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        哈薩克族食管鱗癌中hMSH2 及FHIT 表達(dá)的臨床病理學(xué)意義

        2021-06-27 13:49:30丹尼爾多里坤卡吾力居買張海平買地尼也提尼亞孜伊地力斯阿吾提2
        中國醫(yī)藥導(dǎo)報 2021年14期
        關(guān)鍵詞:哈薩克族鱗癌食管癌

        丹尼爾·多里坤 卡吾力·居買 張海平 買地尼也提·尼亞孜 伊地力斯·阿吾提2,

        1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院,新疆烏魯木齊 830054;2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院小兒外一科,新疆烏魯木齊 830054;3.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科,新疆烏魯木齊 830054

        食管癌是全球常見的惡性腫瘤之一[1],而我國是全球食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國家,病理類型以鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)為主[2-3]。新疆位于“亞洲食管癌高發(fā)帶”上,其發(fā)病表現(xiàn)出明顯的地區(qū)差異和民族差異[4-6],以哈薩克族人群發(fā)病率最高(155.9/10 萬)。DNA錯配修復(fù)(mismatch repair,MMR)系統(tǒng)有關(guān)的hMSH2 基因和脆性組氨酸三聯(lián)體(fragile histldine triad,F(xiàn)HIT)基因的表達(dá)異常在散發(fā)性大腸癌和肺癌等腫瘤發(fā)病機(jī)制中的研究較多[7-9]。近年來研究發(fā)現(xiàn)hMSH2 和FHIT 蛋白表達(dá)缺失是食管癌發(fā)生、發(fā)展中的常見基因事件[10-13],但是未見哈薩克族食管鱗癌中hMSH2 和FHIT 表達(dá)相關(guān)性的研究報道。本研究對哈薩克族食管鱗癌hMSH2 和FHIT 表達(dá)進(jìn)行分析,以探討其在食管癌發(fā)生發(fā)展中的意義。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料

        選取2013 年5 月—2017 年5 月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院(以下簡稱“我院”)行食管癌根治術(shù)的43 例哈薩克族食管鱗癌患者,其中男33 例,女10 例;年齡45~77 歲,平均(61.80±8.87)歲;低分化13 例、中分化25 例、高分化5 例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16 例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27 例。根據(jù)AJCC 癌癥分期手冊第8 版進(jìn)行術(shù)后病理學(xué)分期[14],Ⅰ~Ⅱ期23 例,Ⅲ期20 例。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過,并獲得患者知情同意。納入標(biāo)準(zhǔn):①術(shù)前術(shù)后病理均為鱗癌;②切緣病理檢查示陰性;③有明確的病理分期;④完整的隨訪記錄。排除標(biāo)準(zhǔn):①術(shù)前接受放療、化療、其他特殊治療;②同時患有其他部位惡性腫瘤。

        1.2 定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)

        將手術(shù)切取凍存的食管鱗癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織制備成懸液,并裂解提取總RNA。按試劑盒要求的條件獲得cDNA,所得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于PCR 擴(kuò)增(圖1)。PCR 反應(yīng)條件:95℃1 min 預(yù)變性,95℃變性15 s,57℃退火15 s,72℃延伸45 s,共40 個循環(huán),65℃延伸7 min。hMSH2 基因引物序列為:5’-CACTGTCTGCGGTAATCAAGT-3’(上游);5’-CTCTGACTGCTGCAATATC CAAT-3’(下游)。FHIT 基因引物序列為:5’-ATCTCATCAAGCCCTCTGTAGT-3’(上游);5’-GGACGCAGGTCATGGAAGC-3’(下游)。β-肌動蛋白(β-Actin)內(nèi)參照引物序列為:5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’(上 游);5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’(下游)。PCR 反應(yīng)體系由以下試劑或溶液組成:SYBR mix 10 μL,上、下游引物各0.5 μL,cDNA 2 μL 和蒸餾水7 μL。

