龐玲玲 劉承彰

中標能效科技（青島）有限公司 山東 青島 266100

引言

疫情的出現(xiàn)，讓消費者對曾經(jīng)用肉眼難以觀察的細菌、病毒有了一次深入的認識，因而更加關注帶有健康功能的消費品，帶有殺菌效果的家電也備受青睞。面對商機，開發(fā)安全有效的殺菌技術是不同的企業(yè)面臨的課題。

石墨烯在殺菌效果及安全性方面有獨特的優(yōu)勢。納米級的石墨烯可以通過物理方式殺死細菌。由于石墨烯是納米級的尺寸薄片結(jié)構(gòu)，細菌是微米級，前者比后者小1000倍，基于石墨烯材料對細菌的切割作用，可以將細菌殺死，這種物理殺菌方法不會讓細菌產(chǎn)生耐藥性。基于這種原理，考慮將石墨烯應用在凈水管路中進行殺菌。

凈水設備一直存在自身滋生細菌的情況[1]。王達偉[2]等曾檢測305臺水質(zhì)處理設備，發(fā)現(xiàn)總體性能實驗中27臺（8.9%）菌落總數(shù)超過GB5749-2006《生活飲用水衛(wèi)生標準》規(guī)定的限值100CFU/mL；入戶調(diào)查52臺設備，發(fā)現(xiàn)15臺水處理設備出水中菌落總數(shù)超過GB5749-2006《生活飲用水衛(wèi)生標準》規(guī)定的限值100CFU/mL，菌落總數(shù)超標率達 28.8%，菌落總數(shù)中的細菌進一步分離鑒定，檢出的細菌有銅綠假單胞菌，蠟樣芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌等。而同時檢測的自來水水樣，均未檢出菌落總數(shù)、總大腸菌群及大腸埃希氏菌。

如何在凈化水的過程中，減少微生物的滋生，需要考慮不同的殺菌技術，石墨烯殺菌是基于物理殺菌的原理，對飲用水是安全的，可以考慮應用到凈水龍頭上，因而設計了實驗，驗證其殺菌效果。

本實驗參考GB/T 20944.3-2008 《紡織品抗菌性能的評價第3部分：振蕩法》，設計了檢測方法來測試石墨烯的殺菌效果。

1 實驗設計

1.1 菌種的選取

選擇革蘭氏陰性代表菌大腸桿菌ATCC25922；

1.2 實驗方案

1.2.1 將混合有石墨烯的碳棒碾碎至粉末狀。

1.2.2 將大腸桿菌分別接種到裝有實驗樣與對照樣的三角燒瓶中，在規(guī)定的溫度下振蕩一定時間，測定三角燒瓶內(nèi)菌液在振蕩前及振蕩一定時間后的活菌濃度，計算抑菌率，以此評價試驗的抗菌效果。

2 實驗方法及結(jié)果

用兩步預培養(yǎng)程序制備細菌接種菌液。從3代～10代的細菌保存試管斜面中取一接種環(huán)，在營養(yǎng)瓊脂平板上畫線，于37℃±1℃，培養(yǎng)18h～24h。用接種環(huán)從平板中挑出單菌落，接種于10mlBHI腦心浸出液肉湯中，培養(yǎng)18h～24h，得到的即為接種菌懸液。

培養(yǎng)18h～24h的菌種懸液，做連續(xù)的稀釋，稀釋至10-2稀釋度，吸取3mL 10-2到45mL 0.03 mol/L PBS（磷酸鹽）緩沖液中，振蕩搖勻后，即為待接種菌懸液。對培養(yǎng)18～24小時的菌種懸液進行連續(xù)的稀釋，一直稀釋到10-7進行計數(shù)，計數(shù)結(jié)果：大腸桿菌菌懸液的濃度為1.0×109CFU/mL，由此推算得知待接種菌懸液的濃度為 6.67×105CFU/mL 。

