丹尼爾·多里坤 卡吾力·居買 張海平 買地尼也提·尼亞孜 伊地力斯·阿吾提2,

1.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究院，新疆烏魯木齊 830054；2.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院小兒外一科，新疆烏魯木齊 830054；3.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胸外科，新疆烏魯木齊 830054

食管癌是全球常見的惡性腫瘤之一[1]，而我國是全球食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國家，病理類型以鱗癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）為主[2-3]。新疆位于“亞洲食管癌高發(fā)帶”上，其發(fā)病表現(xiàn)出明顯的地區(qū)差異和民族差異[4-6]，以哈薩克族人群發(fā)病率最高（155.9/10 萬）。DNA錯配修復（mismatch repair，MMR）系統(tǒng)有關(guān)的hMSH2 基因和脆性組氨酸三聯(lián)體（fragile histldine triad，F(xiàn)HIT）基因的表達異常在散發(fā)性大腸癌和肺癌等腫瘤發(fā)病機制中的研究較多[7-9]。近年來研究發(fā)現(xiàn)hMSH2 和FHIT 蛋白表達缺失是食管癌發(fā)生、發(fā)展中的常見基因事件[10-13]，但是未見哈薩克族食管鱗癌中hMSH2 和FHIT 表達相關(guān)性的研究報道。本研究對哈薩克族食管鱗癌hMSH2 和FHIT 表達進行分析，以探討其在食管癌發(fā)生發(fā)展中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013 年5 月—2017 年5 月新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）行食管癌根治術(shù)的43 例哈薩克族食管鱗癌患者，其中男33 例，女10 例；年齡45～77 歲，平均（61.80±8.87）歲；低分化13 例、中分化25 例、高分化5 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27 例。根據(jù)AJCC 癌癥分期手冊第8 版進行術(shù)后病理學分期[14]，Ⅰ～Ⅱ期23 例，Ⅲ期20 例。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會審批通過，并獲得患者知情同意。納入標準：①術(shù)前術(shù)后病理均為鱗癌；②切緣病理檢查示陰性；③有明確的病理分期；④完整的隨訪記錄。排除標準：①術(shù)前接受放療、化療、其他特殊治療；②同時患有其他部位惡性腫瘤。

1.2 定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）

將手術(shù)切取凍存的食管鱗癌組織及相應癌旁正常組織制備成懸液，并裂解提取總RNA。按試劑盒要求的條件獲得cDNA，所得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于PCR 擴增（圖1）。PCR 反應條件：95℃1 min 預變性，95℃變性15 s，57℃退火15 s，72℃延伸45 s，共40 個循環(huán)，65℃延伸7 min。hMSH2 基因引物序列為：5’-CACTGTCTGCGGTAATCAAGT-3’（上游）；5’-CTCTGACTGCTGCAATATC CAAT-3’（下游）。FHIT 基因引物序列為：5’-ATCTCATCAAGCCCTCTGTAGT-3’（上游）；5’-GGACGCAGGTCATGGAAGC-3’（下游）。β-肌動蛋白（β-Actin）內(nèi)參照引物序列為：5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’（上 游）；5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’（下游）。PCR 反應體系由以下試劑或溶液組成：SYBR mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL 和蒸餾水7 μL。

圖1 hMSH2 和FHIT 基因PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果

1.3 免疫組織化學法檢測

采用免疫組織化學Envision 法檢測癌與癌旁組織中hMSH2 和FHIT 蛋白的表達情況。標本經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化、抗原修復，滴加一抗（均為1∶200），于4℃冰箱過夜。次日加二抗，DAB 顯色。PBS 代替一抗作陰性對照。hMSH2 以細胞核出現(xiàn)棕色顆粒為陽性表達，F(xiàn)HIT 以細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒為陽性表達。參照有關(guān)文獻[11]制訂陽性標準：每張切片高倍鏡下隨機選取5 個視野，計數(shù)100 個細胞，按照陽性百分比進行結(jié)果判定。hMSH2 表達分為表達陽性和表達缺失，腫瘤細胞中＜30%的細胞核或完全沒有染色的分為表達缺失。根據(jù)細胞質(zhì)染色的強度，F(xiàn)HIT 表達分級為表達陽性和表達缺失。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 24.0 對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料采用例數(shù)和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier 單因素法和COX 多因素回歸進行生存分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌及其癌旁正常組織中hMSH2 和FHIT基因mRNA 的表達水平

RT-q PCR 檢測hMSH2 和FHIT 基因mRNA 的表達水平，結(jié)果顯示食管鱗癌組織中hMSH2 和FHIT兩個基因的mRNA 的表達水平顯著低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 食管鱗癌和癌旁正常組織中hMSH2和FHIT 的mRNA 表達水平（n=30，）

表1 食管鱗癌和癌旁正常組織中hMSH2和FHIT 的mRNA 表達水平（n=30，）

注：FHIT：脆性組氨酸三聯(lián)體

2.2 食管鱗癌及其癌旁正常組織中hMSH2 和FHIT蛋白的表達情況

hMSH2 蛋白陽性產(chǎn)物主要定位于細胞核（部分細胞質(zhì)亦有表達），F(xiàn)HIT 蛋白陽性產(chǎn)物位于細胞質(zhì)（圖2，見封三）。hMSH2 蛋白在食管鱗癌及其癌旁正常組織中陽性表達率分別為60.5%（26/43）和91.7%（22/24），與癌旁正常組織比較，食管鱗癌組織中hMSH2 表達缺失，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。FHIT蛋白在食管鱗癌及其癌旁正常組織中陽性表達率分別為55.8%（24/43）和91.7%（22/24），與癌旁正常組織比較鱗癌組織中FHIT 表達缺失，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。

