劉守柱，張蕾蕾，胥佳睿，姜曉嬌，鄭 暖，于迎鑫

(聊城大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東 聊城 252059)

萊氏綠僵菌(Metarhiziumrileyi)舊稱萊氏野村菌(Nomuraearileyi)[1]，是一種在自然界廣泛存在的昆蟲病原菌，可寄生多種鱗翅目害蟲，尤其是對(duì)夜蛾科害蟲具有明顯的致病效果，其寄主種類多達(dá)60種以上，可以作為生防制劑進(jìn)行使用[2-3]。利用昆蟲病原微生物進(jìn)行害蟲防治具有對(duì)環(huán)境友好、對(duì)天敵安全、對(duì)人畜無害等諸多優(yōu)點(diǎn)，但由于病原菌從侵染到發(fā)病需要較長的時(shí)間，導(dǎo)致生物防治見效慢，因而未能得到大面積應(yīng)用[4]。如108個(gè)/mL萊氏綠僵菌處理3齡斜紋夜蛾幼蟲后，致死中時(shí)(LT50)為5.5～6.6 d[5]，對(duì)4齡、5齡幼蟲的LT50則延長至9.8～11 d[6]，致死速度慢是制約M.rileyi應(yīng)用最主要的瓶頸。

眾所周知，昆蟲病原真菌的侵染過程首先是以孢子附著到昆蟲體壁，然后萌發(fā)形成芽管或附著孢[7]，繼而分泌蛋白酶、幾丁質(zhì)酶等對(duì)昆蟲體壁進(jìn)行降解[8-12]，芽管穿透體壁進(jìn)入昆蟲血腔后，在寄主體內(nèi)以蟲菌體(Hyphal body)的形式進(jìn)行增殖，蟲菌體形成菌絲后再殺死寄主[13-14]。在此過程中，成功突破昆蟲體壁并進(jìn)入昆蟲血腔的孢子數(shù)量越多，致死速度越快，表皮(Cuticle)是昆蟲抵抗真菌侵染的主要屏障[15]。但是，由于孢子萌發(fā)易受到溫度、濕度、紫外線照射等環(huán)境因素的影響，因而表皮穿透效率較難提高。

相對(duì)于提高孢子的體壁穿透效率，化學(xué)農(nóng)藥與微生物農(nóng)藥混合使用時(shí)能更快地提高病原菌的致死速度，如低劑量聯(lián)苯菊酯對(duì)金龜子綠僵菌(M.anisopliae)具有協(xié)同增效作用[16]，可以明顯縮短M.anisopliae對(duì)亞洲小車蝗的致死時(shí)間。鑒于此，測(cè)定了亞致死劑量高效氯氰菊酯與M.rileyi聯(lián)合使用對(duì)斜紋夜蛾(Spodopteralitura)的致死作用，旨在為提高M(jìn).rileyi對(duì)害蟲的致死速度提供有效的技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 供試藥劑及菌株

95%高效氯氰菊酯原藥、萊氏綠僵菌(M.rileyi)Nr5772均由聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院昆蟲研究室提供。高效氯氰菊酯用丙酮溶解后，用0.1%吐溫-80水稀釋成100 mg/L母液備用。M.rileyi接種在薩氏麥芽糖酵母瓊脂(SMAY)培養(yǎng)基上，在光照培養(yǎng)箱中25 ℃恒溫培養(yǎng)7～8 d，培養(yǎng)皿長滿孢子后備用。

1.2 供試?yán)ハx及飼養(yǎng)

斜紋夜蛾第1代采購于河南科云生物公司，在人工氣候室內(nèi)(25 ℃，光暗比=16∶8)用人工飼料進(jìn)行飼養(yǎng)，飼料的配制參考文獻(xiàn)[17]的方法。斜紋夜蛾1—3齡幼蟲放在200 mL養(yǎng)蟲盒內(nèi)集中飼養(yǎng)，4齡后轉(zhuǎn)到30 mL小盒內(nèi)單獨(dú)飼養(yǎng)。

