丹尼爾·多里坤 卡吾力·居買 張海平 買地尼也提·尼亞孜 伊地力斯·阿吾提2,

1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院，新疆烏魯木齊 830054；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院小兒外一科，新疆烏魯木齊 830054；3.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科，新疆烏魯木齊 830054

食管癌是全球常見的惡性腫瘤之一[1]，而我國是全球食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國家，病理類型以鱗癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）為主[2-3]。新疆位于“亞洲食管癌高發(fā)帶”上，其發(fā)病表現(xiàn)出明顯的地區(qū)差異和民族差異[4-6]，以哈薩克族人群發(fā)病率最高（155.9/10 萬）。DNA錯配修復(fù)（mismatch repair，MMR）系統(tǒng)有關(guān)的hMSH2 基因和脆性組氨酸三聯(lián)體（fragile histldine triad，F(xiàn)HIT）基因的表達(dá)異常在散發(fā)性大腸癌和肺癌等腫瘤發(fā)病機(jī)制中的研究較多[7-9]。近年來研究發(fā)現(xiàn)hMSH2 和FHIT 蛋白表達(dá)缺失是食管癌發(fā)生、發(fā)展中的常見基因事件[10-13]，但是未見哈薩克族食管鱗癌中hMSH2 和FHIT 表達(dá)相關(guān)性的研究報道。本研究對哈薩克族食管鱗癌hMSH2 和FHIT 表達(dá)進(jìn)行分析，以探討其在食管癌發(fā)生發(fā)展中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013 年5 月—2017 年5 月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）行食管癌根治術(shù)的43 例哈薩克族食管鱗癌患者，其中男33 例，女10 例；年齡45～77 歲，平均（61.80±8.87）歲；低分化13 例、中分化25 例、高分化5 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27 例。根據(jù)AJCC 癌癥分期手冊第8 版進(jìn)行術(shù)后病理學(xué)分期[14]，Ⅰ～Ⅱ期23 例，Ⅲ期20 例。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過，并獲得患者知情同意。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前術(shù)后病理均為鱗癌；②切緣病理檢查示陰性；③有明確的病理分期；④完整的隨訪記錄。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前接受放療、化療、其他特殊治療；②同時患有其他部位惡性腫瘤。

1.2 定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）

將手術(shù)切取凍存的食管鱗癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織制備成懸液，并裂解提取總RNA。按試劑盒要求的條件獲得cDNA，所得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于PCR 擴(kuò)增（圖1）。PCR 反應(yīng)條件：95℃1 min 預(yù)變性，95℃變性15 s，57℃退火15 s，72℃延伸45 s，共40 個循環(huán)，65℃延伸7 min。hMSH2 基因引物序列為：5’-CACTGTCTGCGGTAATCAAGT-3’（上游）；5’-CTCTGACTGCTGCAATATC CAAT-3’（下游）。FHIT 基因引物序列為：5’-ATCTCATCAAGCCCTCTGTAGT-3’（上游）；5’-GGACGCAGGTCATGGAAGC-3’（下游）。β-肌動蛋白（β-Actin）內(nèi)參照引物序列為：5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’（上 游）；5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’（下游）。PCR 反應(yīng)體系由以下試劑或溶液組成：SYBR mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL 和蒸餾水7 μL。

圖1 hMSH2 和FHIT 基因PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測

采用免疫組織化學(xué)Envision 法檢測癌與癌旁組織中hMSH2 和FHIT 蛋白的表達(dá)情況。標(biāo)本經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化、抗原修復(fù)，滴加一抗（均為1∶200），于4℃冰箱過夜。次日加二抗，DAB 顯色。PBS 代替一抗作陰性對照。hMSH2 以細(xì)胞核出現(xiàn)棕色顆粒為陽性表達(dá)，F(xiàn)HIT 以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒為陽性表達(dá)。參照有關(guān)文獻(xiàn)[11]制訂陽性標(biāo)準(zhǔn)：每張切片高倍鏡下隨機(jī)選取5 個視野，計數(shù)100 個細(xì)胞，按照陽性百分比進(jìn)行結(jié)果判定。hMSH2 表達(dá)分為表達(dá)陽性和表達(dá)缺失，腫瘤細(xì)胞中＜30%的細(xì)胞核或完全沒有染色的分為表達(dá)缺失。根據(jù)細(xì)胞質(zhì)染色的強(qiáng)度，F(xiàn)HIT 表達(dá)分級為表達(dá)陽性和表達(dá)缺失。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 24.0 對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料采用例數(shù)和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier 單因素法和COX 多因素回歸進(jìn)行生存分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌及其癌旁正常組織中hMSH2 和FHIT基因mRNA 的表達(dá)水平

RT-q PCR 檢測hMSH2 和FHIT 基因mRNA 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示食管鱗癌組織中hMSH2 和FHIT兩個基因的mRNA 的表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 食管鱗癌和癌旁正常組織中hMSH2和FHIT 的mRNA 表達(dá)水平（n=30，）

表1 食管鱗癌和癌旁正常組織中hMSH2和FHIT 的mRNA 表達(dá)水平（n=30，）

注：FHIT：脆性組氨酸三聯(lián)體

2.2 食管鱗癌及其癌旁正常組織中hMSH2 和FHIT蛋白的表達(dá)情況

hMSH2 蛋白陽性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞核（部分細(xì)胞質(zhì)亦有表達(dá)），F(xiàn)HIT 蛋白陽性產(chǎn)物位于細(xì)胞質(zhì)（圖2，見封三）。hMSH2 蛋白在食管鱗癌及其癌旁正常組織中陽性表達(dá)率分別為60.5%（26/43）和91.7%（22/24），與癌旁正常組織比較，食管鱗癌組織中hMSH2 表達(dá)缺失，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。FHIT蛋白在食管鱗癌及其癌旁正常組織中陽性表達(dá)率分別為55.8%（24/43）和91.7%（22/24），與癌旁正常組織比較鱗癌組織中FHIT 表達(dá)缺失，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。

