呂翠婷 胡 益 沈 毅▲

1.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江寧波 315211；2.寧波大學(xué)附屬李惠利醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，浙江寧波 315040

鼓膜穿孔在耳鼻咽喉科時(shí)有發(fā)生，急性、小的穿孔多能在1周～1個(gè)月內(nèi)自發(fā)愈合，但慢性鼓膜穿孔或面積較大的穿孔往往需要外科手術(shù)來(lái)修復(fù)[1]。修復(fù)穿孔鼓膜主要存在三個(gè)問(wèn)題：①缺乏支架結(jié)構(gòu)；②新生血管生成能力弱和生長(zhǎng)因子分泌不足；③細(xì)胞外基質(zhì)的缺乏導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)新膜黏附力弱[2]。目前治療穿孔的方式主要是鼓膜成形術(shù)和鼓室成形術(shù)。盡管有各種修補(bǔ)材料可供手術(shù)醫(yī)生選擇，例如耳軟骨、顳肌筋膜、耳小葉脂肪、耳屏軟骨膜等自體材料和透明質(zhì)酸、膠原蛋白、絲素蛋白、殼聚糖等人工材料，但這些傳統(tǒng)移植材料往往只提供機(jī)械支撐作用，缺乏促血管生成或細(xì)胞增殖作用，因此術(shù)后新生鼓膜無(wú)法復(fù)制天然鼓膜的顯微解剖學(xué)和振動(dòng)聲學(xué)特性[3]。隨著組織工程學(xué)和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）這一新型輔助材料的應(yīng)用，在鼓膜穿孔治療中顯示出了巨大潛能。

1 MSCs應(yīng)用的理論依據(jù)

干細(xì)胞是機(jī)體未分化的前體細(xì)胞，是體內(nèi)每個(gè)器官和組織形成的基石。根據(jù)干細(xì)胞的發(fā)育階段，干細(xì)胞主要分為兩類：①胚胎干細(xì)胞即全能干細(xì)胞；②成體干細(xì)胞。MSCs是一種多能成體干細(xì)胞，廣泛存在于各種器官和組織中，具有高度增殖、自我更新和多向分化的潛能。1970年，F(xiàn)riedenstein等[4]首次定義MSCs是成纖維細(xì)胞集落形成細(xì)胞（CFU-F），它們是靜止細(xì)胞，但在適當(dāng)刺激下可以增殖分化為各種類型的細(xì)胞，如軟骨、骨、肌肉細(xì)胞、肌腱韌帶、成纖維細(xì)胞[5]。

創(chuàng)面愈合要經(jīng)歷炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和組織重塑等不同階段。創(chuàng)面修復(fù)早期，單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞趨化，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)。炎癥刺激條件下，MSCs可通過(guò)分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）等多種蛋白因子，防止細(xì)胞免疫或體液免疫中淋巴細(xì)胞的過(guò)度活化，并在創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中產(chǎn)生耐受環(huán)境[6]。因此MSCs可以通過(guò)免疫調(diào)節(jié)作用調(diào)控炎癥反應(yīng)，降低過(guò)度炎癥反應(yīng)造成的組織損傷[7]。MSCs分泌的各種細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、HGF、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、堿性成纖維生長(zhǎng)因子（bFGF）、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）、TGF-β和血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）等，能夠促進(jìn)細(xì)胞存活、細(xì)胞增殖遷移和血管生成，從而加速損傷組織修復(fù)（表1）。1995年，Lazarus等[8]率先將MSCs作為細(xì)胞藥物在人類受試者身上進(jìn)行了測(cè)試。MSCs來(lái)源廣泛，較易從不同的組織中采集，如脂肪組織、臍帶血、骨髓和外周血等[9-10]，目前在心血管、骨關(guān)節(jié)、自身免疫等多種疾病的治療中均取得良好應(yīng)用效果[11]。

表1 MSCs分泌的主要生長(zhǎng)因子及其功能

2 MSCs在鼓膜再生中的應(yīng)用

鼓膜的解剖結(jié)構(gòu)由內(nèi)到外分三層：內(nèi)黏膜層、含成纖維細(xì)胞和膠原的中間纖維層或固有層、角質(zhì)化鱗狀上皮外層[2]。鼓膜功能依賴于其特定的結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)改變可能會(huì)導(dǎo)致聽(tīng)力受損。鼓膜損傷后，穿孔邊緣淋巴、間質(zhì)液體和血液等滲出并形成液體層，防止鼓膜組織脫水，并幫助細(xì)胞遷移。幾天內(nèi)，復(fù)層鱗狀上皮層增殖，產(chǎn)生的角蛋白向穿孔中心遷移，最終修復(fù)穿孔鼓膜。鼓膜的上皮層類似于皮膚的表皮層，但與其他組織不同，由于鼓膜上皮層的生長(zhǎng)速度超過(guò)纖維層，上皮層越過(guò)纖維層與黏膜層相連，因而在鼓膜穿孔自愈過(guò)程中，鼓膜纖維層的愈合往往是不完全的、甚至是缺失的[12]，因此尋求一種新型輔助材料促進(jìn)鼓膜完整再生就至關(guān)重要。

