范競文，方 超，李婉玉，任春慧，馮 晨，馮 華

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011)

卵巢癌(ovarian cancer,OC)是女性生殖系統(tǒng)中致死率最高的惡性腫瘤[1]。發(fā)病早期隱匿，缺乏典型的臨床癥狀和有效的篩查與診斷方法，約70%患者初診時已處于晚期[2]。順鉑作為卵巢癌臨床治療的一線用藥，在卵巢癌的化療中發(fā)揮了重要的作用，大多數(shù)卵巢癌患者起初對順鉑敏感，但是最終常發(fā)展為耐藥[3-4]。因此尋找有效的的途徑增強(qiáng)卵巢癌對順鉑的敏感性，抑制其耐藥并探討其分子機(jī)制，成為研究的熱點(diǎn)。PI3K/AKT(磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞存活和介導(dǎo)其耐藥的關(guān)鍵通路，相關(guān)研究表明LY294002(PI3K泛抑制劑)可以增強(qiáng)某些抗腫瘤藥物的療效，減少化療抵抗作用[5-7]。但目前對LY294002聯(lián)合順鉑對卵巢癌增殖和侵襲影響的具體機(jī)制研究甚少。因此本研究旨在觀察LY294002聯(lián)合順鉑對卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲的影響，并以PI3K/AKT通路為靶點(diǎn)，探討其作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780和SKOV3由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理教研室饋贈。

1.1.2 主要試劑 LY294002購自MCE公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Biosharp公司；順鉑、胰蛋白酶、CCK-8試劑盒購自meilunbio公司；β-actin、MMP2、MMP9、AKT抗體購自proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A2780和SKOV3細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清和1%青/鏈霉素的RPMI-1640的培養(yǎng)基培養(yǎng)，2～3 d換液，待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時用0.25%胰酶進(jìn)行消化、傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8測定細(xì)胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后離心，用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基稀釋成單細(xì)胞懸液，接種到96孔板中，調(diào)整細(xì)胞濃度至8000個/孔，每孔加入RPMI1640培養(yǎng)液100 μL，并設(shè)置空白對照。培養(yǎng)24 h后棄去原培養(yǎng)液，每孔加入不同濃度的LY294002(10、20、40、60 μmol/L)和順鉑(5、15、25、40 μmol/L)100 μL含藥培養(yǎng)液，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔；無細(xì)胞孔加入不含藥物的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄去原培養(yǎng)液，每孔加入含10 μL CCK-8溶液的RPMI1640培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，用酶標(biāo)儀檢測450 nm下各孔的OD值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率=1-(OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白對照組)/(OD正常對照組-OD空白對照組)×100%。用Graphpad prism 8.0計(jì)算IC50(半數(shù)抑制濃度)值并繪制細(xì)胞增殖抑制曲線。

1.2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測定遷移能力 取對數(shù)生長期的A2780和SKOV3細(xì)胞，將細(xì)胞接種到6孔板中，每孔含有6×105個細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后每孔垂直于6孔板劃3條平行線，然后用PBS洗去脫落細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)液，根據(jù)CCK-8所測兩種細(xì)胞對于兩種藥物的IC50值確定加藥濃度后分組，分為正常對照組、LY294002組(20 μmol/L)、順鉑組(10 μmol/L)、LY294002+順鉑組(20 μmol/L+10 μmol/L)。最后將所有細(xì)胞放入含5% CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱中，分別記錄干預(yù)24 h、48 h后的細(xì)胞劃痕愈合情況，用Image J軟件進(jìn)行相關(guān)分析。

