劉 莉 李宗云 何世學(xué) 趙 越 張春寶

1.河北省衡水市人民醫(yī)院制劑科，河北衡水 053000；2.河北省衡水市人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科，河北衡水 053000

中華大蟾酥或黑框蟾蜍的干燥分泌物為蟾酥[1-2]，臨床用于調(diào)控血壓[3]、調(diào)節(jié)免疫力[4]、抗腫瘤等[5-6]。蟾酥作為中藥制劑的常用藥物，包括脂溶性成分和水溶性成分。5-羥色胺和蟾蜍色胺是主要的水溶性成分[7]，脂溶性成分為蟾毒內(nèi)酯類[8-9]。酯蟾毒配基及華蟾酥毒基為蟾毒內(nèi)酯的主要成分[10]，因蟾酥配基具有毒性，在臨床上應(yīng)用時(shí)常有中毒及過敏的報(bào)道，限制了其應(yīng)用。緩控釋制劑不僅能更快地達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度、降低給藥次數(shù)，而且能夠給含毒性的中藥制劑在臨床使用上提供不同的研究方向[11]。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)鮮有把蟾酥制成殼聚糖微球這種新劑型的相關(guān)研究，因此本文對(duì)蟾酥殼聚糖微球進(jìn)行研究，并對(duì)微球內(nèi)的水溶性及脂溶性成分進(jìn)行了相關(guān)研究。

微球有增加穩(wěn)定性、提高生物利用率等特點(diǎn)[12-13]。本研究把脫乙酰殼聚糖作為載體，通過乳化-交聯(lián)法來制作蟾酥殼聚糖微球，并觀察研究其在體外的釋藥特性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260 高效液相色譜儀(美國Agilent 公司，可變波長紫外檢測器)；SQP 電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司，精密度：0.01 mg]；KDC-1042 低速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司)；激光粒度分析儀(歐美克科技有限公司)；RCZ-8AA 智能藥物溶出儀(天津大學(xué)精密儀器廠)；UV-2700 紫外分光光度計(jì)(島津)。

1.2 藥物與試劑

脫乙酰殼聚糖(脫乙酰度＞90%，玉環(huán)縣海洋生物化學(xué)有限公司)；蟾酥(河北康博藥業(yè)有限公司，20150521，經(jīng)河北省衡水市人民醫(yī)院中醫(yī)科肖紅主任鑒定為蟾酥飲片)；華蟾酥毒基對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，110803～200505，純度≥99.6%)；酯蟾毒配基對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，7189306，純度≥98%)；5-羥色胺對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，10015～201706，純度≥98%)；三氯甲烷(萊陽市精細(xì)化工廠，20180310)；丙酮(煙臺(tái)遠(yuǎn)東精細(xì)化工廠，20180901)；正丁醇(天津市恒興化學(xué)試劑精造有限公司，20181006)；乙腈(美國fisher chemicals，08412，色譜純)；水為高純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 蟾酥殼聚糖的制備

2.1.1 處方 水相：1%醋酸、1%脫乙酰殼聚糖、蟾酥；油相：液體石蠟；乳化劑：司盤60；固化劑：戊二醛。

2.1.2 制備方法 取殼聚糖1.00 g 溶于99 mL 水中，攪拌均勻，攪拌的同時(shí)加入1 mL 冰醋酸，混勻，備用。0.20 g 蟾酥加20 mL 乙醇使溶解，將上述兩種液體混勻。放置過夜，靜止消泡，備用[14-16]。取1.00 g 司盤60加200 mL 液體石蠟，攪拌使其混合均勻。將水相加入油相中，攪拌1 h，攪拌同時(shí)加入12 mL 戊二醛，3 h，使固化，高倍顯微鏡下觀察沒有粘連現(xiàn)象。低速離心機(jī)下離心10 min，轉(zhuǎn)速3000 r/min，離心半徑13 cm，取下層，經(jīng)石油醚多次洗滌后，80℃真空干燥箱干燥24 h，收集得到微球。

