丘青中 戚子榮 邢振龍

1.廣東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院關(guān)節(jié)與創(chuàng)傷骨科，廣東佛山 528200；2.廣東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院手足外科，廣東佛山 528200

痛風(fēng)是由于人體內(nèi)嘌呤代謝失常，引起體內(nèi)尿酸(UA)水平升高，尿酸鹽晶體在體內(nèi)累積引發(fā)急性關(guān)節(jié)部位的紅腫熱痛為主要癥狀的一種關(guān)節(jié)及軟組織炎癥性疾病[1]，如果不及時(shí)治療與干預(yù)，可以發(fā)展為痛風(fēng)石、泌尿系結(jié)石及痛風(fēng)性腎病[2]。隨著目前經(jīng)濟(jì)發(fā)展及生活水平的提高，飲食習(xí)慣的改變，痛風(fēng)的發(fā)病率不斷升高，且愈加趨向年輕化，逐漸成為危害國民健康的一種常見代謝性疾病。目前藥物治療主要是以非甾體抗炎藥和秋水仙堿為主，但因其有胃腸道不良反應(yīng)，臨床上不易長期口服[3]。中醫(yī)對痛風(fēng)的認(rèn)識(shí)久遠(yuǎn)，中醫(yī)藥治療痛風(fēng)效果良好，患者服用后較少出現(xiàn)藥物不良反應(yīng)。廣東省佛山市名中醫(yī)丘青中教授師承國醫(yī)大師石仰山，一直致力于傳承與發(fā)展中醫(yī)骨傷科，在30 多年的臨床實(shí)踐中積累了豐富的治療痛風(fēng)的經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)多年的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出經(jīng)驗(yàn)方萆薢祛風(fēng)飲[4]，主要治療濕熱蘊(yùn)結(jié)證痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作，本研究采用Mc Carty DJ[5]經(jīng)典造模方法與濕熱蘊(yùn)結(jié)證造模方法[6]，使用微晶型尿酸鈉誘導(dǎo)濕熱蘊(yùn)結(jié)證大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，初步探索萆薢祛風(fēng)飲對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用及推廣提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級健康SD 大鼠50 只，雄性，6～8 周齡，體重(250±20)g，廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心代購，實(shí)驗(yàn)場地：廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：syxk(粵)2016-0023，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號：44203400011123。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物至少飼養(yǎng)1 周后使用，飼養(yǎng)環(huán)境為溫度(22±1)℃，濕度(55±5)%，12 h 光暗循環(huán)，飼料和水均在消毒后由動(dòng)物自由攝取。已通過廣東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院(以下簡稱“我院”)倫理審查，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有關(guān)條例進(jìn)行。

1.2 儀器與試藥

1.2.1 藥劑

秋水仙堿片(云南西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：190217)，0.5 mg/片，以蒸餾水稀釋至濃度為0.003 mg/mL 秋水仙堿溶液備用；尿酸鈉結(jié)晶(美國Sigma 公司，批號：BCBH6934Y)；萆薢祛風(fēng)飲：萆薢30 g、土茯苓20 g、薏苡仁20 g、車前草15 g、蒲公英15 g、山慈菇20 g、忍冬藤20 g、地龍15 g、赤小豆12 g、赤芍12 g、川牛膝12 g。藥物購自我院藥房。煎煮方法：以上藥物適當(dāng)磨碎后，放入煮藥鍋用3 倍量水浸泡30 min 后，用文火煎煮約2 h，等水量濃縮至1 倍藥物體積為止，然后將經(jīng)過濾出的藥汁通過80%乙醇回流萃取，回流重復(fù)3 次取得藥液提取液，使用定性濾紙過濾，最后以恒溫60℃水浴蒸干，所得的藥液蒸干提取物置于冰箱存儲(chǔ)。

1.2.2 儀器

電熱恒溫水浴鍋(浙江寧波醫(yī)療器械廠，SK12-6)；精密電子天平(德國賽多利斯公司，BSA124S 型，感量：0.1 mg)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測試劑盒(USA Sigma公司，批號：DSM2000)；大鼠半胱氨酸天冬氨酸酶(Caspase-1)抗體(上海碧云天生物科技有限公司，批號：AF2165)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(日本Hitachi 公司，CR-GⅡ)；全自動(dòng)生化儀(日本日立，7150 型)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

50 只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、模型組、秋水仙堿組、高劑量萆薢祛風(fēng)飲組、低劑量萆薢祛風(fēng)飲組，每組各10 只。

1.3.2 造模

1.3.2.1 濕熱蘊(yùn)結(jié)證造模方法 空白對照組在正常環(huán)境下飼養(yǎng)15 d，其他四組在正常飼養(yǎng)基礎(chǔ)上，飲食上加入200 g/L 蜂蜜水自由飲用，且隔日按大鼠體重灌服豬油脂10 g/kg，共10 d，然后放入溫度為(32±2)℃，相對濕度為95%的人工氣候箱中飼養(yǎng)，造模時(shí)間共15 d。觀察大鼠，當(dāng)出現(xiàn)肛溫升高、倦怠、嗜臥，大便偏稀等癥狀時(shí)，提示大鼠濕熱蘊(yùn)結(jié)證造模成功[7]。

