陸周翔 陶 松

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬湖州中醫(yī)院 浙江 湖州 313000

本研究旨在構(gòu)建腎陽虛類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)骨質(zhì)疏松（OP）的中醫(yī)病證結(jié)合模型，探討腎陽虛在RA-OP中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級DBA/1(H-2q)小鼠，雄性，8周齡，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2017-0005。在溫度22±2oC，濕度50%～60%，光照12h光明和10h黑暗的環(huán)境明暗交替，換風(fēng)次數(shù)15～20次/小時(shí)的環(huán)境下，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)室許可證號SYXK（浙）2018-0012。

1.2 試劑與儀器：牛Ⅱ型膠原（Chondrex，批號：Chondrex 20022)，弗 氏 佐 劑（Chondrex，批 號 ：Chondrex 7001,Chondrex 7002)，小鼠白細(xì)胞介素17(IL-17)ELISA試劑盒（酶免，批號：MM-0170M1），小鼠骨保護(hù)素(OPG)ELISA試劑盒（酶免，批號：MM-0144M1），SYBR Green qPCR試劑盒（康為世紀(jì)，批號：CW2601），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（康為世紀(jì)，批號：CW2569），RIPA裂解液（碧云天，批號：P0013D），PMSF（碧云天，批號：ST506）。酶標(biāo)儀（MD公司），核酸定量儀（Thermo Scientific），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（羅氏公司）。

1.3 腎陽虛小鼠模型建立：取10只雄性DBA/1(H-2q)小鼠，皮下注射20mg·kg-1氫化可的松，每日1次，連續(xù)7d，進(jìn)行小鼠腎陽虛造模；末次注射7d后進(jìn)行類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的OP造模。

1.4 牛Ⅱ型膠原RA造模：取10只腎陽虛小鼠和10只正常小鼠進(jìn)行RA造模，牛Ⅱ型膠原（sigma）以2.0mg/ml溶解在0.05mol/L醋酸（2.96ml乙酸用水稀釋至1000ml）中，4℃過夜，逐滴加入等體積冷的完全弗氏佐劑（含有1mg/ml滅活的結(jié)核分枝桿菌）中后進(jìn)行注射器乳化。第1天（第0周），每只小鼠接受0.1mg/0.1ml膠原，尾跟部2～3cm處皮內(nèi)注射。免疫之后21天（第3周），動(dòng)物接受完全相同的二次加強(qiáng)注射。造模成功后，RA-OP組（10只），腎陽虛型RA-OP組（10只）；另取10只正常DBA/1(H-2q)小鼠作正常組。

1.5 動(dòng)物體重及足趾腫脹度：二次免疫后，持續(xù)8周，每周監(jiān)測小鼠體重變化，測量足掌厚度獲得腫脹程度。當(dāng)小鼠開始出現(xiàn)明顯紅腫，疼痛及關(guān)節(jié)活動(dòng)受限等典型的膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）改變，記錄時(shí)間，求得發(fā)生率。

1.6 生化指標(biāo)檢測：末次給藥后，小鼠禁食12h，眼眶取血，離心機(jī)以3000rpm/min，離心15min，收集上層血清，-20℃保存，48h內(nèi)采用全自動(dòng)生化分析儀測定ACTH、CORT、CRH的含量。

1.7 ELISA檢測血清中IL-17、OPG：末次給藥后，小鼠禁食12h，作腹主動(dòng)脈采血，離心機(jī)以3000rpm/min，離心15min，收集血清。ELISA法檢測血清中IL-17、OPG的含量。

1.8 組織學(xué)觀察：骨小梁可直接反應(yīng)骨的強(qiáng)度和穩(wěn)定性，12周后將股骨標(biāo)本經(jīng)固定，脫鈣，脫水，石蠟包埋，5μm連續(xù)切片后HE染色，在光鏡下觀察其骨小梁的結(jié)構(gòu)變化。

1.9 RT-PCR檢測股骨頭組織 Th17、OPG、RANK、RANKL mRNA表達(dá)水平：以Trizol溶液按常規(guī)方法抽提股骨頭組織中的總RNA，按照試劑盒說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測Th17、OPG、RANK、RANKL mRNA表達(dá)水平情況，運(yùn)用2-△△Ct法計(jì)算基因相對表達(dá)量。所用引物序列如表1所示。

表1 PCR引物序列

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料多組間用One-way-ANOAY單因素方差分析，組間比較采用SNK分析。方差不齊者采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s)表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎陽虛型RA-OP小鼠體重、足趾腫脹度、炎癥評分：由表2可知，與正常組相比，RA-OP組與腎陽虛型RAOP組小鼠體重顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。由圖1可知，與正常組相比，RA-OP組與腎陽虛型RA-OP組小鼠足趾厚度與炎癥評分顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 腎陽虛型RA-OP小鼠足趾腫脹度（±s，分，n=10）

