于成龍，李 冀，陳培劍，馮 瑩，于建渤

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院病理診斷中心；2.黑龍江省腫瘤疾病防治重點實驗室，黑龍江 牡丹江 157011)

甲狀腺癌是世界上最常見的內(nèi)分泌癌[1]，并且發(fā)病率在全球范圍內(nèi)繼續(xù)上升，主要是由于乳頭狀癌組織類型(PTC)的增加。約有10%～15%的PTC患者可能復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和死亡[2]，因此，有必要充分了解PTC發(fā)生、發(fā)展過程中的分子機制，能夠有效治療該疾病。大量研究表明，谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPXs)參與了許多腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

在GPXs家族中，GPX3是唯一在腎臟合成并主動分泌到血漿中的胞外酶，GPX3可保護細胞免受氧化應(yīng)激，在清除過氧化氫和其他活性氧方面起著至關(guān)重要的作用[3-4]。但是 GPX3在甲狀腺癌中的發(fā)生和發(fā)展的機制仍不十分清楚。本實驗通過檢測 GPX3在BCPAP細胞株中的表達情況，探討GPX3對BCPAP細胞的增殖、遷移的影響。

1 材料和方法

1.1 材料細胞株BCPAP購自中國科學(xué)院細胞庫；DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清(美國Gibco生物公司)；過表達的慢病毒載體和對照載體(上海和元生物技術(shù)股份有限公司)；Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒(日本同仁)；BeyoClick EdU-555細胞增殖檢測試劑盒(產(chǎn)品編號C0075S)(上海碧云天生物技術(shù)公司)；引物及設(shè)計與純化(上海生工生物工程股份有限公司)； RNA提取試劑盒(Omega公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo公司)；7500實時熒光定量PCR系統(tǒng)(美國Thermo公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；SpectraMax M3多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) BCPAP細胞株在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細胞置于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細胞生長情況，定時更換培養(yǎng)液。

1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染 選擇狀態(tài)良好的BCPAP細胞株接種到6孔板及4個培養(yǎng)皿中，細胞計數(shù)后，按1×106/孔細胞及10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基進行鋪板，放入培養(yǎng)箱12 h后待細胞完全貼壁并且細胞融合度達到70%左右后，更換血清培養(yǎng)基，分成兩組，按MOI值為10比例，第一組(GPX3-BCPAP組)加入過表達GPX3慢病毒到孔內(nèi)，第二組(NC-BCPAP組)加入空載病毒到孔內(nèi)，并且加入10 μL的Polybrene增加轉(zhuǎn)染效率，病毒感染8～12 h后，觀察細胞狀態(tài)，在24 h內(nèi)重新?lián)Q成10%胎牛血清完全培養(yǎng)基，再次放入培養(yǎng)箱，感染72 h后用共聚焦顯微鏡觀察細胞，用共聚焦顯微鏡觀察細胞的熒光強弱來判斷慢病毒轉(zhuǎn)染目的細胞的效率。

1.2.3 BeyoClick EdU-555細胞增殖檢測 應(yīng)用BeyoClick EdU-555細胞增殖檢測試劑盒檢測細胞增殖情況，最后用共聚焦顯微鏡觀察。并使用Image J軟件進行細胞計數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 CCK-8細胞活性檢測 將GPX3過表達及空載慢病毒轉(zhuǎn)染成功的細胞按照3000細胞/孔的密度接種于96孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM制成單細胞懸液，在5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育4 h，于酶標儀450 nm處檢測OD值。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 劃痕實驗 GPX3過表達及空載慢病毒成功轉(zhuǎn)染后，將BCPAP細胞分別以1×105細胞/孔接種在6孔板中。當細胞融合達到大約90%時，使用無菌移液器吸頭有序的刮擦細胞瓶底部，用PBS清除刮擦后細胞，重新加入2 mL完全培養(yǎng)液。在刮擦后0 h、24 h，使用倒置顯微鏡(×200)拍攝并使用Image J軟件分別計算各組面積X0、X24；按照公式(X0-X24)/X0計算相對愈合面積，實驗重復(fù)3次。

1.2.6 qRT-PCR檢測GPX3和Caspase-3表達情況 根據(jù)E.Z.N.A.TM HP Total RNA Kit說明書從培養(yǎng)細胞中分離獲得總RNA。并使用1 μg總RNA利用Transcriptor First Strand cDNA試劑盒進行cDNA第一條鏈合成，再用Fast SYBR green PCR master mix(Roche)進行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再通過引物序列進行擴增，并且使用GAPDH作為內(nèi)部參照。引物序列見表1，反應(yīng)體系見表2。反應(yīng)條件：20 μL反應(yīng)體系，95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸10 min。進行44個循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次，依據(jù) 2-△△CT法計算mRNA各樣本相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

表2 qRT-PCR反應(yīng)體系

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，定量數(shù)據(jù)均是用“均數(shù)±標準差”表示，兩組間差異性比較采用t檢驗，三組間比較采用方差分析，并進行多重比較。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染后的BCPAP細胞株形態(tài)觀察細胞轉(zhuǎn)染72 h后，在共聚焦顯微鏡下觀察到慢病毒成功轉(zhuǎn)染的細胞顯示綠色熒光，表明NC-BCPAP組與GPX3-BCPAP組轉(zhuǎn)染成功,見圖1。