1.3 高效氯氰菊酯對(duì)斜紋夜蛾的毒力測(cè)定

將高效氯氰菊酯配制成0.625～10 mg/L梯度溶液，采用浸漬法測(cè)定其對(duì)3、4、5齡斜紋夜蛾幼蟲的致死中濃度(LC50)及10%致死濃度(LC10)，以LC10劑量作為亞致死劑量。試驗(yàn)時(shí)，挑選生長基本一致的各齡期幼蟲，在不同濃度藥液中浸漬10 s，然后放在吸水紙上吸干多余藥液，2 h后檢查供試幼蟲死亡數(shù)量。每濃度處理試蟲20頭，重復(fù)3次，以0.1%吐溫-80水處理作為對(duì)照。

1.4 M.rileyi對(duì)斜紋夜蛾的毒力測(cè)定

把培養(yǎng)好的M.rileyi孢子從平板上刮到50 mL離心管中，加入適量0.1%吐溫-80水，在漩渦混合儀上充分振蕩混勻，調(diào)整濃度為1×109個(gè)/mL，10倍梯度稀釋成1×108、1×107、1×106、1×105個(gè)/mL孢子懸浮液。挑選蛻皮1 d左右的5齡幼蟲，分別在上述懸浮液中浸漬10 s，然后放在培養(yǎng)皿中自然晾干。每個(gè)濃度孢子懸浮液處理20頭試蟲，以0.1%吐溫-80水處理作為對(duì)照，重復(fù)3次，按1.2的方法進(jìn)行飼養(yǎng)，每隔12 h檢查死亡蟲數(shù)，直至全部死亡或化蛹。

1.5 高效氯氰菊酯與M.rileyi的聯(lián)合毒力測(cè)定

為了保證試驗(yàn)的一致性，選擇5齡幼蟲進(jìn)行毒力測(cè)定。以高效氯氰菊酯對(duì)5齡幼蟲的LC10作為亞致死劑量，配制藥液，然后，用此藥液按1.4的方法配制1×105～1×109個(gè)/mLM.rileyi孢子懸浮液，并進(jìn)行聯(lián)合毒力測(cè)定，以亞致死劑量的高效氯氰菊酯藥液作為對(duì)照，對(duì)試驗(yàn)最終死亡率進(jìn)行校正。為保證死亡的試蟲均是由于M.rileyi寄生所致，各處理48 h內(nèi)死亡蟲數(shù)不予統(tǒng)計(jì)，并從試蟲總數(shù)中剔除，以消除高效氯氰菊酯對(duì)斜紋夜蛾的急性毒性。

1.6 亞致死劑量高效氯氰菊酯對(duì)M.rileyi孢子萌發(fā)及菌絲生長的影響

根據(jù)1.3中測(cè)定結(jié)果，配制亞致死劑量的高效氯氰菊酯溶液，接種適量M.rileyi孢子粉，渦旋振蕩混勻，25 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)96 h，每隔24 h用血球計(jì)數(shù)板觀察孢子的萌發(fā)情況并計(jì)數(shù)，計(jì)算孢子萌發(fā)率。同時(shí)，以不含藥劑的0.1%吐溫-80水作為對(duì)照。

制作高效氯氰菊酯含量為亞致死劑量的帶藥SMAY平板，每皿接種3滴(5 μL)孢子懸液，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，觀察測(cè)量菌落直徑。以不含藥劑的SMAY平板作為對(duì)照。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

LC50及LT50采用DPS 7.05軟件的生物測(cè)定功能進(jìn)行計(jì)算，致死效果先進(jìn)行反正弦平方根轉(zhuǎn)換，然后采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性測(cè)定。