2008年，Rahman等[13]使用Sprague-Dawley大鼠進(jìn)行了一項(xiàng)關(guān)于MSCs誘導(dǎo)鼓膜穿孔愈合效應(yīng)的研究，并評(píng)估了新生鼓膜的結(jié)構(gòu)。該研究采用激光切開(kāi)鼓膜建立急性和慢性大鼠鼓膜穿孔模型，實(shí)驗(yàn)組穿孔鼓膜局部注射MSCs懸液，對(duì)照組滴入不含MSCs的生理鹽水。急性鼓膜穿孔2周后完全閉合。在慢性鼓膜穿孔模型中，經(jīng)MSCs處理的大鼠穿孔閉合率（40%）高于對(duì)照組（10%）。同時(shí)用透射電鏡觀察愈合的鼓膜，證實(shí)了鼓膜中存在三層結(jié)構(gòu)。研究還證實(shí)，在體外常壓和負(fù)壓下，新生鼓膜的聲學(xué)振動(dòng)特性在一定程度上與人鼓膜非常接近，可提供振動(dòng)特性和高效聲透射的重要聲學(xué)要求。

MSCs介導(dǎo)的鼓膜穿孔愈合的明確機(jī)制及其調(diào)節(jié)方式目前仍不清楚，研究人員仍在調(diào)查中。有研究表明，人類鼓膜祖細(xì)胞位于鼓膜臍部、鼓環(huán)和錘骨柄處，這些部位可能是鼓膜創(chuàng)傷愈合過(guò)程中干細(xì)胞再生活躍的部位[14]。當(dāng)動(dòng)物注射MSCs時(shí)，細(xì)胞沉積在損傷區(qū)域，缺氧環(huán)境、Toll樣受體配體和細(xì)胞因子等局部因素功能性地激活MSCs。這些刺激可以促進(jìn)MSCs分泌豐富的生長(zhǎng)因子，從而促進(jìn)鼓膜中角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖并遷移覆蓋穿孔鼓膜[15]。然而，有時(shí)在鼓膜穿孔區(qū)域直接輸送MSCs時(shí)，細(xì)胞可能會(huì)掉入中耳腔，或通過(guò)外耳道風(fēng)干。此外，骨髓基質(zhì)不同于體內(nèi)基質(zhì)，移植的骨髓MSCs需要適當(dāng)?shù)奈h(huán)境來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的存活和增殖，否則，單獨(dú)使用它們往往不能確保治療有效性[16]。

3 MSCs聯(lián)合支架材料在鼓膜再生中的應(yīng)用

骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow derived mesenchymal stem cell，BM-MSCs）具有多潛能、旁分泌和自分泌功能[17]，易于獲得，在體外特定培養(yǎng)基下還可分化為多種細(xì)胞類型，同時(shí)較少引發(fā)倫理學(xué)關(guān)注，因此在細(xì)胞治療、再生醫(yī)學(xué)和組織修復(fù)方面展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景。迄今為止，大量的動(dòng)物研究表明，BM-MSCs有助于各種損傷組織的再生，如骨、軟骨、血管、心肌和神經(jīng)組織。有研究表明，單獨(dú)使用BMMSCs并不能提供令人滿意的效果，但當(dāng)BM-MSCs與支架材料結(jié)合時(shí)，在治療鼓膜穿孔方面顯示出更好的療效[18]。

在組織工程中，支架材料被用作支撐結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞的增殖、遷移和分化提供機(jī)械幫助。在鼓膜組織工程中，支架還可作為運(yùn)送細(xì)胞的載體，MSCs可以在選定的支架上適當(dāng)擴(kuò)增和分化?；谌犴g性、生物相容性、可降解性、無(wú)毒性等特性，許多支架材料如絲素蛋白、明膠海綿、殼聚糖、透明質(zhì)酸衍生物和海藻酸鹽等已經(jīng)用于鼓膜修補(bǔ)[19]。

