孟繼秋，胡驍飛，王 耀，邢云瑞，曹金博，陳琳琳，孫亞寧，張改平,3

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002； 2.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471003； 3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南 鄭州 450002)

6-芐基腺嘌呤(6-benzylaminopurine,6-BA)是第一個人工合成的廣泛應(yīng)用于植物生長培養(yǎng)基的細(xì)胞分裂素[1]，在植物體內(nèi)通常以核糖加合物6-BAR的形式存在[2]，6-BA分子式為C12H11N5，6-BA與6-BAR的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。6-BA難溶于水，微溶于乙醇，在酸、堿中穩(wěn)定。6-BA具有抑制植物葉綠素、核酸、蛋白質(zhì)的分解，并能將氨基酸、生長素、無機(jī)鹽等向處理部位調(diào)運(yùn)等多種效能而被廣泛使用于植物生長的各個環(huán)節(jié)[3]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，6-BA具有縮短豆芽生長周期、促進(jìn)莖的生長和抑制生根的作用而被濫用于豆芽生產(chǎn)中[4]。然而大量的研究結(jié)果顯示，6-BA在豆芽內(nèi)不易代謝，而且商家為了牟取暴利經(jīng)常過量添加導(dǎo)致其在豆芽中殘留，人食用含有6-BA的豆芽會造成生殖系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，還會導(dǎo)致性早熟[5]，甚至?xí)鸺毙灾卸竞驼T發(fā)癌癥[6]。因此，國家食品藥品監(jiān)督管理總局、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和國家衛(wèi)生和計劃生育委員會在2015年聯(lián)合發(fā)布公告[7]，嚴(yán)禁在豆芽生產(chǎn)過程中使用6-BA。但在利益的驅(qū)使下，仍有不法商家在豆芽的生產(chǎn)過程中違法添加6-BA，毒豆芽事件頻發(fā)，對食品安全造成嚴(yán)重威脅。

為了防止6-BA在豆芽中的違規(guī)濫用，保證食品安全，科研人員建立了多種檢測6-BA的方法，主要包括高效液相色譜法(High-performance liquid chromatography,HPLC)[8-9]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)[10-11]、表面增強(qiáng)拉曼光譜法(Surface-enhanced raman spectroscopy,SERS)[12-13]、電化學(xué)方法[14]和免疫學(xué)檢測方法[15]等。HPLC和SERS具有準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，但存在儀器昂貴和步驟繁瑣等弊端；電化學(xué)方法雖然簡單快速，但其結(jié)果受環(huán)境等因素影響，波動較大。相比之下，免疫學(xué)檢測方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，且耗時短、效率高，適用于大批量樣品的快速篩查[16]。目前，免疫學(xué)檢測方法已經(jīng)成功應(yīng)用于2,4-D和赤霉素等植物生長調(diào)節(jié)劑的快速檢測[17-18]，有關(guān)6-BA的免疫學(xué)檢測方法則較少，LI等[19]用碳二亞胺法合成6-BA人工抗原并制備6-BA單克隆抗體，以此抗體建立的膠體金層析試紙檢測限可達(dá)到10 μg/L。由于6-BA進(jìn)入豆芽后會部分代謝成為其核糖加合物6-BAR，可能會影響到檢測的結(jié)果，且由于6-BA是小分子物質(zhì)，屬于半抗原，不具備直接刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體的能力，必須要與大分子載體蛋白偶聯(lián)制備人工完全抗原。因此，采用高碘酸鹽法將6-BAR與載體蛋白結(jié)合制備完全抗原，通過免疫小鼠制備出既可以檢測豆芽中已經(jīng)代謝的6-BAR又可以檢測生產(chǎn)豆芽用水中未被代謝的6-BA多克隆抗體，并對多克隆抗體進(jìn)行特性鑒定，為建立6-BA的ELISA快速檢測方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與溶液 6-BA、6-BAR、弗氏不完全佐劑(Freund’s incomplete adjuvant,FIA)、羊抗鼠酶標(biāo)二抗(GaMIgG-HRP)、弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant,FCA)、牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)等均購自Gibco公司；高碘酸鈉(Na5IO6)、乙二醇(CH2OH)2購自阿拉丁公司；硼氫化鈉(NaBH4)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為市售分析純，所用緩沖溶液均由本實(shí)驗(yàn)室自行配制。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 6周齡BALB/c小鼠購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，由實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)。