表2 腎陽虛型RA-OP小鼠體重（±s,g,n=10）

表2 腎陽虛型RA-OP小鼠體重（±s,g,n=10）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別1周2周3周4周5周6周7周8周腎陽虛型RA-OP組26.40±1.73 25.86±2.03 25.87±1.80 25.65±1.86 25.37±1.68*25.19±1.86**24.86±1.81**24.43±1.56**正常組25.31±1.89 25.81±1.76 25.96±1.91 26.73±1.71 27.25±1.87 27.34±1.60 27.92±1.80 28.14±2.12 RA-OP組26.76±1.59 26.45±1.42 26.05±1.39 25.48±1.48 25.26±1.67*24.75±1.47**24.48±1.36**24.31±1.47**

2.2 腎陽虛型RA-OP小鼠CIA發(fā)生率：由圖2可知，正常組小鼠CIA發(fā)生率始終為0，RA-OP組小鼠在二次免疫后第45天CIA發(fā)生率為100%，腎陽虛型RA-OP組小鼠在二次免疫后第36天CIA發(fā)生率為100%。

圖2 腎陽虛型RA-OP小鼠CIA發(fā)生率

2.3 HE染色：由圖3可得，正常組小鼠骨小梁完整排列緊密；而RA-OP組與腎陽虛型RA-OP組小鼠骨小梁排列稀疏，變細(xì)，間距加寬，可見微骨折。

圖3 小鼠股骨組織恢復(fù)的情況（HE染色，200×）

2.4 腎陽虛型RA-OP小鼠血清ACTH、CORT、CRH水平：由圖4可知，與正常組相比，RA-OP組與腎陽虛型RA-OP組小鼠外周血 ACTH、CORT、CRH含量均顯著下降（P＜0.01）。

圖4 腎陽虛型RA-OP小鼠血清ACTH、CORT、CRH水平（±s,n=10）

2.5 腎陽虛型RA-OP小鼠血清IL-17與OPG水平：由表3可知，與正常組相比，RA-OP組與腎陽虛型RA-OP組小鼠血清，IL-17水平均顯著上升，OPG水平均顯著下降（P＜0.01）。

表3 腎陽虛型RA-OP小鼠IL-17與OPG水平（±s,n=10）

表3 腎陽虛型RA-OP小鼠IL-17與OPG水平（±s,n=10）

注：與正常組比較，**P＜0.01。

組別正常組RA-OP組腎陽虛型RA-OP組OPG(pg/ml)57.69±6.01 40.47±3.75**27.82±3.14**IL-17(pg/ml)117.69±13.79 160.13±19.64**187.05±17.52**

2.6 腎陽虛型RA-OP小鼠股骨頭組織Th17、RANK、RANKL與OPG的mRNA表達(dá)水平：由圖5可知，與正常組相比，RA-OP組與腎陽虛型RA-OP組小鼠股骨頭組織Th17、RANK與RANKL mRNA水平均顯著上升（P＜0.05），OPG mRNA水平顯著下降（P＜0.01）。

圖5 腎陽虛型RA-OP小鼠股骨頭組織Th17、RANK、RANKL與OPG的mRNA表達(dá)水平（±s,n=3）

3 討論

RA患者下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸功能會降低，自身免疫應(yīng)答異常增強(qiáng)[1]。腎陽虛證的表現(xiàn)主要與HPA軸不同層次的功能紊亂有關(guān)[2]。IL-17和RANKL/RANK/OPG信號通路與RA的關(guān)系密切相關(guān)。IL-17可以通過對RANKL/RANK/OPG信號通路的調(diào)節(jié)對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活化產(chǎn)生重要影響。研究表明，IL-17誘導(dǎo)RANKL表達(dá)的受體激活劑，對破骨細(xì)胞生成以及骨吸收有至關(guān)重要的作用[3]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在膠原或佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型中，血清RANKL水平明顯升高，且OPG水平降低，RANKL/OPG比值顯著增加[4]。因此，RANKL/OPG比值的升高，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)破壞和骨侵蝕中起著重要作用。

本研究采用氫化可的松聯(lián)合牛Ⅱ型膠原建立腎陽虛型RA-OP中醫(yī)病證結(jié)合小鼠模型，結(jié)果顯示，小鼠出現(xiàn)畏寒喜暖，毛發(fā)干枯，蜷縮弓背等表現(xiàn)，腎陽虛型RAOP組小鼠體重顯著下降，小鼠足趾厚度顯著上升；腎陽虛型RA-OP組小鼠在二次免疫后第36天CIA發(fā)生率為100%。腎陽虛型RA-OP組小鼠骨小梁排列稀疏，變細(xì)，間距加寬，可見微骨折。腎陽虛型RA-OP組小鼠外周血ACTH、CORT、CRH含量均顯著下降；IL-17水平均顯著上升，OPG水平均顯著下降；股骨頭組織Th17、RANK與RANKL mRNA水平均顯著上升，OPG mRNA水平顯著下降。

此病證結(jié)合動(dòng)物模型，是在中醫(yī)學(xué)理論指導(dǎo)下，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論，同時(shí)采用傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病因復(fù)制證候動(dòng)物模型，同時(shí)具有疾病與證候特征，具有較好的可靠性及穩(wěn)定性。故本實(shí)驗(yàn)?zāi)I陽虛與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型復(fù)合以復(fù)制腎陽虛型RA骨質(zhì)疏松中醫(yī)病證結(jié)合模型，更符合中醫(yī)臨床要求的動(dòng)物模型。