透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，也是目前輸送MSCs的最佳可降解生物支架材料之一。Goncalves等[20]的研究證明了植入BMMSCs的HA支架治療鼓膜穿孔的有效性。在此項(xiàng)研究中，實(shí)驗(yàn)組小鼠鼓膜穿孔模型使用嵌入同種異體BM-MSCs的HA支架治療，對(duì)照組未做干預(yù)。穿孔后1周，組織學(xué)結(jié)果顯示對(duì)照組新生鼓膜上皮層和粘膜層雖清晰可見(jiàn)，但在某些區(qū)域卻出現(xiàn)中斷，而實(shí)驗(yàn)組除可見(jiàn)明顯上皮層和粘膜層完整覆蓋新生鼓膜外，還可見(jiàn)富含細(xì)胞外基質(zhì)的中間纖維層。穿孔后2周，實(shí)驗(yàn)組中間纖維層更趨近正常鼓膜，且纖維排列緊密。在此項(xiàng)研究中，MSCs通過(guò)分泌營(yíng)養(yǎng)因子和旁分泌因子，激活干細(xì)胞標(biāo)志物從而刺激穿孔邊緣的上皮細(xì)胞遷移和增殖，并分化為新鼓膜。HA支架為鼓膜的上皮層增殖提供了所需的結(jié)構(gòu)支持，可以暫時(shí)幫助細(xì)胞再生，并在愈合過(guò)程中或愈合后緩慢地降解。

4 MSCs聯(lián)合生物打印技術(shù)在鼓膜再生中的應(yīng)用

生物打印技術(shù)（bioprinting）誕生于20世紀(jì)70年代，是一種能夠在數(shù)字三維模型輔助下，根據(jù)增材制造原理定位裝配生物材料或細(xì)胞單元，從而制備組織工程支架和組織器官等制品的一種新興技術(shù)[21]。3D生物打印技術(shù)可以將細(xì)胞精確定值在生物支架上，控制細(xì)胞微觀排列分布，調(diào)節(jié)組織工程支架的大小和形狀，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞與材料的相互作用。20世紀(jì)90年代首次被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，目前已被廣泛用于組織工程、再生醫(yī)學(xué)以及器官組織重建[22]。

Jang等[23]的一項(xiàng)研究探討了含有MSCs的聚己內(nèi)酯/膠原/海藻酸鈉（PCAMSC）三維生物打印支架用于封閉亞急性鼓膜穿孔動(dòng)物模型的可行性。該研究使用雄性Sprague-Dawley大鼠建立亞急性鼓膜穿孔模型。實(shí)驗(yàn)組用PCAMSC支架覆蓋穿孔，對(duì)照組用不含MSCs的PCA覆蓋穿孔。耳內(nèi)窺鏡觀察，實(shí)驗(yàn)組鼓膜在3周內(nèi)完全閉合（100%），而對(duì)照組閉合率僅70%，且兩組閉合率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。根據(jù)聽(tīng)性腦干反應(yīng)（ABR）閾值評(píng)估，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組在所有頻率的ABR閾值均恢復(fù)到正常水平。光學(xué)相干斷層掃描（OCT）及光學(xué)顯微鏡顯示，PCAMSC治療組再生鼓膜纖維層和黏膜層增厚，而對(duì)照組鼓膜厚度小于實(shí)驗(yàn)組。該研究表明，與單獨(dú)使用PAC支架比較，負(fù)載干細(xì)胞的PCAMSC支架可以顯著提高亞急性鼓膜穿孔的再生能力，并能成功恢復(fù)鼓膜聲學(xué)-力學(xué)特性。基于這一結(jié)果，筆者認(rèn)為，PCAMSC生物打印支架可能成為亞急性或慢性鼓膜穿孔的一種新的治療方法。如今，隨著3D生物打印技術(shù)的進(jìn)步，MSCs與支架材料結(jié)合可以確保其有效地運(yùn)送到鼓膜損傷部位，并通過(guò)促進(jìn)損傷部位的細(xì)胞增殖和分化來(lái)提高穿孔閉合率。3D生物打印技術(shù)在組織工程、再生醫(yī)學(xué)和藥物開(kāi)發(fā)等方面具有巨大的潛力。然而，面對(duì)更加復(fù)雜的組織重建，目前的打印技術(shù)仍不夠先進(jìn)，細(xì)胞大小無(wú)法打印、軟組織材料打印也存在困難，應(yīng)用多種干細(xì)胞和多種材料的復(fù)雜生物打印也還未實(shí)現(xiàn)。如果應(yīng)用于臨床，打印速度也有待提高[24]。