1.1.3 儀器 Nanodrop One微量核酸蛋白質(zhì)含量測定儀購自美國Thermo Fisher公司；DYY-6C型電泳儀購自北京市六一儀器廠；ME204E 型電子天平購自德國Mettler Toledo公司；ChemiDocTMXRS+型凝膠成像儀、550型酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 人工抗原合成 采用高碘酸鹽法[20]制備6-BA人工抗原，合成路線如圖2所示。準(zhǔn)確稱取6-BAR標(biāo)準(zhǔn)品4 mg于離心管中，用2 mL甲醇溶解后再加2 mL 稀釋液(pH值為7.4的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，PBS)稀釋至1 g/L，邊攪拌邊向溶液中滴加2 mL濃度為0.01 mol/L高碘酸鈉溶液，將反應(yīng)液于室溫下攪拌30 min，然后滴加360 μL濃度為0.1 mol/L的乙二醇溶液，室溫下攪拌10 min。準(zhǔn)確稱取BSA 16 mg溶于4 mL PBS中，將上述反應(yīng)液緩慢滴入BSA溶液中，用5%的K2CO3調(diào)pH值至9.3，室溫攪拌1 h，每隔30 min滴加1次2 mL質(zhì)量濃度為1 g/L的硼氫化鈉溶液，共滴加2次，將反應(yīng)液用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)pH值至6.5，4 ℃攪拌1 h。最后將反應(yīng)液移至透析袋中，在4 ℃環(huán)境下以PBS為透析液透析3 d，間隔8 h更換1次透析液，透析結(jié)束后即得6-BAR-BSA人工抗原，放入-20 ℃冰箱保存。同方法制備包被抗原6-BAR-OVA。

1.2.2 人工抗原鑒定

1.2.2.1 紫外掃描鑒定 用Nanodrop One微量核酸蛋白質(zhì)含量測定儀檢測6-BAR-BSA溶液的質(zhì)量濃度，用PBS配制質(zhì)量濃度為1 g/L的6-BAR-BSA、BSA、6-BA-OVA、OVA溶液，用甲醇與PBS體積比為1∶1的溶液配制6-BAR標(biāo)準(zhǔn)溶液，以PBS溶液作為空白基線，利用Nanodrop One微量核酸蛋白質(zhì)濃度測定儀對其在220～320 nm波長進(jìn)行掃描，根據(jù)最大吸收峰位置變化初步判定偶聯(lián)效果。

1.2.2.2 SDS-PAGE鑒定 參照文獻(xiàn)[21]的方法配制電泳緩沖溶液，濃縮膠體積分?jǐn)?shù)為5%，分離膠體積分?jǐn)?shù)為12%，電壓選擇80 V，上樣量為10 μg，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。染色2～3 h，脫色12 h，每4 h更換一次脫色液，通過對比分子質(zhì)量大小變化判斷偶聯(lián)效果。

1.2.3 6-BA多克隆抗體制備 選擇4只6周齡雌性BALB/c小鼠，首次免疫用無菌PBS將免疫原6-BAR-BSA質(zhì)量濃度稀釋至500 mg/L，加入等體積FCA，經(jīng)乳化后以每只50 μg的劑量采用背部皮下4點(diǎn)注射方法免疫。后3次免疫用FIA與免疫原等體積混合，其他操作步驟與首免完全相同。免疫間隔21 d。2免后每次免疫后間隔10 d斷尾采血，5 000 r/min離心10 min后取上清凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 6-BA多克隆抗體鑒定

1.2.4.1 包板 用包被液(pH值為9.6的0.05 mol/L的CBS)將包被抗原6-BAR-OVA稀釋至0.5 mg/L，取96孔聚苯乙烯板，每孔加入100 μL稀釋后的包被抗原，放37 ℃恒溫孵育2 h，用PBST(含有0.05% Tween-20的PBS溶液)洗板4次后拍干，每孔加滿封閉液(5%脫脂奶粉溶液)，37 ℃孵育2 h或4 ℃孵育過夜，PBST洗板4次后拍干放4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2 6-BA多克隆抗體效價測定 間接ELISA法[22]測定6-BA多克隆抗體效價。取已包被6-BAR-OVA的聚苯乙烯板，每孔加入100 μL PBS鋪底，第1排加入1∶100倍稀釋的小鼠血清后倍比稀釋至倒數(shù)第2排，并設(shè)立空白，放37 ℃恒溫孵育15 min；PBST洗板4次后拍干，每孔加入100 μL用封閉液稀釋500倍的GaMIgG-HRP，37 ℃孵育30 min；PBST洗板4次，甩干后每孔加入100 μL顯色液(TMB 磷酸-檸檬酸緩沖液)，顯色10 min后，每孔加100 μL終止液(2 mol/L的硫酸溶液)并讀取OD450值，當(dāng)OD450值>0.2，且與空白孔OD450值之比>2.1時判定為陽性孔。陽性孔的最高血清稀釋倍數(shù)即為血清效價[23]。