2 結(jié)果及分析

2.1 高效氯氰菊酯對(duì)斜紋夜蛾的毒力

由表1可見，高效氯氰菊酯對(duì)3、4、5齡的斜紋夜蛾幼蟲毒力較強(qiáng)，其LC50分別為0.882 8、1.500 2、3.015 4 mg/L，LC10分別為0.171 5、0.184 5、0.537 8 mg/L。低齡幼蟲對(duì)高效氯氰菊酯的抵抗力較弱，容易死亡，為了便于試驗(yàn)操作，選擇較大的5齡幼蟲進(jìn)行聯(lián)合毒力測(cè)定，其亞致死劑量定為0.5 mg/L。

表1 高效氯氰菊酯對(duì)斜紋夜蛾的毒力測(cè)定結(jié)果

2.2 單獨(dú)使用M.rileyi對(duì)斜紋夜蛾的致死效果

由表2可見，M.rileyi孢子對(duì)斜紋夜蛾5齡幼蟲有明顯的致死效果，隨著孢子濃度增大，LT50明顯縮短，但孢子濃度較低時(shí)，對(duì)斜紋夜蛾的累計(jì)致死率不是很高，1×105個(gè)/mL處理最終死亡率僅有26.67%，大部分個(gè)體均能成功化蛹；濃度超過1×108個(gè)/mL時(shí)，累計(jì)致死率接近或達(dá)到100%，說明高劑量處理效果好。M.rileyi單獨(dú)使用對(duì)斜紋夜蛾5齡幼蟲的LC50為8.22×105個(gè)/mL。

表2 萊氏綠僵菌對(duì)斜紋夜蛾5齡幼蟲的致死效果

2.3 亞致死劑量高效氯氰菊酯對(duì)M.rileyi的增效作用

0.5 mg/L高效氯氰菊酯與M.rileyi聯(lián)合使用有效縮短了M.rileyi對(duì)斜紋夜蛾的LT50，降低LC50(表3)，說明高效氯氰菊酯在LC10劑量下對(duì)M.rileyi有一定的增效作用。從表2、表3可以看出，雖然M.rileyi各劑量處理LT50沒有大幅縮短，但低劑量1×105個(gè)/mL與1×106個(gè)/mL處理首次觀察到試蟲死亡的時(shí)間較未添加高效氯氰菊酯的處理均提前12 h，高劑量1×108個(gè)/mL處理試蟲由95.00%死亡率提高到100.00%，1×109個(gè)/mL處理組全部死亡時(shí)間則由144 h提前至132 h。

表3 萊氏綠僵菌與亞致死劑量高效氯氰菊酯聯(lián)合使用對(duì)斜紋夜蛾5齡幼蟲的致死效果 Tab.3 Lethal effect of M.rileyi combined with sublethal dose of beta-cypermethrin against 5th instar larvae of S.litura

雖然從累計(jì)致死率及LT50絕對(duì)值分析，添加高效氯氰菊酯后，M.rileyi各劑量處理均獲得一定的增效，但從數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果來看，并不是所有的增幅都有差異顯著性(圖1)。低劑量處理增效作用最明顯，隨著孢子濃度增加，增效作用逐漸降低，高劑量處理則沒有增效作用。

2.4 亞致死劑量高效氯氰菊酯對(duì)M.rileyi孢子萌發(fā)和菌絲生長的影響

M.rileyi孢子接種到亞致死劑量的高效氯氰菊酯溶液中后，24 h內(nèi)未見萌發(fā)，48 h后萌發(fā)率達(dá)到0.17%，72 h后萌發(fā)率為2.00%，96 h萌發(fā)率為5.83%。M.rileyi孢子在0.1%的吐溫-80溶液中(對(duì)照)的萌發(fā)率與在高效氯氰菊酯溶液的萌發(fā)率沒有顯著差異(圖2A)，說明亞致死劑量高效氯氰菊酯不會(huì)抑制M.rileyi孢子萌發(fā)。

將M.rileyi孢子接種到含高效氯氰菊酯帶藥平板后，2～3 d即可形成明顯的菌落，7 d后已經(jīng)大量產(chǎn)孢，藥劑處理和對(duì)照處理的平均菌落直徑分別為1.15 cm 和1.24 cm，經(jīng)方差分析差異不顯著，說明高效氯氰菊酯0.5 mg/L處理不會(huì)影響M.rileyi菌絲生長和產(chǎn)孢(圖2B)。