1.3.2.2 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎造模方法 濕熱蘊(yùn)結(jié)證造模結(jié)束后，四組均以10%水合氯醛對大鼠行腹腔注射麻醉(按0.3 mL/100 g)，麻醉后取仰臥位固定。關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射：部位選取大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)后側(cè)[8-10]，采用注射針以30°～40°方向插入至跟腱內(nèi)側(cè)進(jìn)行注射。四組則均向右側(cè)踝關(guān)節(jié)內(nèi)注入0.2 mL 尿酸鈉溶液，空白對照組向右側(cè)踝關(guān)節(jié)內(nèi)注入0.2 mL 生理鹽水。造模大鼠出現(xiàn)右側(cè)踝關(guān)節(jié)明顯腫脹，大鼠踝關(guān)節(jié)紅腫熱痛，關(guān)節(jié)屈伸不利，甚至出現(xiàn)三足著地的現(xiàn)象，提示大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎造模成功[7]。

1.3.3 給藥

采用灌胃給藥方式，高、低劑量萆薢祛風(fēng)飲組按大鼠與成人用藥量比進(jìn)行換算，給予萆薢祛風(fēng)飲藥液提取物(劑量分別為8.31、4.52 g/kg)，秋水仙堿組給予秋水仙堿溶液(按9 mg/kg)[11]，模型組和空白對照組給予等體積生理鹽水。均為1 次/d，連續(xù)7 d。

1.4 觀察指標(biāo)

①大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度：通過2 cm 試紙配合游標(biāo)卡尺，分別在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎造模前1 h、造模后2 h 測量并記錄大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)周徑，造模前1 h 數(shù)據(jù)為關(guān)節(jié)初始周徑，造模后2 h 數(shù)據(jù)為關(guān)節(jié)腫脹后周徑，關(guān)節(jié)腫脹程度(%)=(關(guān)節(jié)腫脹后周徑－初始周徑)/初始周徑×100%，計(jì)算并記錄腫脹程度，其分?jǐn)?shù)與腫脹程度成正比。②血清中UA、白細(xì)胞介素(IL)-1β、Caspase-1 水平測定：在第7 天灌胃2 h 后股動(dòng)脈取血，3000 r/min(離心半徑=24 cm)離心15 min，取上清液，采用全自動(dòng)生化分析儀測定UA 水平，用試劑盒檢測IL-1β 及Caspase-1 水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度比較

高劑量萆薢祛風(fēng)飲組關(guān)節(jié)腫脹度低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度比較(%，±s)

表1 各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度比較(%，±s)

注：與模型組比較，△P ＜0.05

2.2 各組大鼠血清中UA、血清IL-1β、Caspase-1 水平比較

與空白對照組比較，模型組血清中UA、IL-1β、Caspase-1 水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P ＜0.05)。與模型組比較，高劑量萆薢祛風(fēng)飲組血清中UA、IL-1β、Caspase-1 水平降低，低劑量萆薢祛風(fēng)飲組血清中UA 水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P ＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清中UA、IL-1β、Caspase-1 水平比較(±s)

表2 各組大鼠血清中UA、IL-1β、Caspase-1 水平比較(±s)

注：與空白對照組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05。UA：尿酸；IL-1β：白細(xì)胞介素1β；Caspase-1：半胱氨酸天冬氨酸酶

3 討論

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作時(shí)會(huì)激活體內(nèi)炎癥細(xì)胞因子[12-13]，因此，通過抑制炎癥的連鎖反應(yīng)成為緩解痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎癥狀的一個(gè)作用靶點(diǎn)。在炎癥發(fā)展的早期，關(guān)節(jié)局部溫度是正常的，體內(nèi)的血液中的UA 水平升高之后，原沉積在關(guān)節(jié)附近的結(jié)締組織部位的尿酸鹽晶體波動(dòng)脫落。當(dāng)尿酸鹽晶體的黏附性達(dá)到一定臨界值，其開始進(jìn)入關(guān)節(jié)腔內(nèi)并擴(kuò)散，同時(shí)機(jī)體的炎癥反應(yīng)控制機(jī)制隨著尿酸鹽晶體與免疫球蛋白的結(jié)合而得到激活，從而使炎癥局部的吞噬細(xì)胞聚集升高[14-17]。環(huán)氧化酶和脂氧化酶在兩者的激活下，使前列腺素及其他致炎物質(zhì)[如IL、腫瘤壞死因子(TNF)]等得到促進(jìn)轉(zhuǎn)化，炎癥的發(fā)展出現(xiàn)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。但炎癥進(jìn)展到一定時(shí)期，部分血清因子的生成(如脂蛋白β-100、某些酶類)，聯(lián)合前列腺素的共同作用，達(dá)到影響甚至抑制機(jī)體炎癥的效果，使之進(jìn)入緩解期[18]。綜上而言，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎占據(jù)了炎癥的整個(gè)始發(fā)終末，包括炎癥早期誘導(dǎo)、進(jìn)展及自發(fā)消退的3 個(gè)基本過程。