1.2.4.3 6-BA多克隆抗體敏感性鑒定 采用間接競爭ELISA法[24]測定6-BA多克隆抗體敏感性。取已包被6-BAR-OVA的聚苯乙烯板，每孔加入100 μL PBS，將質(zhì)量濃度為5.12 mg/L的6-BAR標(biāo)準(zhǔn)品溶液或6-BA標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別作為游離抗原，倍比稀釋至倒數(shù)第3排，留陽性對照孔和空白孔不加游離抗原而加入100 μL PBS；然后除空白孔外，每孔加入100 μL效價測定時OD450值為1.0左右孔的前一孔所對應(yīng)稀釋度的多克隆抗體，其他操作步驟與效價測定相同。以抑制率B/B0為縱坐標(biāo)(其中B為含有不同質(zhì)量濃度游離抗原各孔的OD450值，B0為不加游離抗原孔的OD450值)，以游離抗原質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制抑制曲線，推導(dǎo)線性回歸方程，計算半數(shù)抑制濃度(IC50)，并以IC50值來評定多克隆抗體敏感性。

1.2.4.4 6-BA多克隆抗體特異性鑒定 選擇激動素、赤霉素、4-氯苯氧乙酸鈉、腐霉利、呋喃苯烯酸鈉、BSA、OVA作為競爭物，利用間接競爭ELISA測定多克隆抗體對各競爭物的IC50。以6-BA的IC50與各競爭物的IC50的百分比作為交叉反應(yīng)率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

6-BA多克隆抗體血清抑制試驗(yàn)設(shè)3組平行，取3組數(shù)據(jù)的平均值用Excel 2016和Graph Pad 8作圖并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 6-BA人工抗原鑒定

2.1.1 6-BA人工抗原質(zhì)量濃度測定 用Nanodrop One微量核酸蛋白質(zhì)含量測定儀測得6-BAR-BSA質(zhì)量濃度為3.0 g/L，6-BAR-OVA質(zhì)量濃度為3.6 g/L。

2.1.2 紫外掃描 采用高碘酸鹽法制備6-BA人工抗原后，首先利用UV法對人工抗原進(jìn)行初步鑒定，6-BAR、6-BAR-BSA和BSA紫外掃描圖譜如圖3所示。從圖3可以看出，BSA在278 nm處出現(xiàn)特征吸收峰，6-BAR在270 nm處出現(xiàn)特征吸收峰，而6-BAR-BSA的特征吸收峰介于二者之間，初步推測6-BAR和BSA偶聯(lián)成功。圖4為6-BAR、6-BAR-OVA和OVA紫外掃描結(jié)果，6-BAR-OVA與OVA和6-BAR的特征吸收峰也不重疊。由此推測，6-BAR和OVA偶聯(lián)成功。

2.1.3 SDS-PAGE鑒定 半抗原與載體蛋白偶聯(lián)后會使蛋白質(zhì)分子質(zhì)量變大，從而導(dǎo)致在SDS-PAGE電泳過程中泳動速度變慢。從圖5可以看出，6-BAR-BSA和6-BAR-OVA的泳動速度均小于BSA和OVA，證明6-BAR和與BSA和OVA偶聯(lián)成功。

2.2 6-BA多克隆抗體鑒定

2.2.1 6-BA多克隆抗體效價 在選擇包被質(zhì)量濃度時主要考慮2個因素，首先是提高靈敏度，其次是節(jié)約包被原。采用棋盤滴定法確定最適包被質(zhì)量濃度，包被質(zhì)量濃度依次為0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000 mg/L，采用間接ELISA法測其OD450值。由圖6可見，包被質(zhì)量濃度過高時，間接ELISA測定的OD450值并沒有明顯提高，不僅浪費(fèi)包被原且還會降低間接競爭ELISA的檢測靈敏度。因此，選擇吸光值基本不變的最低包被質(zhì)量濃度作為最佳包被質(zhì)量濃度，不但可以大大提高靈敏度，更節(jié)約了檢測成本。當(dāng)包被質(zhì)量濃度低于0.5 mg/L時，吸光值明顯降低。因此，選擇最低包被質(zhì)量濃度0.5 mg/L來測定血清效價以及靈敏度。

