qPCR試劑盒購自銳博生物科技有限公司；改良Masson三色染色液購自北京索萊寶科技有限公司；α-SMA單克隆抗體購自碧云天生物技術公司；miRNA-21慢病毒購自沈陽萬類生物科技有限公司；血糖測試儀和血糖試紙購于上海羅氏公司；包埋機、切片機來自Leica 公司(德國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型建立 32只SD大鼠自由攝取食物和水，適應性喂養(yǎng)1周。對大鼠進行隨機分組，分為對照組，DCM組、DCM+干擾miRNA-21組、DCM+干擾對照組，每組8只。對照組大鼠普通維持飼料喂養(yǎng)，而DCM組、DCM+干擾miRNA-21組、DCM+干擾對照組分別進行高糖高脂飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)4周后，給予DCM組、DCM+干擾miRNA-21組、DCM+干擾對照組單次腹腔注射溶解于檸檬酸鈉緩沖液的鏈脲佐菌素(STZ)25 mg/kg，其中有4只大鼠注射2次，而對照組大鼠注射等劑量的檸檬酸鈉緩沖液。72 h后對各組大鼠進行空腹血糖測量，空腹血糖≥11.1 mmol/L 提示2型糖尿病建模成功。第8周進行慢病毒轉染，DCM+干擾miRNA-21組大鼠經尾靜脈注射1×108TU/mL干擾miRNA-21慢病毒，而DCM+干擾對照組經尾靜脈注射1×108TU/mL的對照慢病毒，每只大鼠單次注射200 L(轉染周期4周)。第12周所有試驗用鼠處死取材。

1.2.2 血糖和體重的測量 注射STZ 72 h后，各組大鼠禁食不禁水12 h后經尾靜脈采血利用血糖儀進行測量，之后每2周對各組大鼠進行體重和空腹血糖測量并記錄。

1.2.3 qRT-PCR 取50 mg大鼠心肌組織加入TRIzol裂解液，以氯仿-異丙醇體系提取樣品總RNA，經微量核酸儀檢測其純度和濃度，根據(jù)miR-21逆轉錄試劑盒說明書進行操作，合成cDNA模板，混入SYBR Green qPCR Mix 進行qRT-PCR檢測。miR-21的上游引物5′- GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，下游引物5'-GCCGCTAGCTTATCAGACTGATGT-3′；內參基因 U6 上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，內參基因 U6 下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。參數(shù)設置：95 ℃，10 min循環(huán)1次，95 ℃ 2 s，60 ℃ 20 s，70 ℃10 s，共40個循環(huán)，采用2-△△CT法進行計算。

1.2.4 HE染色 心肌組織放置在4%多聚甲醛固定72 h，石蠟包埋，切片5 μm。脫蠟，常規(guī)逆梯度乙醇脫水，蘇木素-伊紅染色，再次順梯度乙醇浸泡，中性樹膠封固,顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 Masson染色 心肌組織常規(guī)脫水，包埋切片5 μm，烘片4 h，常規(guī)乙醇脫水并清洗，根據(jù) Masson試劑盒說明依次加入各溶液，最后中性樹膠封固,顯微鏡下觀察并選取不同視野拍照。利用Image J圖像分析系統(tǒng)計算膠原纖維面積百分率=膠原面積/總面積。

1.2.6 免疫組織化學 心肌組織包埋，切片5 μm并脫蠟，常規(guī)乙醇脫水并清洗，進行抗原修復，封閉液封閉后，進行一抗孵育過夜，滴加二抗，清洗后蘇木素染色，封片并顯微鏡下觀察；通過Image J圖像分析系統(tǒng)進行分析；陽性面積百分率=褐色顆粒面積/總面積。

1.3 統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進行分析，計量資料采用“均數(shù)±標準差”表示，多個組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況對照組大鼠飲水量和進食量正常，排便排尿量正常，毛發(fā)順有光澤，精神狀態(tài)較好。模型組大鼠進食量多，飲水量增加，后期尿量逐漸增加且尿中帶有強烈的酮味，毛發(fā)豎起呈暗黃色，狀態(tài)較差。與對照組相比，DCM組、DCM+干擾miRNA-21組、DCM+干擾對照組大鼠在高脂飲食4周時出現(xiàn)了明顯的腹型肥胖(圖1)。

圖1 對照組與模型組大鼠腹部外觀

對照組大鼠體重隨著時間變化穩(wěn)定增長，DCM組大鼠體重前期增長較快，隨著病情的進展體重有所降低(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義。與DCM組相比，DCM+干擾對照組的體重差異不明顯(P>0.05)，差異無統(tǒng)計學意義。而與DCM+干擾對照組相比，DCM+干擾miRNA-21組的大鼠體重在轉染后體重有所上升(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義(表1)。

表1 各組大鼠體重變化情況

2.2 各組大鼠血糖監(jiān)測結果對照組大鼠空腹血糖維持穩(wěn)定且均在正常血糖范圍(3.9～6.1 mmol/L)，DCM組大鼠與對照組相比，空腹血糖≥11.1 mmol/L，且空腹血糖維持在較高的水平，P<0.05有統(tǒng)計學意義。與DCM組相比，DCM+干擾對照組無明顯差異(P>0.05)，而與DCM+干擾對照組相比，DCM+干擾miRNA-21組空腹血糖水平在轉染后有所下降，P<0.05有統(tǒng)計學意義(表2)。

表2 各組大鼠空腹血糖水平比較

2.3 各組大鼠qRT-PCR結果與對照組相比，DCM組和DCM+干擾對照組心肌組織中miRNA-21的表達量增加(P<0.001)，而DCM+干擾對照組相比，DCM+干擾miRNA-21組表達有所下降(P<0.001)，以上結果說明DCM組大鼠心肌組織中miRNA-21的表達升高，并且說明DCM+干擾miRNA-21組轉染成功(表3)。