通過本研究數(shù)據(jù)可以看出，模型組關(guān)節(jié)腫脹程度較高，UA、IL-1β、Caspase-1 水平均較空白對照組明顯升高，從側(cè)面提示了急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎激活了體內(nèi)炎癥因子及炎癥反應(yīng)，截?cái)嘣撨B鎖反應(yīng)的啟動(dòng)或繼發(fā)過程可能是治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的靶點(diǎn)之一。本研究顯示，與模型組比較，高劑量萆薢祛風(fēng)飲組在緩解痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)腫脹方面均可起到良好的效果，但是低劑量萆薢祛風(fēng)飲組無明顯療效，不僅提示萆薢祛風(fēng)飲對急性腫脹癥狀的治療作用，還提示了其緩解腫脹癥狀需要達(dá)到一定的有效藥物濃度。在臨床實(shí)踐中，可以考慮在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作期關(guān)節(jié)紅腫熱痛明顯時(shí)使用萆薢祛風(fēng)飲進(jìn)行輔助治療。關(guān)節(jié)腫痛癥狀作為局部炎癥反應(yīng)在關(guān)節(jié)部位的外在表現(xiàn)，萆薢祛風(fēng)飲可能是通過抑制炎癥反應(yīng)的進(jìn)展及繼發(fā)機(jī)制發(fā)揮作用。與模型組比較，高劑量萆薢祛風(fēng)飲組IL-1β、Caspase-1 水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，提示達(dá)到有效濃度的萆薢祛風(fēng)飲可以通過對IL-1β、Caspase-1 的調(diào)節(jié)干擾炎癥的進(jìn)展。在調(diào)控機(jī)體內(nèi)UA水平方面，高劑量和低劑量萆薢祛風(fēng)飲組與模型組比較均有大幅度下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P ＜0.05)，考慮萆薢祛風(fēng)飲可降低大鼠體內(nèi)的UA 水平，但是具體作用機(jī)制為促進(jìn)UA 排泄還是減少UA 的生成途徑尚不明確，需要結(jié)合對大鼠的尿液UA 進(jìn)行UA 測定方能進(jìn)行下一步推測。

在治療方面，西醫(yī)的主流觀點(diǎn)及指南建議為在急性期，使用抗炎藥物緩解急性癥狀，并可以使用小劑量秋水仙堿預(yù)防痛風(fēng)再次發(fā)作[19]。非急性期可以使用促進(jìn)UA 排泄或者減少UA 生成的藥物來降低體內(nèi)UA 的濃度，避免尿酸鹽結(jié)晶在人體關(guān)節(jié)沉積為痛風(fēng)石。中醫(yī)藥因?yàn)榕R床療效及副作用少，不失為防治痛風(fēng)性關(guān)節(jié)的另一思路。廣東省佛山市名中醫(yī)丘青中教授認(rèn)為痛風(fēng)的病因?yàn)轶w內(nèi)濕熱為底，在外感、受寒、濕著或汗出當(dāng)風(fēng)等因素下，內(nèi)熱外寒相搏，瘀滯于關(guān)節(jié)，故關(guān)節(jié)

溫高作痛[19-23]。濕濁熱毒內(nèi)蘊(yùn)是機(jī)體內(nèi)部的基礎(chǔ)[24-25]，外感邪毒阻滯筋脈骨節(jié)為急性發(fā)作的病機(jī)，針對此病因病機(jī)，以“祛風(fēng)除濕、清瀉蘊(yùn)熱”為治則擬臨床經(jīng)驗(yàn)方萆薢祛風(fēng)飲：萆薢、土茯苓、薏苡仁、車前草、蒲公英、山慈菇、赤芍、忍冬藤、地龍、赤小豆、川牛膝。該方可以祛風(fēng)為逐人體肌表經(jīng)絡(luò)所受之風(fēng)寒濕邪，除濕瀉熱為驅(qū)四肢郁久之濕濁熱毒，從而使筋脈骨節(jié)屈伸滑利[26]。丘青中教授在臨床上廣泛運(yùn)用此方，取得良好療效，且其安全性高，較之西藥，中藥更易讓患者接受，且其標(biāo)本兼治，虛實(shí)并調(diào)，真正能解除患者痛苦，降低發(fā)病率。

綜上所述，萆薢祛風(fēng)飲可通過抑制IL-1β、Caspase-1介導(dǎo)的系列炎癥連鎖反應(yīng)，緩解痛風(fēng)發(fā)作的關(guān)節(jié)腫脹癥狀，從而對痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作起到治療作用。本研究對抗炎作用與降UA 的具體機(jī)制尚未深入研究，劑量僅分為高低劑量，后續(xù)可通過加大調(diào)整藥物劑量幅度進(jìn)一步探尋量效關(guān)系與最佳藥物濃度，以及進(jìn)一步完善萆薢祛風(fēng)飲對大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)抑制的影響[24，27]，進(jìn)一步研究萆薢祛風(fēng)飲對濕熱蘊(yùn)結(jié)證痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎抗炎作用的機(jī)制具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。