郝一楠 張靜靜 郭冰峰 王明華 王亞萍 王 斌

1.華蘭生物工程股份有限公司研發(fā)中心，河南新鄉(xiāng) 453003；2.華蘭生物工程股份有限公司血制研發(fā)部，河南新鄉(xiāng) 453003；3.華蘭基因工程有限公司質(zhì)量控制部，河南新鄉(xiāng) 453000

肺炎鏈球菌是一種能夠引起嚴(yán)重的腦膜炎、敗血癥、大葉性肺炎、支氣管炎、鼻竇炎和急性中耳炎等疾病的病原菌，在世界范圍內(nèi)引發(fā)很高的發(fā)病率和死亡率，可以感染兒童和成人，因此預(yù)防和控制肺炎球菌性疾病對人類的健康和生命安全至關(guān)重要[1-3]。莢膜多糖（CPS）是肺炎球菌重要的毒力因子，暴露于細(xì)菌表面，具有免疫原性，能夠誘發(fā)宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)，因此預(yù)防用肺炎鏈球菌疫苗的生產(chǎn)大多使用肺炎鏈球菌莢膜多糖[4-6]。為保證多糖疫苗生產(chǎn)批次的均一性和穩(wěn)定性，合適的菌種保存方法顯得至關(guān)重要。本研究選擇在國內(nèi)較為常見的肺炎鏈球菌血清型之一——4型進(jìn)行研究，通過比較凍干前和凍干后的菌種活性來考察不同保護(hù)劑對肺炎鏈球菌菌種存活率的影響，分析該保護(hù)劑下菌種的遺傳穩(wěn)定性以及生長特性，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗菌種

肺炎鏈球菌4型菌種來源于中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心（CMCC），編號為31446菌株；肺炎鏈球菌6A型來源于ATCC，編號為BAA- 659；肺炎鏈球菌18C型CMCC，編號為 31687；肺炎鏈球菌19F型CMCC，編號為31692。

1.2 主要試劑及儀器

胰蛋白大豆瓊脂、酵母粉、胰蛋白胨、蛋白胨、脫脂奶粉均購自美國BD公司；瓊脂粉購自北京奧博星公司；海藻糖、谷氨酸鈉均購自國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司；生物安全柜購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱購自力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；生物顯微鏡購自奧林巴斯公司；凍干機(jī)購自愛德華天利有限公司。

1.3 菌懸液制備

將菌株接種至5%羊血固體培養(yǎng)基，在二氧化碳培養(yǎng)箱中36.5℃、CO2濃度5%～10%條件下復(fù)蘇培養(yǎng)18～24 h后傳代擴(kuò)增，將鋪滿固體培養(yǎng)基表面的菌苔刮取至0.85%氯化鈉溶液中，混勻，即為菌懸液。

1.4 含不同凍干保護(hù)劑的菌懸液制備

根據(jù)文獻(xiàn)報道[7-10]，選擇菌種保藏常用的保護(hù)劑成分即A脫脂奶粉、B海藻糖、C谷氨酸鈉三種成分為3因素。調(diào)整3個水平不同濃度正交試驗，正交試驗因素水平見表1。

表1 保護(hù)劑因素水平表（%）

1.5 凍干工藝

將肺炎鏈球菌4型菌株在固體培養(yǎng)基傳代擴(kuò)增后菌苔刮至0.85%氯化鈉溶液中，制成菌懸液，取各類凍干保護(hù)劑各1.5 mL，加入0.5 mL菌懸液，混勻并分裝，每種凍干保護(hù)劑的菌懸液分裝0.2 mL后進(jìn)行凍干，過程如下。

①預(yù)凍：-20℃預(yù)凍3 h。②平衡：放置于凍干機(jī)中-36℃平衡3 h。③抽真空：0.130～0.180 mbar。④一次升溫：緩慢升溫至-20℃。⑤干燥：-20℃下保持10 h。⑥二次升溫：緩慢升溫至15℃。⑦解吸附干燥：15℃下解吸附干燥2 h。⑧制品出柜，真空封口。

1.6 菌種凍干前后活性檢測

將菌懸液與0.85%氯化鈉溶液按1∶3的比例混勻，制備成菌懸液，將菌懸液按10倍梯度稀釋法稀釋后涂板，經(jīng)24 h培養(yǎng)后，檢測菌落形成單位（CFU），即凍干前的菌種活性。將含不同凍干保護(hù)劑的各組凍干菌種開啟，按10倍梯度稀釋法稀釋后涂板，經(jīng)24 h培養(yǎng)后，檢測CFU計算凍干后的菌種活性。凍干存活率=凍干后的活菌含量/凍干前的活菌含量×100%。對含不同凍干保護(hù)劑的各類凍干菌種的凍干存活率進(jìn)行比較，獲得保護(hù)效果最佳的凍干保護(hù)劑配方。