由表1可以看出，用6-BAR-BSA免疫小鼠可以刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，4免后4只小鼠血清效價均在1∶51 200以上，其中2號小鼠血清效價最高達(dá)到1∶204 800?？梢?，制備的人工抗原能刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生抗體，6-BA人工抗原合成成功。

2.2.2 6-BA多克隆抗體敏感性 由表2可以看出，4免后6-BA對4只小鼠血清抑制效果明顯，且對2號小鼠血清抑制效果最好，在最適包被質(zhì)量濃度下，其抑制曲線如圖7所示，線性回歸方程為y=-0.175 1x+0.698 3，R2=0.995 3，且在(IC20～I(xiàn)C80)0.26～701.45 μg/L具有良好的線性關(guān)系，IC50為13.48 μg/L。由表3可以看出，6-BAR對4只小鼠血清也均有抑制效果。對2號小鼠血清的抑制曲線如圖8所示，線性回歸方程為y=-0.185 4x+0.732 6，R2=0.993 2，IC50為17.95 μg/L。以上結(jié)果表明，本研究制備的多克隆抗體可以與6-BA或其代謝物結(jié)合。

表3 6-BA多克隆抗體對6-BA間接競爭ELISA測定結(jié)果Tab.3 Indirect competitive ELISA results of 6-BA polyclonal antibody against 6-BA

2.2.3 6-BA多克隆抗體特異性 由表4可知，6-BA與6-BAR的交叉反應(yīng)率為75.10%，與激動素、赤霉素、4-氯苯氧乙酸鈉、腐霉利、呋喃苯烯酸鈉、BSA、OVA交叉反應(yīng)率均低于0.01%。交叉反應(yīng)率越低，則說明特異性越強(qiáng)[25]?？梢姡狙芯恐苽涞?-BA多克隆抗體特異性強(qiáng)。

表4 6-BA多克隆抗體與競爭物的交叉反應(yīng)Tab.4 The cross-reactivity of 6-BA polyclonal antibody with competimer

3 結(jié)論與討論

6-BAR含有鄰二醇結(jié)構(gòu)，可以被高碘酸鹽氧化成為醛基，然后與蛋白質(zhì)分子中的氨基形成Schiff氏堿[26]，因此本研究采用高碘酸鈉法把6-BAR與載體蛋白進(jìn)行了偶聯(lián)，相較于LI等[19]采用的碳二亞胺法，這個方法的優(yōu)點(diǎn)是條件溫和，不需要復(fù)雜的合成反應(yīng)，可以在常溫常壓和中性pH值條件下進(jìn)行。通過免疫小鼠得到高敏感性的多克隆抗體，證明以此方法合成人工抗原可以較好地保證抗原決定簇的完整性。由于6-BAR與6-BA具有相似的結(jié)構(gòu)，其抗原決定簇可能相似。本研究結(jié)果表明，用6-BAR制備的多克隆抗體對6-BAR和6-BA都具有較好的敏感性，可以同時檢測生產(chǎn)豆芽用水中的6-BA和豆芽中已經(jīng)代謝的6-BAR。

本研究采用高碘酸鹽法合成6-BAR人工抗原，通過免疫小鼠得到效價在1∶51 200以上的多克隆抗體，2號小鼠血清對6-BA和6-BAR均有較好的敏感性，在0.26～701.45 μg/L時線性關(guān)系良好，其檢測6-BA的IC50為13.48 μg/L，對6-BAR的IC50為17.95 μg/L，與激動素、赤霉素、4-氯苯氧乙酸鈉、腐霉利、呋喃苯烯酸鈉、BSA、OVA的交叉反應(yīng)率在0.01%以下。目前，已報道的高效液相色譜法[8-9]、電化學(xué)檢測方法[14]等6-BA儀器檢測方法的檢測限在10 μg/L左右，與本研究結(jié)果差距不大。通過細(xì)胞融合制備的單克隆抗體靈敏度比相應(yīng)的多克隆抗體的靈敏度提高10倍甚至更高[25]，因此，以6-BA單克隆抗體建立的免疫學(xué)檢測方法相較于傳統(tǒng)的儀器檢測方法不僅會提高檢測速度和降低檢測成本，且在靈敏度上也將具有一定優(yōu)勢。

綜上，本研究采用高碘酸鹽法成功合成了6-BA人工抗原，通過免疫小鼠制備了敏感性好、特異性強(qiáng)的多克隆抗體。