3 結(jié)論與討論

從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，高效氯氰菊酯亞致死劑量(0.5 mg/L)對(duì)M.rileyi有一定的增效作用，尤其是在孢子濃度較低時(shí)增效作用最明顯，但對(duì)高濃度孢子的增效作用甚微。分析原因認(rèn)為，低濃度下，單位時(shí)間內(nèi)孢子萌發(fā)并穿透昆蟲體壁的總體數(shù)量較低，但在高效氯氰菊酯的作用下，昆蟲處于輕度中毒狀態(tài)，其表皮在藥劑的作用下可能會(huì)發(fā)生一定的結(jié)構(gòu)改變，有利于病菌的體壁穿透，因而成功入侵的孢子數(shù)量上升，提高了致死效果。受條件限制，本研究未觀察亞致死劑量的高效氯氰菊對(duì)昆蟲體壁的破壞作用，但胡安嶺等[18]報(bào)道，甲氧蟲酰肼及氟鈴脲可以改變甜菜夜蛾的體壁結(jié)構(gòu)，從而提高球孢白僵菌的殺蟲效果，兩者或許有類似之處。此外，亞致死劑量的藥劑在一定程度上可以抑制昆蟲的生長發(fā)育，使得蛻皮時(shí)間延長，進(jìn)而延長了孢子的侵染過程，最終導(dǎo)致病原菌致死效果提高。如亞致死劑量的高效氯氰菊酯抑制棉鈴蟲的生長發(fā)育，延長幼蟲的發(fā)育歷期[19]。殺蟲劑的這種亞致死效應(yīng)普遍存在于各種昆蟲中[20]。

多年以來，殺蟲速度慢、效果不穩(wěn)定一直是制約生物農(nóng)藥尤其是微生物農(nóng)藥應(yīng)用的主要因素。研究M.rileyi在昆蟲體內(nèi)的發(fā)育過程可以發(fā)現(xiàn)，一旦病原菌成功入侵到昆蟲體內(nèi)，即可逃避寄主的免疫防御，在寄主血腔中穩(wěn)定、自由地繁殖，直至殺死寄主[13]。顯然，增加病原菌孢子對(duì)寄主的表皮穿透效率可以縮短病程，提高致死速度。研究表明，在孢子懸浮液中添加外源營養(yǎng)成分，如甘露糖和維生素C，可以提高孢子萌發(fā)率[21]，該措施可能會(huì)提高病原菌的穿透率，但尚缺乏進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究中，雖然高效氯氰菊酯對(duì)M.rileyi有增效作用，但在亞致死劑量下既不提高孢子萌發(fā)率，也不會(huì)抑制孢子萌發(fā)和菌絲生長，顯示該藥的增效作用不是直接作用于M.rileyi的生長過程，而是來源于藥劑對(duì)昆蟲體壁的破壞，或打亂寄主正常的發(fā)育過程從而提高侵染效率，即藥劑的亞致死效應(yīng)是提高生防菌效果最重要的因素。與本研究結(jié)果類似，聯(lián)苯菊酯對(duì)金龜子綠僵菌[16]、氟鈴脲對(duì)白僵菌[18]、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽和氯蟲苯甲酰胺對(duì)白僵菌[22]、咪鮮胺對(duì)枯草芽孢桿菌[23]都有增效作用，說明化學(xué)農(nóng)藥與生物農(nóng)藥混用是解決昆蟲病原菌致死速度慢的有效途徑。

不僅如此，昆蟲病原菌與化學(xué)農(nóng)藥，尤其是低劑量農(nóng)藥混用，除了提高病原菌的殺蟲效果以外，也可以降低或消除由于農(nóng)藥亞致死效應(yīng)所導(dǎo)致的害蟲產(chǎn)卵能力提高、抗藥性提高等不利因素[20,24]，對(duì)農(nóng)藥的生態(tài)毒理研究具有積極的意義。