宋 爽 張 敏 吳可人

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 浙江 杭州 310006

膽管癌（cholangiocarcinoma）是一種起源于膽管上皮細(xì)胞且具有較高惡性程度的腫瘤[1]。手術(shù)是唯一能夠治愈膽管癌的手段，但早期發(fā)現(xiàn)困難，只有約35%的患者能夠早期發(fā)現(xiàn)并接受根治性手術(shù)，而晚期無法行手術(shù)治療的患者，中位生存期僅為3～6個月[2]?；诨煂δ懝馨┗颊叩闹卮笠饬x，逆轉(zhuǎn)MDR是對抗膽管癌的重要任務(wù)和提高患者生活質(zhì)量的有效方式。人參（Panax ginsengC.A.Meyer）是五加科植物人參Panax ginseng C.A.Meyer的干燥根和根莖，屬多年生草本植物，具有大補元氣、補脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，人參具有抗增殖、抗血管生成、抗炎、抗氧化和抗腫瘤等特性[3]。人參對肝癌[4]、結(jié)腸癌[5]、皮膚癌[6]等多種腫瘤有明確作用。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究人參活性成分Rg3通過CASP8誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞凋亡作用。

1 材料與方法

1.1 收集疾病、藥物靶基因：在GeneCards和Online Mendelian Inheritance in Man在線數(shù)據(jù)庫輸入“cholangiocarcinoma”，檢索并收集膽管癌相關(guān)體內(nèi)基因。本研究中涉及的生物物種均設(shè)計為“homo sapiens（human）”。借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSPp）挖掘“人參”的活性成分及靶標(biāo)，后經(jīng)UniProt查詢對應(yīng)靶標(biāo)的基因名。

1.2 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：在Venn在線工具中分別輸入人參和膽管癌靶基因，可直接獲取Venn圖及兩者交集基因。將交集基因?qū)隨TRING在線數(shù)據(jù)庫，隱藏?zé)o連接的節(jié)點，即可得到PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.3 基因表達(dá)驗證和生存分析：借助Gene Expression Profiling Interactive Analysis（GEPIA）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行交集基因表達(dá)驗證和生存分析。

1.4 通過CCK-8實驗考察對Hucct-1細(xì)胞增殖作用：細(xì)胞培養(yǎng)：Hucct-1細(xì)胞（廣州賽庫生物有限公司）用含10%胎牛血清（美國Gibico公司）及1%P/N雙抗（美國Gibico公司）的RPMI-1640培養(yǎng)基（美國HyClone公司）于 37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。以5×104/孔接種于96孔板。于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后，分別加25、50、100μg/ml的Rg3（終濃度），設(shè)置空白對照組。分別作用24、48h后更換培養(yǎng)基，每孔加入10μl CCK-8（日本同仁化學(xué)研究所）溶液，孵箱繼續(xù)培養(yǎng)1后測量450nm處的吸光度（OD）值。

1.5 Rg3誘導(dǎo)CASP8，Bax表達(dá)，抑制Bcl-2表達(dá)：細(xì)胞接種方法同上接種于6孔板每組3個復(fù)孔，Rg3干預(yù)細(xì)胞24h后，用細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA法測蛋白濃度。常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉抗后敷育一抗、二抗（中國親科生物有限公司），ECL法拍攝化學(xué)發(fā)光。檢測灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用 SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。所獲數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步比較行LSD檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 疾病-藥物靶基因預(yù)測：本文借助兩個數(shù)據(jù)庫以盡量全面獲取膽管癌相關(guān)體內(nèi)基因，共1733個。TCMSP數(shù)據(jù)庫包含了499味草藥（中國藥典2010版）以及每位草藥的化合物成分（共計29000余個），本研究設(shè)置OB≥30%且DL≥0.18，共獲得人參活性物質(zhì)14個。

2.2 人參治療膽管癌的可能靶點：經(jīng)Venn工具共獲得人參-膽管癌交集基因24個，此即為人參治療膽管癌的可能靶點，詳見表1和圖1。

表1 人參活性成分調(diào)控體內(nèi)基因與膽管癌靶基因交集基因名稱

圖1 膽管癌和人參交集基因

2.3 獲取PPI網(wǎng)絡(luò)：PPI網(wǎng)絡(luò)如圖2，圖中節(jié)點代表基因，連線代表相互作用，不同顏色的線條代表不同的相互作用類型。