2.2 鑒別

2.2.1 蟾毒內(nèi)酯類成分 取相當(dāng)于0.20 g 的微球，加10 mL 乙醇，加熱回流30 min，放冷，過濾，濾液置于10 mL 量瓶，乙醇稀釋至刻度，為供試品溶液。精密稱取酯蟾毒配基、華蟾酥毒基對(duì)照品，稀釋成濃度為1 mg/mL 的溶液，為對(duì)照品溶液。吸取供試品、對(duì)照品液各8 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 板，環(huán)己烷-三氯甲烷-丙酮(4∶3∶3)展開劑中展開，取出，晾干，噴以10 %硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果供試品色譜中，與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，均有2 個(gè)斑點(diǎn)且陰性沒有干擾，見圖1A(封三)。

圖1 蟾酥殼聚糖微球的薄層鑒別(見內(nèi)文第32 頁)

2.2.2 蟾毒色胺類成分 取相當(dāng)于0.20 g 的微球，加50 mL 水，煎煮3 次，每次1 h，濾過，合并濾液置于100 mL 量瓶中，加水稀至刻度，搖勻，為供試品溶液。吸取供試品、對(duì)照品液各8 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 板，正丁醇-醋酸-水(4∶1∶5)展開劑中展開，取出，晾干，噴以20%對(duì)二甲氨基苯甲醛鹽酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)且陰性沒有干擾，見圖1B(封三)。

2.3 含量測定方法

2.3.1 色譜條件與適用性試驗(yàn) Diamonsil(C185 μm，250 mm×4.6 mm)，流動(dòng)相：乙腈-0.5%磷酸二氫鉀(52∶48)，磷酸調(diào)pH 為3.0，檢測波長：296 nm，流速：1.00 mL/min，柱溫：40℃；進(jìn)樣：10 μL[17-19]。見圖2。

圖2 高效液相色譜圖

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的華蟾酥毒基對(duì)照品1.00 mg、酯蟾毒配基對(duì)照品0.90 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，濃度分別為100、90 μg/mL，備用。

2.3.3 供試品溶液的制備 取0.25 g 微球，置于圓底燒瓶中，加25 mL 甲醇，稱重。加熱回流1 h，放冷，再次稱重，差值用甲醇補(bǔ)足，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 線性關(guān)系考察 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別精密量取華蟾酥毒基或酯蟾毒配基對(duì)照品溶液0.10、0.50、1.00、1.50、3.00、5.00 mL，置5 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，取10 μL，高效液相色譜進(jìn)行測定。橫坐標(biāo)為對(duì)照品溶液濃度(μg/mL)，縱坐標(biāo)為峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：華蟾酥毒基Y=7367.4X+4026(r=0.9998)，表明在0.02～1.00 μg 內(nèi)有很好的線性關(guān)系；酯蟾毒配基Y=10865X+7175.5(r=0.9997)，表明在0.018～0.900 μg內(nèi)有很好線性關(guān)系。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 取“2.3.2”對(duì)照品溶液10 μL，均進(jìn)樣6 次，按“2.3.1”的色譜條件進(jìn)行測定，考察精密度。華蟾酥毒基及酯蟾毒配基的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.18%和0.27%。

2.3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將濃度分別為5 μg/mL 華蟾酥毒基、18 μg/mL 酯蟾毒配基的溶液，按“2.3.1”條件于0、2、4、6、12、18、24 h 進(jìn)樣10 μL，華蟾酥毒基及酯蟾毒配基RSD 分別為0.44%和0.65%，表明在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn)“2.3.6”相同濃度對(duì)照品溶液均取6 份，按“2.3.1”進(jìn)行測定。華蟾酥毒基及酯蟾毒配基RSD 分別為2.65%和2.35%，說明該方法有很好的重現(xiàn)性。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的蟾酥粉末10.6 mg，精密稱定9 份，另分別加入相當(dāng)于含量為80%、100%、120%華蟾酥毒基和酯蟾毒配基對(duì)照品溶液，按“2.3.1”進(jìn)行測定。求得華蟾酥毒基平均加樣回收率為98.21%，酯蟾毒配基平均加樣回收率為97.18%。均得到很好的回收率，可以作為含量測定。見表1～2。

