劉瑞芳，張志迪，陳夢(mèng)茜，金在順

(牡丹江醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率一直居高不下，病理類型以鱗狀細(xì)胞癌最常見[1-2]。鋅指蛋白19(PHD finger protein 19,PHF19)，是多梳抑制復(fù)合體2(Polycomb repressive complex2,PRC2)的重要成員之一，定位于人類染色體9q33.2[3]。有研究認(rèn)為PHF19能夠通過(guò)自身Tudor結(jié)構(gòu)域結(jié)合于H3組蛋白36位的賴氨酸殘基，參與染色體活化[4]，并在多種癌癥中發(fā)揮促癌作用。有實(shí)驗(yàn)研究表明了[5]，PHF19在宮頸癌Hela細(xì)胞中高表達(dá)，siRNA干擾PHF19表達(dá)后，Hela細(xì)胞增殖抑制并且凋亡增加。因此，本文欲探討PHF19的表達(dá)對(duì)宮頸癌不同分化程度的細(xì)胞(Hela細(xì)胞和HCC94細(xì)胞)增殖、侵襲和遷移的影響，為尋找宮頸癌臨床潛在治療靶點(diǎn)提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑人宮頸癌Hela細(xì)胞株購(gòu)自吉?jiǎng)P公司；人宮頸癌HCC94細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自上海立菲生物科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自以色列BI生物科技公司；胰酶購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；siRNA試劑盒購(gòu)自廣州銳博生物有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自賽國(guó)(中國(guó))生物科技有限公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Roche公司；SYBR Green Tap Ready Mix購(gòu)自美國(guó)Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Hela細(xì)胞株、HCC94細(xì)胞株常規(guī)復(fù)蘇，加入含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，放入37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，進(jìn)行換液，傳代，凍存等。

1.2.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的Hela細(xì)胞和HCC94細(xì)胞，按每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于3個(gè)96孔板，培養(yǎng)24 h后，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書，按照siRNA-2-50濃度，進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)箱孵育4 h，酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光值。細(xì)胞活力(%)=(siRNA組-空白組)/(對(duì)照組-空白組)。

1.2.3 RT-qPCR檢測(cè)PHF19的mRNA表達(dá) 按照E.Z.N.A.TM HP Total RNA Kit說(shuō)明書從培養(yǎng)的細(xì)胞中提取總RNA，并用NANODROP測(cè)定RNA濃度及純度。根據(jù)Roche逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將上述提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)完成擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸50 s；進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，收集數(shù)據(jù)。每個(gè)樣本重復(fù)3次，利用2-ΔΔCT法計(jì)算各樣本mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1、反應(yīng)體系見表2。

表1 RT-qPCR引物擴(kuò)增序列

表2 RT-qPCR反應(yīng)體系

1.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 培養(yǎng)Hela細(xì)胞和HCC94細(xì)胞于六孔板中，每孔種3×105個(gè)細(xì)胞，以未做任何處理組為Hela組和HCC94組、按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書通過(guò)siRNA-2-50(轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書中給出的轉(zhuǎn)染濃度)濃度進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理的組為siRNA-2-50組、以siRNA-NC轉(zhuǎn)染處理組為NC組，待各組細(xì)胞貼壁后，用10 μL移液器槍頭對(duì)每孔內(nèi)劃3條直線，吸凈培養(yǎng)基，PBS輕輕沖洗兩次用倒置顯微鏡拍照，加入siRNA轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)，于12 h、24 h處用倒置顯微鏡拍照。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 培養(yǎng)Hela細(xì)胞和HCC94細(xì)胞于24孔板，每孔種2×105個(gè)細(xì)胞，以未做任何處理組為Hela組和HCC94組、按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書通過(guò)siRNA-2-50濃度轉(zhuǎn)染處理組為siRNA-2-50組、以siRNA-NC轉(zhuǎn)染處理組為NC組，胰蛋白酶常規(guī)消化，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞濃度為1×106/mL，Transwell小室鋪Matrigel膠后于培養(yǎng)箱放置1 h，于上室加細(xì)胞懸液200 μL，下室加10% FBS 600 μL，培養(yǎng)24 h，第二天PBS沖洗，甲醇固定再?zèng)_洗，結(jié)晶紫染色后沖洗，顯微鏡拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用GraphPad Prism 7.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，兩組間差異性比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA作用后Hela細(xì)胞和HCC94細(xì)胞中PHF19的mRNA表達(dá)減少RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，siRNA作用后與Hela組和HCC94組相比，siRNA-2-50組中PHF19 mRNA的水平表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

圖1 siRNA處理后PHF19基因mRNA的相對(duì)表達(dá)

2.2 siRNA作用后Hela細(xì)胞和HCC94細(xì)胞增殖活性降低CCK-8檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明，siRNA作用24 h、48 h、72 h后，對(duì)比Hela組和HCC94組，siRNA-2-50組細(xì)胞增殖活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖2)。