5 MSCs應(yīng)用存在的問(wèn)題

大量的研究已經(jīng)證實(shí)MSCs對(duì)損傷修復(fù)的確切療效。然而，MSCs的應(yīng)用還存在一些問(wèn)題。首先，干細(xì)胞的分離培養(yǎng)需要規(guī)范化。人體的很多組織器官本身存在干細(xì)胞，為干細(xì)胞的提取和應(yīng)用提供了廣泛的來(lái)源，但問(wèn)題在于如何有效獲得足夠的干細(xì)胞。組織工程中干細(xì)胞培養(yǎng)通常采用二維或三維培養(yǎng)基。在二維培養(yǎng)中，貼壁生長(zhǎng)方式限制了干細(xì)胞增殖，并且無(wú)法獲得細(xì)胞快速增殖及分化所需的一系列條件，細(xì)胞培養(yǎng)效率有限。三維培養(yǎng)是使用生物材料構(gòu)建支架輔助細(xì)胞增殖，但是材料來(lái)源存在差異，在體外培養(yǎng)往往很難提供相同的培養(yǎng)條件[25]。同時(shí)，在體外擴(kuò)增的過(guò)程中，干細(xì)胞的特性可能會(huì)發(fā)生一定程度的改變，使其不再適合受損組織的修復(fù)。為了便于不同MSCs研究結(jié)果的比較，國(guó)際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)于2006年定義了人類MSCs的最低標(biāo)準(zhǔn)：①在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，MSCs必須具有塑料黏附性；②在給定的BM-MSCs群體中，95%以上的細(xì)胞表達(dá)CD105、CD73和CD90，而CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19和HLAⅡ類表面分子表達(dá)不足2%（陽(yáng)性表達(dá)小于2%）；③BM-MSCs在體外標(biāo)準(zhǔn)條件下必須分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞[26]。

另外，要保證干細(xì)胞治療的成功，首先要解決干細(xì)胞在移植后的存活及遷移問(wèn)題。組織損傷后，病變局部的微環(huán)境會(huì)發(fā)生變化，這將對(duì)移植后干細(xì)胞的存活和遷移造成影響。干細(xì)胞移植到應(yīng)激環(huán)境高的部位后，便開(kāi)始失去適應(yīng)應(yīng)激的能力，無(wú)法長(zhǎng)期存活和增殖。Khasawneh等[27]的一項(xiàng)研究表明低氧條件可能是影響干細(xì)胞存活的一個(gè)應(yīng)激條件。干細(xì)胞移植后在體內(nèi)存活率低將直接影響其療效并限制其應(yīng)用。因此，保證移植干細(xì)胞的歸巢、存活及正常遷移是治療有效的關(guān)鍵。從實(shí)驗(yàn)到臨床的每一步都需要謹(jǐn)慎評(píng)估不斷優(yōu)化，以提高干細(xì)胞治療的效益。

在MSCs移植廣泛應(yīng)用于臨床常規(guī)治療前，除了需要大量的基礎(chǔ)研究來(lái)探索其治療機(jī)制，還需要評(píng)估其長(zhǎng)期療效及安全性。有研究報(bào)道MSCs可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，Amariglio等[28]在2009年報(bào)道了1例末端血管擴(kuò)張癥的患者，在接受神經(jīng)干細(xì)胞移植4年后發(fā)現(xiàn)腦腫瘤，病理結(jié)果顯示腫瘤源于所移植的多種異源干細(xì)胞。MSCs可能通過(guò)以下方式誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生：①向腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變；②刺激上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化；③影響腫瘤微環(huán)境；④抑制腫瘤細(xì)胞凋亡；⑤促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[15，29]。鑒于MSCs與腫瘤之間復(fù)雜的相互作用，尚需更多研究揭示干細(xì)胞應(yīng)用的安全性。

6 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，MSCs是再生醫(yī)學(xué)中一種很有前途的細(xì)胞治療來(lái)源。目前MSCs很少用于鼓膜再生，但是有限的研究已經(jīng)證明了MSCs在治療鼓膜穿孔方面的有效性。MSCs作為治療鼓膜穿孔的一種新選擇，還需進(jìn)一步的臨床研究來(lái)測(cè)試其治療潛力。同時(shí)，為了達(dá)到穩(wěn)定的治療效果，干細(xì)胞制備和移植的規(guī)范化，包括移植干細(xì)胞的數(shù)量、給藥途徑、頻率、治療的最佳時(shí)間窗，都需要謹(jǐn)慎評(píng)估。