2.3 食管鱗癌患者中hMSH2 和FHIT 的蛋白表達水平與臨床病理學特征的關(guān)系

hMSH2 蛋白表達缺失與分化程度（P=0.020），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.028）及術(shù)后病理分期（P=0.014）有關(guān)。FHIT 蛋白表達缺失與浸潤深度有關(guān)（P=0.031）。hMSH2 和FHIT 蛋白表達缺失與食管鱗癌患者的性別無關(guān)（P ＞0.05）。見表2。24 例FHIT 表達陽性的食管鱗癌標本中hMSH2 表達陽性19 例，陰性5 例，陽性率為79.1%（19/24）；在19 例FHIT 表達陰性的食管鱗癌標本中hMSH2 表達陰性7 例，陰性率為36.8%（7/19）。43 例患者中，hMSH2、FHIT 表達相一致的共19 例，占44.1%（19/43），統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)hMSH2 表達與FHIT 表達呈正相關(guān)（r=0.453，P=0.03）。

表2 hMSH2 與FHIT 的表達與哈薩克族食管鱗癌患者臨床病理學特征的關(guān)系

2.4 食管鱗癌患者中hMSH2 和FHIT 的蛋白表達水平與患者預后的關(guān)系

生存分析結(jié)果提示，在食管鱗癌組織中hMSH2 基因表達陽性的患者生存率高于基因表達缺失的患者，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001）。而FHIT 基因表達陽性和表達缺失組患者生存率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.098）。見圖3。

圖3 hMSH2 和FHIT 基因生存曲線

2.5 哈薩克族食管鱗癌患者的COX 生存分析

單因素生存分析結(jié)果顯示hMSH2 基因表達缺失、術(shù)后病理分期及N 分期等因素與患者預后相關(guān)（P ＜0.01）；將hMSH2 基因表達缺失、術(shù)后病理分期及N 分期納入多因素分析結(jié)果顯示，hMSH2 基因表達缺失及腫瘤分化程度高是哈薩克族食管鱗癌患者不良預后的獨立危險因素。見表3。

表3 哈薩克族食管鱗癌患者的COX 生存分析

3 討論

復制后錯配修復基因hMSH2 的表達缺失，是食管鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要分子事件，hMSH2 的表達缺失導致其錯配修復功能的缺陷[12,15]。FHIT 作為一種腫瘤抑制基因，自發(fā)現(xiàn)以來就引起了廣泛關(guān)注[10,16-18]。FHIT 蛋白表達缺失或減弱可能是hMSH2 錯配修復功能的喪失，導致FHIT 基因異常轉(zhuǎn)錄和翻譯造成的[9,17,19]。Bekar 等[20]在環(huán)境致癌因素密切相關(guān)的腫瘤中發(fā)現(xiàn)FHIT 蛋白表達失活或減弱。哈薩克族食管鱗癌的發(fā)病與環(huán)境因素相關(guān)，同時有明顯的家族聚集現(xiàn)象[21-23]。

本研究中食管鱗癌組織hMSH2 和FHIT 基因的mRNA 的表達水平低于癌旁正常組織，hMSH2 和FHIT蛋白在食管鱗癌旁正常組織及癌組織中陽性表達率分別為91.7%、60.5%和91.7%、55.8%，陽性表達率均呈下降趨勢，可見在食管鱗癌的發(fā)生中這兩種基因表達缺失起到了一定的作用[24]。既往研究中[15,25]，hMSH2表達缺失與食管鱗癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度和分化程度等評估惡性程度的因素相關(guān)。本研究中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度越低、病理分期越晚的病例hMSH2表達缺失率顯著升高。而FHIT 蛋白表達缺失與浸潤深度有關(guān)。本研究提示hMSH2、FHIT 表達缺失與哈薩克族食管鱗癌侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。進一步通過hMSH2 和FHIT 的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)二者的表達呈正相關(guān)，提示兩種基因表現(xiàn)為一致表達，與趙阿紅等[19]和Sarli 等[26]的觀點一致，進一步顯示了hMSH2 基因表達異常引起了FHIT 基因異常表達，從而影響FHIT 基因的抑癌基因的功能。同時hMSH2、FHIT 相關(guān)蛋白的表達缺失促進了食管鱗癌的侵襲性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，從而影響腫瘤進展。此外，發(fā)現(xiàn)hMSH2 表達缺失的患者生存期明顯低于陽性表達的患者，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），提示hMSH2 可能是預測食管鱗癌患者預后的一個潛在指標，F(xiàn)HIT 的表達也有相似的趨勢。hMSH2、FHIT表達缺失的患者的臨床轉(zhuǎn)歸最差，這與Chen 等[10]以及Su 等[15]的結(jié)果一致。

綜上所述，哈薩克族食管鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中hMSH2、FHIT 基因表達的持續(xù)減少或丟失可能是其發(fā)病的重要機制，故聯(lián)合表達的檢測可作為預測預后重要指標。今后將增加病例對hMSH2、FHIT 基因的深入研究，將為食管鱗癌的診斷和治療提供新的視角。