表1 華蟾酥毒基加樣回收率結(jié)果

表2 酯蟾毒配基加樣回收率結(jié)果

2.4 微球形態(tài)及粒徑考察

光學(xué)顯微鏡觀察其形態(tài)，用激光粒度分析儀測量其粒徑，平均粒徑為9.20 μm。

2.5 蟾毒內(nèi)酯類含量測定

稱取3 批0.10 g 微球，置于圓底燒瓶中，加50 mL甲醇，稱重?；亓骷訜? h，放冷，再次稱重，差值用甲醇補(bǔ)足，濾過，取1 mL 續(xù)濾液置于20 mL 量瓶中，定容，為供試品溶液，制作3 份按上述高效液相色譜條件進(jìn)行檢測，測得總載藥量平均值為6.06 mg/g。見表3。

表3 蟾毒內(nèi)酯類成分的載藥量(mg/g，n=3)

2.6 包封率測定

精密稱取蟾酥殼聚糖微球25 mg，加入10 mL 甲醇，超聲提取，放置過夜后將微球研磨，3000 r/min 離心5 min，取上清液置于10 mL 容量瓶中定容，過微孔濾膜，10 μL 進(jìn)樣測定含量，計(jì)算包封率[20]，微球的平均包封率為73.30%。見表4。

表4 包封率測定結(jié)果(n=3)

2.7 吲哚生物堿類含量測定

取微球0.10 g，置入圓底燒瓶中，加50 倍水，回流加熱1 h，提取3 次，冷卻，過濾，取續(xù)濾液，倒入100 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度作為供試品溶液[21-22]。制作3 份在波長556 nm 處測定吸光度，平均含量為6.59 mg/g。見表5。

表5 吲哚生物堿類含量(n=3)

2.8 體外溶出度

依據(jù)2020 版藥典[23]，采用漿法測定釋放度，溶出介質(zhì)為人工胃液和人工腸液[24]。取蟾酥微球和蟾酥原料藥，入透析袋，置于不同的溶出杯中。溫度：(37.0±0.1)℃，轉(zhuǎn)速：(100±1)r/min，介質(zhì)量：1000 mL，分別在20、60、120、180、240、300、360、420、480、540、600 min 時(shí)取1 mL，過膜，差值采用人工胃液或人工腸液進(jìn)行補(bǔ)足，直到達(dá)到平衡，見圖3。釋放度實(shí)驗(yàn)說明：與蟾酥原料藥比較，蟾酥殼聚糖微球具有很好的緩釋效果。

圖3 蟾酥在人工腸液及人工胃液中的溶出曲線

3 討論

3.1 殼聚糖微球的制備

造成最后制得的微球載藥量小，可能是由于應(yīng)用的1%的殼聚糖含量少，大部分是水分。也可能是由于在放置過夜脫泡時(shí)蟾酥隨乙醇有部分揮發(fā)或在倒入離心杯時(shí)有損失又或者在用石油醚洗滌下層時(shí)有損失等；在制做微球的過程中，本研究用乙醇溶解，是因?yàn)橐掖驾^甲醇對(duì)人體內(nèi)的危害性小，毒性小，安全性高。

為提高蟾酥的生物利用度，本研究將蟾酥制成具有緩釋效果的殼聚糖微球，為減小殼聚糖溶液的黏稠度及更易于乳化，在水相中加入了乙醇，加戊二醛目的是防止微球粘連，使其更易固化。

3.2 蟾酥的溶出

對(duì)藥物釋放速率產(chǎn)生影響的因素有：微球粒徑大小不同、囊膜的薄厚不同或骨架、制備工藝的不同、藥物自身的劑型等[25-27]。通過上述實(shí)驗(yàn)可以看出殼聚糖微球在人工胃液及人工腸液中有很好的緩釋作用，可減少藥物含量在血液中波動(dòng)及給藥次數(shù)，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

對(duì)蟾酥的劑型研究，通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)為降低蟾酥的毒性，人們把蟾酥制成各種劑型，如：脂質(zhì)體、自微乳以及β 環(huán)糊精等，但是沒有發(fā)現(xiàn)把蟾酥制成以殼聚糖為載體的微球，因此把蟾酥制成微球，研究蟾酥殼聚糖微球在體外的釋藥特性，為進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)的動(dòng)物試驗(yàn)提供依據(jù)及為最后應(yīng)用于臨床奠定基礎(chǔ)。