表3 各組大鼠心肌miR-21表達情況比較

2.4 各組大鼠HE染色結果對照組大鼠中，8只大鼠均表現(xiàn)心肌細胞纖維排列整齊，胞質胞核染色均勻，結構完整清晰；而在DCM組大鼠中，有6只大鼠的心肌細胞出現(xiàn)排列不整齊，細胞質深染，局部心肌纖維出現(xiàn)斷裂，心肌細胞間有炎細胞浸潤，其余兩2只表現(xiàn)不明顯。在DCM+干擾對照組中8只大鼠均出現(xiàn)了心肌纖維斷裂等表現(xiàn)，但與DCM組大鼠無明顯差別，而在DCM+干擾miRNA-21組大鼠中，有7只大鼠心肌細胞損傷程度有所改善，間質的炎性細胞也有所減少(圖2)。

圖2 各組大鼠心肌組織的HE染色結果(×200)

2.5 各組大鼠Masson染色結果在Masson染色中心肌纖維表現(xiàn)為紅色而膠原纖維表現(xiàn)為藍色；對照組大鼠的心肌組織中均表現(xiàn)為僅有少量的藍色膠原纖維且分布均勻，而8只DCM組大鼠的心肌組織中，膠原纖維表達量均明顯升高，且主要表現(xiàn)血管周圍并向有所蔓延(P<0.05)。與對照組相比，有7只DCM+干擾對照組大鼠心肌組織中膠原纖維表達量升高(P<0.05)，但與DCM組相比無統(tǒng)計學差異。與DCM+干擾對照組比較，有7只干擾miRNA-21表達的大鼠心肌膠原纖維沉積有所改善，膠原纖維表達量下降(P<0.05)(圖3、表4)。

圖3 各組大鼠心肌組織的Masson染色結果(×200)

表4 各組大鼠心肌組織膠原纖維表達量

2.6 各組大鼠免疫組化結果在正常組大鼠心肌組織中，α-SMA表達量較低，而與對照組相比，在DCM組大鼠心肌組織中，α-SMA表達水平顯著升高(P<0.05)，主要集中表現(xiàn)在心肌間質和少量血管周圍，DCM+干擾miRNA-21組心肌組織中α-SMA表達量相比DCM+干擾對照組降低(P<0.05)。說明2型糖尿病心肌病大鼠會出現(xiàn)α-SMA的沉積，進一步降低miRNA-21的表達會減少α-SMA的產生(圖4、表5)。

圖4 免疫組化染色檢測心肌組織中α-SMA的表達情況(×400)

表5 各組大鼠心肌組織α-SMA蛋白定量分析

3 討論

糖尿病是一種代謝性疾病，臨床表現(xiàn)為持續(xù)性高血糖、體重減輕、多飲等，隨著病情的加重會表現(xiàn)為微血管并發(fā)癥，包括腎臟、視網(wǎng)膜、肝臟、心臟等器官損傷[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)糖尿病微血管并發(fā)癥進展迅速并引發(fā)一系列不可逆性的損傷，合并心血管系統(tǒng)并發(fā)癥的糖尿病患者致死率增加2倍以上[5]。DCM發(fā)病不依賴于高血壓、冠狀動脈疾病和其他已知心臟疾病，主要表現(xiàn)為心肌細胞肥大、心肌間質膠原沉積和心肌纖維化，其中心肌纖維化可致心肌僵硬度增加、心室舒張功能減退、冠狀動脈儲備下降，甚至引發(fā)猝死[6-7]。鑒于以上嚴重后果，糖尿病性心肌纖維化已引起國內外學者廣泛重視，對心肌纖維化治療方法的研究也日益深入。

研究發(fā)現(xiàn)miRNA-21參與心臟、腎臟、肝臟等多個器官纖維化的發(fā)生發(fā)展[8-10]，Liu等[11]發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠的腎小球系膜細胞中miRNA-21表達升高，引起膠原纖維大量堆積，最終進展為腎間質纖維化。Yuan[12]等發(fā)現(xiàn)miR-21通過靶向Smad 7促進心肌梗死后的心肌纖維化。miRNA-21是否影響糖尿病大鼠心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展目前尚不明確。本實驗通過喂養(yǎng)高糖高脂飼料之后進行腹腔注射STZ從而建立2型糖尿病模型，結果發(fā)現(xiàn)與對照組大鼠相比，DCM組大鼠前期體重增長之后出現(xiàn)體重下降趨勢并且空腹血糖升高；與DCM組相比，DCM+干擾miRNA-21組大鼠在轉染后體重有所增加，空腹血糖水平下降，說明抑制miRNA-21對2型糖尿病大鼠的體重和空腹血糖有一定的影響。通過心肌組織病理學染色進一步觀察糖尿病心肌纖維化，觀察得到DCM大鼠心肌結構排列紊亂，心肌細胞變性壞死，出現(xiàn)心肌細胞間質膠原纖維堆積；而降低miRNA-21的表達后減輕心肌細胞的損傷以及膠原纖維的產生，從而改善糖尿病心肌纖維化。在免疫組化中觀察到降低miRNA-21的表達可以減少心肌間質中α-SMA的合成及沉積，進而抑制DCM的進一步發(fā)展。

綜上所述，抑制miRNA-21表達可以減輕心肌細胞損傷，從而延緩DCM心肌纖維化的進展，以上結果為DCM的機制探討及其纖維化的臨床治療提供了新的思路和方向。