圖2 siRNA處理后細(xì)胞的存活率

2.3 siRNA作用后Hela細(xì)胞和HCC94細(xì)胞遷移能力降低細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，siRNA作用24 h后，siRNA-2-50組細(xì)胞的遷移能力明顯受到抑制，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見圖3)。

圖3 siRNA干擾后細(xì)胞的遷移能力

2.4 siRNA作用后Hela細(xì)胞和HCC94細(xì)胞侵襲能力降低Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)證實(shí)了，siRNA作用24 h后，對(duì)比Hela組和HCC94組，siRNA-2-50組細(xì)胞的侵襲能力降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖4)。

圖4 siRNA作用后細(xì)胞的侵襲能力(×100)

3 討論

多梳蛋白家族(Polycomb group protein,PcG)是一類在染色質(zhì)水平上以表觀遺傳修飾方式調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄因子，通常以PRC的形式存在[6]，在細(xì)胞分化、維持細(xì)胞特性等多種方面存在至關(guān)重要的作用，目前探討較多的是PRC1和PRC2[7]。PHF19是PRC2中的主要成員之一，參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展[8-9]。近年來(lái)，許多研究表明PHF19在多種癌癥都發(fā)揮促癌作用，包括皮膚癌、膠質(zhì)瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌和結(jié)腸癌等。

Tao F等[10]研究證明MALAT1/miR-211/PHF19調(diào)節(jié)軸參與了卵巢癌的發(fā)病，促進(jìn)了卵巢癌的增殖和遷移。Hu H[4]等有研究表明，PHF19的促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖。WANG H[11]等研究表明，PHF19在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和遷移。由此，我們猜測(cè)PHF19作為癌基因也可能在宮頸癌中發(fā)揮促癌作用，本課題組之前已經(jīng)研究證實(shí)了[5]PHF19在宮頸癌低分化Hela細(xì)胞中高表達(dá)，可促進(jìn)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖，抑制凋亡，Hela細(xì)胞為宮頸癌常用細(xì)胞系。因此，我們猜測(cè)PHF19是否在宮頸癌高分化細(xì)胞(HCC94)中也存在高表達(dá)，并且PHF19基因是否可以調(diào)節(jié)宮頸癌的侵襲和遷移能力。

為探究PHF19對(duì)宮頸癌細(xì)胞的具體影響，我們首先對(duì)人宮頸癌不同細(xì)胞系(Hela細(xì)胞和HCC94細(xì)胞)進(jìn)行siRNA干擾，通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)顯示，進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中PHF19 mRNA的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組細(xì)胞，且在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著意義，證明siRNA成功干擾PHF19的表達(dá)。我們進(jìn)行了CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PHF19對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞和HCC94細(xì)胞增殖活力的影響，對(duì)siRNA-2-50組、正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行24 h、48 h、72 h的培養(yǎng)后，CCK-8結(jié)果均顯示，在siRNA干擾PHF19的表達(dá)后，Hela和HCC94細(xì)胞的增殖能力均明顯減低。為了觀察PHF19對(duì)宮頸癌不同細(xì)胞系侵襲、遷移能力的影響，我們分別進(jìn)行了細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)，siRNA處理24 h后，Hela細(xì)胞和HCC94細(xì)胞的遷移能力明顯受到抑制；Transwell實(shí)驗(yàn)同樣驗(yàn)證了PHF19可以促進(jìn)宮頸癌不同細(xì)胞系的侵襲能力。

綜上所述，在本研究中PHF19在宮頸癌不同分化程度的細(xì)胞系中高表達(dá)，但PHF19與宮頸癌不同惡性程度是否存在關(guān)系，尚未可知，需要我們進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。通過(guò)siRNA干擾PHF19的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)PHF19在宮頸癌中作為促癌基因，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖及侵襲遷移能力。但是腫瘤的發(fā)生進(jìn)展是一個(gè)較為復(fù)雜的過(guò)程，受多種細(xì)胞因子調(diào)控[12]，其促進(jìn)宮頸癌發(fā)展進(jìn)程的具體相關(guān)機(jī)制尚未得到明確研究。一些研究結(jié)果顯示，PHF19可以影響AKT和ERK的活性，AKT和ERK是兩個(gè)信號(hào)通路中的兩個(gè)關(guān)鍵激酶。此外，PHF19基因敲除可能通過(guò)降低AKT和ERK信號(hào)活性而強(qiáng)烈抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移，提示AKT和ERK信號(hào)可能介導(dǎo)PHF19在癌癥中的作用[13]。在此背景下，我們可以猜測(cè)PHF19在宮頸癌中是否也可以通過(guò)介導(dǎo)對(duì)AKT和ERK信號(hào)的調(diào)控來(lái)影響宮頸癌增殖和侵襲遷移的發(fā)生機(jī)制，這值得我們?cè)谖磥?lái)進(jìn)一步研究闡明。