1.2.4 Western Blot 收集各組細(xì)胞樣本，加入RIPA液裂解，于4 ℃、12000 r/min條件下離心15 min，取上清液為細(xì)胞蛋白檢測樣本，BCA法測定總蛋白含量。配制10%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，蛋白上樣跑電泳，分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入稀釋后的一抗(β-catin 1:2000、MMP2 1:800、MMP9 1:800、AKT 1:1000)4 ℃冰箱孵育過夜，用TBST液漂洗3次，每次5 min；加入二抗室溫?fù)嵊? h，再用TBST液漂洗3次，每次5 min，ECL顯影。每個樣本重復(fù)3次。應(yīng)用Image J軟件分析條帶灰度值，計(jì)算蛋白相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并用Graphpad prism 8.0作圖。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，多組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LY294002和順鉑對卵巢癌A2780、SKOV3細(xì)胞增殖的影響結(jié)果表明，LY294002和順鉑對細(xì)胞增殖的抑制作用隨著藥物濃度升高而增加，并且呈劑量依賴性，當(dāng)LY294002濃度在30 μmol/L時對兩種細(xì)胞均有明顯的抑制作用，而后隨藥物濃度的增加對A2780細(xì)胞的抑制作用要強(qiáng)于SKOV3細(xì)胞。當(dāng)順鉑濃度在15 μmol/L時對兩種細(xì)胞均有明顯的抑制作用，超過20 μmol/L時，對A2780細(xì)胞的抑制率明顯高于SKOV3細(xì)胞。LY294002和順鉑對A2780、SKOV3細(xì)胞的增殖抑制率見圖1。

圖1 不同濃度的LY294002和順鉑對A2780和SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用

2.2 LY294002和順鉑對A2780、SKOV3細(xì)胞遷移的影響結(jié)果表明，劃痕24 h后，與對照組相比，A2780和SKOV3細(xì)胞的LY294002組、順鉑組及LY294002+順鉑組遷移面積顯著減小(P<0.01)，與LY294002組或順鉑組相比，LY294002+順鉑組A2780、SKOV3細(xì)胞遷移距離均顯著減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；劃痕48 h后，劃痕面積明顯縮小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，效果比24 h更明顯。各組A2780、SKOV3細(xì)胞遷移面積見圖2、圖3。

圖2 各組A2780細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×10)

圖3 各組SKOV3細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×10)

2.3 LY294002聯(lián)合順鉑對A2780、SKOV3細(xì)胞MMP2、MMP9蛋白表達(dá)的影響結(jié)果表明，與對照組相比，LY294002組、順鉑組及LY294002+順鉑組A2780、SKOV3細(xì)胞MMP2、MMP9的蛋白表達(dá)水平均較正常對照組降低(P<0.05)；同時，與LY294002組或順鉑組單獨(dú)用藥相比，LY294002+順鉑組A2780、SKOV3細(xì)胞MMP2、MMP9蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。各組A2780、SKOV3細(xì)胞MMP2、MMP9蛋白表達(dá)水平見圖4、圖5。

2.4 LY294002聯(lián)合順鉑對A2780、SKOV3細(xì)胞AKT蛋白表達(dá)水平的影響結(jié)果表明，與對照組相比，LY294002組、順鉑組及LY294002聯(lián)合順鉑組A2780、SKOV3細(xì)胞AKT水平均顯著降低(P<0.05)，同時，與LY294002組或順鉑組相比，LY294002+順鉑組A2780、SKOV3細(xì)胞AKT水平顯著降低(P<0.05)，各組A2780、SKOV3細(xì)胞AKT蛋白表達(dá)水平見圖4、圖5。