        圖1 hMSH2 和FHIT 基因PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果

        1.3 免疫組織化學(xué)法檢測

        采用免疫組織化學(xué)Envision 法檢測癌與癌旁組織中hMSH2 和FHIT 蛋白的表達(dá)情況。標(biāo)本經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化、抗原修復(fù),滴加一抗(均為1∶200),于4℃冰箱過夜。次日加二抗,DAB 顯色。PBS 代替一抗作陰性對照。hMSH2 以細(xì)胞核出現(xiàn)棕色顆粒為陽性表達(dá),F(xiàn)HIT 以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒為陽性表達(dá)。參照有關(guān)文獻(xiàn)[11]制訂陽性標(biāo)準(zhǔn):每張切片高倍鏡下隨機(jī)選取5 個視野,計數(shù)100 個細(xì)胞,按照陽性百分比進(jìn)行結(jié)果判定。hMSH2 表達(dá)分為表達(dá)陽性和表達(dá)缺失,腫瘤細(xì)胞中<30%的細(xì)胞核或完全沒有染色的分為表達(dá)缺失。根據(jù)細(xì)胞質(zhì)染色的強(qiáng)度,F(xiàn)HIT 表達(dá)分級為表達(dá)陽性和表達(dá)缺失。

        1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

        采用SPSS 24.0 對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料采用例數(shù)和百分率表示,組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier 單因素法和COX 多因素回歸進(jìn)行生存分析。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 食管鱗癌及其癌旁正常組織中hMSH2 和FHIT基因mRNA 的表達(dá)水平

        RT-q PCR 檢測hMSH2 和FHIT 基因mRNA 的表達(dá)水平,結(jié)果顯示食管鱗癌組織中hMSH2 和FHIT兩個基因的mRNA 的表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05)。見表1。

        表1 食管鱗癌和癌旁正常組織中hMSH2和FHIT 的mRNA 表達(dá)水平(n=30,)

        表1 食管鱗癌和癌旁正常組織中hMSH2和FHIT 的mRNA 表達(dá)水平(n=30,)

        注:FHIT:脆性組氨酸三聯(lián)體

        2.2 食管鱗癌及其癌旁正常組織中hMSH2 和FHIT蛋白的表達(dá)情況

        hMSH2 蛋白陽性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞核(部分細(xì)胞質(zhì)亦有表達(dá)),F(xiàn)HIT 蛋白陽性產(chǎn)物位于細(xì)胞質(zhì)(圖2,見封三)。hMSH2 蛋白在食管鱗癌及其癌旁正常組織中陽性表達(dá)率分別為60.5%(26/43)和91.7%(22/24),與癌旁正常組織比較,食管鱗癌組織中hMSH2 表達(dá)缺失,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05)。FHIT蛋白在食管鱗癌及其癌旁正常組織中陽性表達(dá)率分別為55.8%(24/43)和91.7%(22/24),與癌旁正常組織比較鱗癌組織中FHIT 表達(dá)缺失,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05)。

        2.3 食管鱗癌患者中hMSH2 和FHIT 的蛋白表達(dá)水平與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

        hMSH2 蛋白表達(dá)缺失與分化程度(P=0.020),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.028)及術(shù)后病理分期(P=0.014)有關(guān)。FHIT 蛋白表達(dá)缺失與浸潤深度有關(guān)(P=0.031)。hMSH2 和FHIT 蛋白表達(dá)缺失與食管鱗癌患者的性別無關(guān)(P >0.05)。見表2。24 例FHIT 表達(dá)陽性的食管鱗癌標(biāo)本中hMSH2 表達(dá)陽性19 例,陰性5 例,陽性率為79.1%(19/24);在19 例FHIT 表達(dá)陰性的食管鱗癌標(biāo)本中hMSH2 表達(dá)陰性7 例,陰性率為36.8%(7/19)。43 例患者中,hMSH2、FHIT 表達(dá)相一致的共19 例,占44.1%(19/43),統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)hMSH2 表達(dá)與FHIT 表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.453,P=0.03)。

        表2 hMSH2 與FHIT 的表達(dá)與哈薩克族食管鱗癌患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

        2.4 食管鱗癌患者中hMSH2 和FHIT 的蛋白表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系

        生存分析結(jié)果提示,在食管鱗癌組織中hMSH2 基因表達(dá)陽性的患者生存率高于基因表達(dá)缺失的患者,兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)。而FHIT 基因表達(dá)陽性和表達(dá)缺失組患者生存率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.098)。見圖3。