準備9個250mL 三角燒瓶，在其中3個燒瓶中加入測試樣品10g，3個樣品加入對照樣（用于驗證試驗微生物生長條件的、不經(jīng)任何處理的樣品），另外3個燒瓶不加測試樣作為空白對照，然后在每個燒瓶中各加入70mL 0.03mol/L PBS 緩沖液?？瞻讓φ沼糜谟^察試驗菌的接種濃度，并觀察試驗菌在試驗期內(nèi)的活性，防止因其自身的衰減獲得虛高的試驗結(jié)果。

往3個空白對照三角燒瓶和3個對照樣燒瓶中加入5ml 接種菌液，放在恒溫振蕩器上，在24℃±1℃，以250r/min～300r/min，振蕩1min±5s。振蕩結(jié)束后在6個燒瓶中各吸取1mL，移入裝有9mL 0.03mol/L PBS緩沖液試管中，充分混勻。用10倍稀釋法再進行1次稀釋，充分混勻。吸取1ml移入滅菌的瓶平皿，傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15ml。每個稀釋倍數(shù)的試管分別吸液制作兩個平板做平行樣。室溫凝固，倒置平板，37℃±1℃，培養(yǎng)18h～24h。記錄每個平板中的菌落數(shù)。

往3個測試樣燒瓶中加入5mL接種菌液，與完成取樣的6個空白對照和對照樣燒瓶，9個三角燒瓶一起一起置于恒溫振蕩器上，在24℃±1℃，以150r/min，振蕩18h。

到規(guī)定時間后，從每個三角燒瓶中吸取1ml 試液，移入裝有9ml PBS緩沖液的試管中，充分混勻。用10倍稀釋法系列稀釋到合適稀釋倍數(shù)。用吸管從每個稀釋倍數(shù)的試管中分別吸取1ml移入滅菌的平皿，傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15mL。每個稀釋倍數(shù)的試管分別吸液制作兩個平板做平行樣。室溫凝固，倒置平板，37℃±1℃，培養(yǎng)24h～48h。檢測結(jié)果見表1。

表1 振蕩培養(yǎng)后，菌落計數(shù)結(jié)果

說明：

試驗菌增長值F為2.05，F(xiàn)值大于1.5，試驗有效。

F—對照樣的試驗菌增長值；

Wt—3個對照樣18h振蕩接觸后燒瓶內(nèi)的活菌濃度的平均值（CFU/mL）

W0—3個對照樣“0”接觸時間燒瓶內(nèi)的活菌濃度的平均值（CFU/mL）

抑菌率的計算：

Y—試樣的抑菌率;

Wt—3個對照樣18h振蕩接觸后燒瓶內(nèi)的活菌濃度的平均值（CFU/mL）；

Qt—3個抗菌石墨烯碳棒試樣18h振蕩接觸后燒瓶內(nèi)的活菌濃度的平均值（CFU/mL）

依據(jù)GB/T 20944.3-2008標準條文，“對金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的抑菌率≥70%，或?qū)Π咨钪榫囊志省?0%，樣品具有抗菌效果?！?/p>

3 結(jié)束語

實驗數(shù)據(jù)表明：最初接入含石墨烯碳棒測試組的大腸桿菌菌懸液濃度平均為4.5×104CFU/mL，經(jīng)過18小時的振蕩培養(yǎng)后，對照菌濃度平均為5.0×106CFU/mL，而含石墨烯碳棒測試組的檢測結(jié)果為：1.0×106CFU/mL。通過檢測數(shù)據(jù)，可以看到石墨烯的抗菌效果為80%，試驗菌增長值F為2.05，F(xiàn)值大于1.5，試驗有效。因此石墨烯對于大腸桿菌是具有殺菌效果的。

實驗結(jié)果豐富了石墨烯對凈飲設備抗菌性能的基礎技術數(shù)據(jù)，為石墨烯的開發(fā)提供了技術支持。為凈水機除菌方式研究提供了數(shù)據(jù)參考。