1.7 菌種凍干前后遺傳穩(wěn)定性檢測

莢膜合成位點（cap locus）負(fù)責(zé)加膜多糖的合成，對該基因簇進(jìn)行測序分析能為今后肺炎多糖疫苗的生產(chǎn)提供確切的遺傳穩(wěn)定性參考依據(jù)。使用primer 5.0軟件設(shè)計能夠覆蓋肺炎鏈球菌4型cap locus全長的特異性引物，然后使用這些引物以凍干后菌種于0、90、180、360 d所取樣本為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分段擴(kuò)增出其cap locus的DNA片段，然后將這些擴(kuò)增片段進(jìn)行核苷酸序列測定，使用SeqMan將測序結(jié)果拼接，即可獲得相應(yīng)樣本的Cap locus核酸序列全長。使用MegAlign軟件對樣本Cap locus核酸序列進(jìn)行同源性分析，通過同源性比對分析來確認(rèn)樣本是否具有遺傳穩(wěn)定性。

1.8 菌種生長特性相關(guān)實驗

菌種開啟后接種在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上不生長，在含5%羊血固體培養(yǎng)基上生長；35～37℃、5%～10% CO2環(huán)境培養(yǎng)形成α溶血、細(xì)小圓形、隆起、表面光滑、灰白色、半透明、濕潤的菌落，部分呈扁平、中間有凹陷的典型“臍狀”菌落。

1.8.1 培養(yǎng)特性 分別接種于普通瓊脂培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)肉水瓊脂培養(yǎng)基、5%羊血胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基上，將各類培養(yǎng)基平板置于35～37℃、5.0%～10.0%CO2環(huán)境中培養(yǎng)12～24 h，觀察在各種培養(yǎng)基上的生長情況。按10倍梯度稀釋法稀釋菌液，將稀釋菌液涂布接種于5%羊血胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基上并涂板，將平板置于35～37℃、5.0%～10.0% CO2環(huán)境中培養(yǎng)12～24 h，觀察菌落形態(tài)。進(jìn)行培養(yǎng)特性觀察試驗。

1.8.2 奧普托欣試驗 開啟菌種涂布接種于5%羊血胰蛋白大豆瓊脂平皿，將3片奧普托欣（Optochin）藥敏紙片（5 μg/片）呈三角形狀貼于平板上。將平板置于35～37℃、5.0%～10.0% CO2下培養(yǎng)12～24 h，測量抑菌環(huán)的直徑。

1.8.3 膽汁溶菌試驗 制備菌懸液。取2支玻璃試管，分別編號為：①、②，2支試管中各加9 mL菌懸液，并在編號為①的試管中加入1 mL 10%脫氧膽酸鈉溶液,自然靜置；在編號為②的試管中加入1 mL 0.85%氯化鈉溶液做對照。將試管置于室溫環(huán)境中5～30 min，觀察結(jié)果。

1.8.4 血清學(xué)試驗 取1片干凈的玻片，在玻片的一端滴加1滴肺炎鏈球菌免疫血清，在玻片的另一端滴加1滴0.85%氯化鈉溶液作為對照，用接種環(huán)鉤取少量4型肺炎鏈球菌CMCC 31446菌株一代菌種的菌苔分別置于玻片上的4型肺炎鏈球菌免疫血清及0.85%氯化鈉溶液液滴中，混勻，輕輕搖動玻片，1～2 min后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 肺炎鏈球菌4型菌株凍干前后活性檢測

凍干前檢測肺炎鏈球菌4型菌株活性=2.35×108cfu/mL，對含不同凍干保護(hù)劑的凍干菌種的凍干存活率進(jìn)行檢測，凍干后的菌株活性和存活率如表2和圖1所示。

表2 肺炎鏈球菌4型菌株凍干后活性與存活率

圖1 肺炎鏈球菌4型不同保護(hù)劑組凍干后存活率柱狀分析圖

2.2 正交實驗分析

根據(jù)正交實驗結(jié)果極差分析（表3）可以看出3個因素對肺炎鏈球菌4型菌株凍干效果影響的顯著性順序為海藻糖＞脫脂乳粉＞谷氨酸鈉，根據(jù)正交試驗結(jié)果可推測：最佳凍干保護(hù)劑組合為：5%脫脂奶粉+10%海藻糖+10%谷氨酸鈉。

表3 正交實驗極差分析表（%）

2.3 最佳凍干保護(hù)劑驗證

為了驗證篩選獲得的凍干保護(hù)劑配方是否為最優(yōu)保護(hù)劑組合，將推測獲得的5%脫脂奶粉+10%海藻糖+10%谷氨酸鈉配方應(yīng)用于肺炎鏈球菌4型菌株的冷凍真空干燥工藝。經(jīng)檢測凍干后活性為1.90×108cfu/mL，凍干后存活率達(dá)到81.2%，高于前期正交實驗中的所有配方組。將該配方應(yīng)用于6A、18C、19F血清型肺炎鏈球菌菌株凍干，凍干后存活率分別為82.3%，78.2%和81.2%，均滿足生產(chǎn)用菌株的要求。