        圖3 hMSH2 和FHIT 基因生存曲線

        2.5 哈薩克族食管鱗癌患者的COX 生存分析

        單因素生存分析結(jié)果顯示hMSH2 基因表達(dá)缺失、術(shù)后病理分期及N 分期等因素與患者預(yù)后相關(guān)(P <0.01);將hMSH2 基因表達(dá)缺失、術(shù)后病理分期及N 分期納入多因素分析結(jié)果顯示,hMSH2 基因表達(dá)缺失及腫瘤分化程度高是哈薩克族食管鱗癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險因素。見表3。

        表3 哈薩克族食管鱗癌患者的COX 生存分析

        3 討論

        復(fù)制后錯配修復(fù)基因hMSH2 的表達(dá)缺失,是食管鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要分子事件,hMSH2 的表達(dá)缺失導(dǎo)致其錯配修復(fù)功能的缺陷[12,15]。FHIT 作為一種腫瘤抑制基因,自發(fā)現(xiàn)以來就引起了廣泛關(guān)注[10,16-18]。FHIT 蛋白表達(dá)缺失或減弱可能是hMSH2 錯配修復(fù)功能的喪失,導(dǎo)致FHIT 基因異常轉(zhuǎn)錄和翻譯造成的[9,17,19]。Bekar 等[20]在環(huán)境致癌因素密切相關(guān)的腫瘤中發(fā)現(xiàn)FHIT 蛋白表達(dá)失活或減弱。哈薩克族食管鱗癌的發(fā)病與環(huán)境因素相關(guān),同時有明顯的家族聚集現(xiàn)象[21-23]。

        本研究中食管鱗癌組織hMSH2 和FHIT 基因的mRNA 的表達(dá)水平低于癌旁正常組織,hMSH2 和FHIT蛋白在食管鱗癌旁正常組織及癌組織中陽性表達(dá)率分別為91.7%、60.5%和91.7%、55.8%,陽性表達(dá)率均呈下降趨勢,可見在食管鱗癌的發(fā)生中這兩種基因表達(dá)缺失起到了一定的作用[24]。既往研究中[15,25],hMSH2表達(dá)缺失與食管鱗癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度和分化程度等評估惡性程度的因素相關(guān)。本研究中,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度越低、病理分期越晚的病例hMSH2表達(dá)缺失率顯著升高。而FHIT 蛋白表達(dá)缺失與浸潤深度有關(guān)。本研究提示hMSH2、FHIT 表達(dá)缺失與哈薩克族食管鱗癌侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。進(jìn)一步通過hMSH2 和FHIT 的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)二者的表達(dá)呈正相關(guān),提示兩種基因表現(xiàn)為一致表達(dá),與趙阿紅等[19]和Sarli 等[26]的觀點一致,進(jìn)一步顯示了hMSH2 基因表達(dá)異常引起了FHIT 基因異常表達(dá),從而影響FHIT 基因的抑癌基因的功能。同時hMSH2、FHIT 相關(guān)蛋白的表達(dá)缺失促進(jìn)了食管鱗癌的侵襲性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,從而影響腫瘤進(jìn)展。此外,發(fā)現(xiàn)hMSH2 表達(dá)缺失的患者生存期明顯低于陽性表達(dá)的患者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05),提示hMSH2 可能是預(yù)測食管鱗癌患者預(yù)后的一個潛在指標(biāo),F(xiàn)HIT 的表達(dá)也有相似的趨勢。hMSH2、FHIT表達(dá)缺失的患者的臨床轉(zhuǎn)歸最差,這與Chen 等[10]以及Su 等[15]的結(jié)果一致。

        綜上所述,哈薩克族食管鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中hMSH2、FHIT 基因表達(dá)的持續(xù)減少或丟失可能是其發(fā)病的重要機(jī)制,故聯(lián)合表達(dá)的檢測可作為預(yù)測預(yù)后重要指標(biāo)。今后將增加病例對hMSH2、FHIT 基因的深入研究,將為食管鱗癌的診斷和治療提供新的視角。

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