圖1 共聚焦顯微鏡下慢病毒轉(zhuǎn)染后的細胞形態(tài)(×200)

2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染后檢測BCPAP中GPX3 mRNA的表達qRT-PCR檢測在NC-BCPAP組和GPX3-BCPAP組中GPX3的表達，GPX3-BCPAP組(10.2173±2.0818)GPX3表達明顯高于NC-BCPAP組(0.7819±0.1019)(P<0.001)。

2.3 EDU-555檢測過表達GPX3抑制BCPAP細胞的增殖BeyoClick EdU-555結(jié)果顯示，與NC-BCPAP組(31.3260±19.1772)相比，GPX3-BCPAP組(12.4868±6.7064)EDU陽性染色細胞數(shù)量顯著降低，表明過表達GPX3是通過抑制細胞中DNA的合成的方式來抑制BCPAP細胞的增殖能力(P<0.05)，見圖2。

圖2 共聚焦顯微鏡下BCPAP細胞的增殖能力(×200)

2.4 CCK-8檢測過表達GPX3抑制BCPAP細胞的增殖能力CCK-8結(jié)果顯示，GPX3-BCPAP組(0.3316±0.004)細胞的增殖能力低于NC-BCPAP組(0.4141±0.003)細胞增殖能力(P<0.05)。

2.5 過表達GPX3抑制BCPAP細胞的遷移能力劃痕實驗結(jié)果顯示：GPX3-BCPAP組BCPAP細胞相對愈合面積(7.31±9.78)%明顯低于NC-BCPAP組(24.40±0.83)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示過表達GPX3能抑制BCPAP細胞的遷移，見圖3。

圖3 熒光顯微鏡下各組細胞不同時間點的遷移能力(×200)

2.6 慢病毒轉(zhuǎn)染后檢測BCPAP中Caspase-3的表達qRT-PCR檢測結(jié)果顯示GPX3-BCPAP組(21.644±6.149)Caspase-3表達明顯高于NC-BCPAP組(3.577±0.951)，表明過表達GPX3可能促進BCPAP細胞的凋亡(P<0.05)。

3 討論

甲狀腺癌是近幾十年來所有實體腫瘤中增長最快的癌癥。PTC是甲狀腺癌的最主要類型[5]，僅PTC占所有甲狀腺癌的85%左右，盡管手術(shù)和其他療法可以解決大多數(shù)情況，但患者的發(fā)病率很高，在某些情況下，腫瘤表現(xiàn)出更具侵略性的行為[6]，因此，必須全面了解PTC細胞轉(zhuǎn)移過程中的分子機制，并確定新的治療靶點，以便對這種疾病進行有效的治療，雖然在過去的幾十年里發(fā)現(xiàn)了越來越多的生物標記物，但還沒有發(fā)現(xiàn)PTC的特異性生物標記物，很明顯，惡性腫瘤的早期診斷是確?；颊吒妙A(yù)后的關(guān)鍵，因此，迫切需要尋找對PTC患者具有治療和預(yù)后價值的有前途的生物標志物。

GPX3是GPXs的一種分泌形式、硒蛋白，在血漿和粘膜表面很容易檢測到，是血漿中的主要抗氧化酶,它在活性氧進入細胞之前對其進行解毒[7]，并且GPX3是GPXs中唯一的胞外糖基化酶，GPX3在不同的腫瘤類型中起著雙重作用，既是腫瘤抑制蛋白，又是促生存蛋白,可催化還原型谷胱甘肽對水和可溶性脂質(zhì)過氧化氫的解毒作用[8]。來越多的證據(jù)表明，GPXs家族基因在人類癌癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，特別是GPX3已被證實經(jīng)常異常表達，并與乳腺癌、肝癌、腎透明細胞癌[9]等多種人類癌癥的進展密切相關(guān)。Peng等人[10]利用qRT-PCR檢測了在9個胃癌細胞系中的8個檢測到GPX3的下調(diào)或沉默，通過刮擦傷口愈合試驗檢測，胃癌細胞中GPX3高表達降低了細胞遷移的能力，Zhao[11]等人發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性PTC組織中GPX3的表達經(jīng)常降低或缺失，同樣，在本研究中，我們使用劃痕實驗檢測發(fā)現(xiàn)在BCPAP細胞株中高表達的GPX3的遷移能力降低，我們還通過CCK-8，BeyoClick EdU-555檢測發(fā)現(xiàn)GPX3-BCPAP組細胞的增殖速率及增殖能力低于NC-BCPAP組，此外，利用qRT-PCR證實了與NC-BCPAP細胞組相比，GPX3-BCPAP組PTC的細胞凋亡能力增強，此外，An等人[12]也在肺癌中發(fā)現(xiàn)GPX3能有效抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。經(jīng)過充分的研究，已被證實GPX3在大多數(shù)癌癥中起著抑癌作用，其可能作為預(yù)后生物標志物的使用以及臨床干預(yù)的潛在靶標[13]。

綜上所述，過表達的GPX3在PTC細胞中顯著抑制細胞的增殖、遷移，并且可以促進癌細胞的凋亡，可能有希望作為甲狀腺癌患者的診斷或預(yù)后生物標志物，為開發(fā)有效的甲狀腺癌治療靶標和生物標志物提供了重要線索，但具體機制還有待進一步的研究。