圖4 各A2780細(xì)胞MMP2、MMP9及AKT的蛋白表達(dá)水平

圖5 各組SKOV3細(xì)胞MMP2、MMP9及AKT的蛋白表達(dá)水平

3 討論

卵巢癌為女性生殖系統(tǒng)第一致死率的惡性腫瘤，發(fā)病率居?jì)D科惡性腫瘤的第3位，僅次于子宮內(nèi)膜癌和子宮頸癌，由于缺乏有效的早期篩查及診斷方法，超過70%的卵巢癌患者一經(jīng)診斷已處于晚期[8]。雖然很多晚期患者最初受益于滿意的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合以鉑類為基礎(chǔ)的化療，但近90%的患者仍會復(fù)發(fā)，并最終導(dǎo)致死亡[9-10]。雖然最初鉑類(順鉑/卡鉑) 聯(lián)合紫杉醇化療對大約80%的患者有效，但卵巢癌的治療難點(diǎn)在于其侵襲性強(qiáng)以及易產(chǎn)生耐藥性，后期易復(fù)發(fā)，迫使患者進(jìn)行全部化療療程，不但治療效果欠佳，同時會出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)。在這種情況下急需一種新的聯(lián)合治療策略來提高晚期卵巢癌的臨床療效。與此同時，闡明卵巢癌的遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移機(jī)制，對于臨床上尋找敏感的診斷指標(biāo)及基因治療靶點(diǎn)，從而提高卵巢癌患者的生存期無疑具有極其重要的意義[11]。

PI3K/AKT/mTOR信號通路作為細(xì)胞內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，參與很多重要的生物學(xué)過程的調(diào)控，有報(bào)道指出PI3K/AKT/mTOR信號通路在卵巢癌中的增殖、侵襲、細(xì)胞周期進(jìn)程、血管形成及耐藥中發(fā)揮著重要的作用，因而PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制劑成為卵巢癌治療新方向。因此本研究選用PI3K抑制劑LY294002聯(lián)合順鉑作用于卵巢癌細(xì)胞，探討其聯(lián)合應(yīng)用能否增強(qiáng)順鉑的化療效果，抑制腫瘤的增殖、侵襲和遷移。

本研究從不同濃度藥物L(fēng)Y294002和順鉑作用人卵巢癌A2780和SKOV3細(xì)胞，觀察對增殖抑制效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LY294002和順鉑均對細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，隨著藥物濃度升高而增加呈劑量依賴性。惡性腫瘤難治的原因之一就是腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲造成體內(nèi)轉(zhuǎn)移，為腫瘤治療造成很大阻礙，本研究在明確LY294002和順鉑抑制增殖效果的基礎(chǔ)上，通過劃痕實(shí)驗(yàn)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)劃痕24 h后，LY294002聯(lián)合順鉑遷移面積顯著減小，劃痕48 h后，劃痕面積明顯縮小，效果比24 h更明顯。與單獨(dú)用藥相比，LY294002聯(lián)合順鉑可降低A2780、SKOV3細(xì)胞MMP2、MMP9蛋白表達(dá)水平。表明LY294002可促進(jìn)順鉑抑制A2780和SKOV3 細(xì)胞的遷移和侵襲。AKT是PI3K/AKT信號通路中主要的下游效應(yīng)靶基因，對細(xì)胞生存、細(xì)胞周期進(jìn)程，細(xì)胞生長，新陳代謝有很大的影響。因此，抑制PI3K/AKT通路可以阻止腫瘤細(xì)胞的生長或發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，與LY294002組或順鉑組相比，LY294002聯(lián)合順鉑可顯著降低A2780和SKOV3細(xì)胞AKT水平，說明順鉑抑制A2780和SKOV3細(xì)胞增殖、侵襲作用與調(diào)控PI3K/AKT通路有關(guān)。

本研究尚存在一定的局限性，目前僅在細(xì)胞水平證實(shí)了順鉑和LY294002對卵巢癌的作用，但尚未在動物模型中深入研究其作用和相關(guān)機(jī)制，且具體治療效果還有待于臨床評估。我們可以在未來不斷優(yōu)化靶向藥物的聯(lián)合治療，使不同作用機(jī)制的藥物配合使用，在最大程度上發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用，實(shí)現(xiàn)多選擇性的個體化分子靶向治療[12]。

綜上所述，LY294002和順鉑能協(xié)同抑制人卵巢癌細(xì)胞株A2780和SKOV3的增殖和侵襲，順鉑聯(lián)合LY294002協(xié)同抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲可能通過PI3K/AKT/mTOR信號通路來實(shí)現(xiàn)。本研究為卵巢癌治療方式的選擇提供新的理論依據(jù)。但其更多潛在的抗腫瘤機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。