2.3 食管鱗癌患者中hMSH2 和FHIT 的蛋白表達(dá)水平與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

hMSH2 蛋白表達(dá)缺失與分化程度（P=0.020），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.028）及術(shù)后病理分期（P=0.014）有關(guān)。FHIT 蛋白表達(dá)缺失與浸潤深度有關(guān)（P=0.031）。hMSH2 和FHIT 蛋白表達(dá)缺失與食管鱗癌患者的性別無關(guān)（P ＞0.05）。見表2。24 例FHIT 表達(dá)陽性的食管鱗癌標(biāo)本中hMSH2 表達(dá)陽性19 例，陰性5 例，陽性率為79.1%（19/24）；在19 例FHIT 表達(dá)陰性的食管鱗癌標(biāo)本中hMSH2 表達(dá)陰性7 例，陰性率為36.8%（7/19）。43 例患者中，hMSH2、FHIT 表達(dá)相一致的共19 例，占44.1%（19/43），統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)hMSH2 表達(dá)與FHIT 表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.453，P=0.03）。

表2 hMSH2 與FHIT 的表達(dá)與哈薩克族食管鱗癌患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

2.4 食管鱗癌患者中hMSH2 和FHIT 的蛋白表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系

生存分析結(jié)果提示，在食管鱗癌組織中hMSH2 基因表達(dá)陽性的患者生存率高于基因表達(dá)缺失的患者，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001）。而FHIT 基因表達(dá)陽性和表達(dá)缺失組患者生存率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.098）。見圖3。

圖3 hMSH2 和FHIT 基因生存曲線

2.5 哈薩克族食管鱗癌患者的COX 生存分析

單因素生存分析結(jié)果顯示hMSH2 基因表達(dá)缺失、術(shù)后病理分期及N 分期等因素與患者預(yù)后相關(guān)（P ＜0.01）；將hMSH2 基因表達(dá)缺失、術(shù)后病理分期及N 分期納入多因素分析結(jié)果顯示，hMSH2 基因表達(dá)缺失及腫瘤分化程度高是哈薩克族食管鱗癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險因素。見表3。

表3 哈薩克族食管鱗癌患者的COX 生存分析

3 討論

復(fù)制后錯配修復(fù)基因hMSH2 的表達(dá)缺失，是食管鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要分子事件，hMSH2 的表達(dá)缺失導(dǎo)致其錯配修復(fù)功能的缺陷[12,15]。FHIT 作為一種腫瘤抑制基因，自發(fā)現(xiàn)以來就引起了廣泛關(guān)注[10,16-18]。FHIT 蛋白表達(dá)缺失或減弱可能是hMSH2 錯配修復(fù)功能的喪失，導(dǎo)致FHIT 基因異常轉(zhuǎn)錄和翻譯造成的[9,17,19]。Bekar 等[20]在環(huán)境致癌因素密切相關(guān)的腫瘤中發(fā)現(xiàn)FHIT 蛋白表達(dá)失活或減弱。哈薩克族食管鱗癌的發(fā)病與環(huán)境因素相關(guān)，同時有明顯的家族聚集現(xiàn)象[21-23]。

本研究中食管鱗癌組織hMSH2 和FHIT 基因的mRNA 的表達(dá)水平低于癌旁正常組織，hMSH2 和FHIT蛋白在食管鱗癌旁正常組織及癌組織中陽性表達(dá)率分別為91.7%、60.5%和91.7%、55.8%，陽性表達(dá)率均呈下降趨勢，可見在食管鱗癌的發(fā)生中這兩種基因表達(dá)缺失起到了一定的作用[24]。既往研究中[15,25]，hMSH2表達(dá)缺失與食管鱗癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度和分化程度等評估惡性程度的因素相關(guān)。本研究中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度越低、病理分期越晚的病例hMSH2表達(dá)缺失率顯著升高。而FHIT 蛋白表達(dá)缺失與浸潤深度有關(guān)。本研究提示hMSH2、FHIT 表達(dá)缺失與哈薩克族食管鱗癌侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。進(jìn)一步通過hMSH2 和FHIT 的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)二者的表達(dá)呈正相關(guān)，提示兩種基因表現(xiàn)為一致表達(dá)，與趙阿紅等[19]和Sarli 等[26]的觀點一致，進(jìn)一步顯示了hMSH2 基因表達(dá)異常引起了FHIT 基因異常表達(dá)，從而影響FHIT 基因的抑癌基因的功能。同時hMSH2、FHIT 相關(guān)蛋白的表達(dá)缺失促進(jìn)了食管鱗癌的侵襲性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，從而影響腫瘤進(jìn)展。此外，發(fā)現(xiàn)hMSH2 表達(dá)缺失的患者生存期明顯低于陽性表達(dá)的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），提示hMSH2 可能是預(yù)測食管鱗癌患者預(yù)后的一個潛在指標(biāo)，F(xiàn)HIT 的表達(dá)也有相似的趨勢。hMSH2、FHIT表達(dá)缺失的患者的臨床轉(zhuǎn)歸最差，這與Chen 等[10]以及Su 等[15]的結(jié)果一致。

綜上所述，哈薩克族食管鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中hMSH2、FHIT 基因表達(dá)的持續(xù)減少或丟失可能是其發(fā)病的重要機(jī)制，故聯(lián)合表達(dá)的檢測可作為預(yù)測預(yù)后重要指標(biāo)。今后將增加病例對hMSH2、FHIT 基因的深入研究，將為食管鱗癌的診斷和治療提供新的視角。