2.4 表達(dá)驗證和生存分析：利用GEPIA-Boxplots對20個STRING篩選出的核心基因進(jìn)行表達(dá)驗證發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，在膽管癌樣品中有8個基因（ALOX5、BCL2、CASP8、GSTP1、ICAM1、PLAU、PRKCA、PTGS1）高表達(dá)，3個基因（CYP1A1、NR1I3、PON1）低表達(dá)，詳見圖3。GEPIASurvival Analysis對表達(dá)有差異的11個基因的總體生存率（overall survival，OS）進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，ALOX5和CASP8的OS顯著改變（P＜0.05），其余基因則沒有顯著性差異，結(jié)果見圖4。

圖3 膽管癌組織和正常組織中表達(dá)具有顯著性變化的核心基因

圖4 存活率顯著改變基因的預(yù)后信息

2.5 Rg3對Hucct-1細(xì)胞增殖抑制作用：采用CCK-8實驗考察給予Rg3作用24，48h對Hucct-1細(xì)胞增殖活性的影響。結(jié)果顯示，25，50，100μg/ml的Rg3對Hucct-1細(xì)胞增殖具有明顯作用，作用24h（P＜0.05）以及作用48h（P＜0.05）均有顯著性差異（圖5）。由結(jié)果可知Rg3 50，100μg/ml劑量組作用24h具有良好的劑量依賴性，因此后續(xù)實驗以此為干預(yù)條件。

圖5 不同濃度Rg3對膽管癌Hucct-1細(xì)胞增殖的影響

2.6 Rg3誘導(dǎo)CASP8、Bax表達(dá)，抑制Bcl-2表達(dá)：Rg3 50,100μg/ml作用Hucct-1細(xì)胞24h后，采用Western blot實驗檢測凋亡標(biāo)簽蛋白的變化。結(jié)果顯示，與對照組相比，Rg3組CASP8（P＜0.01），Bax（P＜0.05）表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）。見圖6。

3 討論

本研究通過TCMSP共獲得人參活性成分14個，通過GeneCards和OMIM獲得膽管癌基因1733個，人參和膽管癌交集基因24個，STRING篩選出核心基因20個，表達(dá)驗證證實，其中11個在膽管癌組織中的表達(dá)與正常組織相比發(fā)生了顯著變化，而11個基因中，ALOX5和CASP8的OS顯著改變。

花生四烯酸5-脂氧合酶（ALOX5）編碼的人體5-脂氧合酶（5-LOX），相當(dāng)文獻(xiàn)表明5-LOX產(chǎn)物具有致癌潛力[7]，并認(rèn)為5-LOX能為膽管癌治療提供新的方法。凋亡相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶（caspases）對免疫細(xì)胞的存亡至關(guān)重要[8]，其中，CASP8與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。唐泓波等[9]研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg3可以降低小鼠乳腺癌發(fā)生率、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、提高小鼠CASP8表達(dá)量。雖然目前還沒有人參作用于ALOX5/5-LOX、CASP8治療膽管癌的直接證據(jù)，但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果提示，人參的活性成分kaempferol和beta-sitosterol可以分別作用于ALOX5和CASP8，發(fā)揮治療膽管癌的作用。

通過實驗對篩選的CASP8進(jìn)行驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rg3可通過上調(diào)CASP8誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，有效抑制Hucct-1增殖，進(jìn)一步驗證CASP8可能是Rg3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制膽管癌細(xì)胞增殖的靶點。

膽管癌病因病機(jī)未明、治療過程中副作用多見且患者預(yù)后不佳，研發(fā)新的治療靶點和藥物刻不容緩。中藥具有多靶點、多途徑的作用特點，針對臨床復(fù)雜疾病的治療有其優(yōu)勢，已然成為抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、生物信息學(xué)等為中藥在研發(fā)、疾病治療方面提出了新方法。該方法基于整體，在各數(shù)據(jù)庫中收集藥物和疾病的信息，結(jié)合當(dāng)前計算機(jī)技術(shù)，將成分多樣的藥物和因素復(fù)雜的疾病形成網(wǎng)絡(luò)以分析，為系統(tǒng)篩選人參中具有治療膽管癌成分及其可能的作用機(jī)制提供了思路，為后續(xù)研究奠定理論基礎(chǔ)。