2.4 肺炎鏈球菌4型凍干菌株長期存放活率檢測

凍干菌種90、180、360 d三個時間節(jié)點取樣檢測活性，計算得到其存活率分別是：80.4%，80.1%和79.8%，說明該配方下的凍干菌株長期存放存活率比較穩(wěn)定，能夠滿足生產(chǎn)要求。

2.5 遺傳穩(wěn)定性檢測

使用引物以凍干前，凍干后菌種于0、90、180、360 d所取樣本為模板進(jìn)行cap locus DNA片段PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序、拼接獲得樣本的Cap locus核酸序列全長，最后使用MegAlign軟件對樣本Cap locus核酸序列進(jìn)行同源性分析，分析結(jié)果顯示四個樣本之間的同源性均為100%，表明肺炎鏈球菌4型莢膜合成位點遺傳信息穩(wěn)定性良好。四個樣本的同源性分析結(jié)果見圖2。

圖2 肺炎鏈球菌4型遺傳穩(wěn)定性分析

2.6 菌株生長特性觀察

肺炎鏈球菌4型菌株凍干前后生長特性觀察結(jié)果如圖3～6所示（封三）。研究和分析菌株的培養(yǎng)特性、染色鏡檢、奧普托欣試驗、膽汁溶菌試驗、生化反應(yīng)、血清學(xué)試驗結(jié)果，凍干前、凍干保存360 d后比較，肺炎鏈球菌4型菌株生長特性無變化（表4）。

表4 生長特性結(jié)果的比較

圖3 肺炎鏈球菌4型菌株培養(yǎng)特性觀察

圖4 肺炎鏈球菌4型菌株奧普托欣（Optochin）敏感試驗

圖5 肺炎鏈球菌4型菌株膽汁溶菌試驗

圖6 肺炎鏈球菌4型菌株血清凝集試驗

3 討論

通常情況下采用冷凍真空干燥法對微生物菌種進(jìn)行保存，但是冷凍真空干燥對菌株有多方面綜合脅迫過程，過程中形成的冰晶引起菌體機(jī)械損傷、細(xì)胞完整性破壞等，導(dǎo)致菌體的存活率降低，影響菌種凍干后的活性[11-14]。

保護(hù)劑的加入可改變生物樣品冷凍干燥時的物理、化學(xué)環(huán)境，減輕或防止冷凍干燥或復(fù)水對細(xì)胞的損害，盡可能保持原有的各種生理生化特性和生物活性[15]。凍干保護(hù)劑不僅影響凍干過程中的細(xì)胞存活率，還影響到保藏期間蛋白質(zhì)及細(xì)胞的穩(wěn)定性[16]。通過在活菌菌體的凍干過程中加入適宜的保護(hù)劑，可以達(dá)到減少甚至避免菌體凍干損傷、提高活菌存活率和收率、延長凍干菌株保存期的目的[17]。

本研究以肺炎鏈球菌4型為冷凍真空干燥試驗菌種，通過正交實驗以及凍干前后活率分析篩選最佳保護(hù)劑配方，最終篩選獲得的最佳凍干保護(hù)劑配方為5%脫脂奶粉+10%海藻糖+10%谷氨酸鈉。該配方下肺炎鏈球菌血清型4型菌株0 d取樣存活率達(dá)到81.2%，360 d取樣存活率達(dá)到79.8%，存活率隨著時間推移雖有所下降，但仍符合生產(chǎn)用菌株要求；該配方下菌株同樣表現(xiàn)出良好的遺傳穩(wěn)定性以及高度一致的生長特性，表明該凍干保護(hù)劑配方適用于肺炎鏈球菌血清型4型菌種的長期保存。

由于肺炎鏈球菌血清型較多，目前使用該保護(hù)劑進(jìn)行菌種保存驗證的血清型有6A、18C和19F，凍干后菌種存活率分別為82.3%、78.2%和81.2%。對本研究未涉及的菌株保護(hù)效果需要進(jìn)一步確認(rèn)。另外菌株凍干過程是抵御復(fù)雜不良環(huán)境脅迫的一個過程，菌株的保藏更是一個長期的過程，需要在長時間保存后，持續(xù)對存活率來進(jìn)行深入的考察，再通過存活率從側(cè)面驗證凍干保護(hù)劑配方的保護(hù)效果。凍干過程除保護(hù)劑外其他因素，如凍干曲線等，對菌種長期存放的效果也至關(guān)重要，本研究中有所欠缺，需要在后期做進(jìn)一步探討與研究。