李聰聰，張世軍，王紅彩，張依盼，霍 永，姜東鳳，宋素芳,2，牛 暉,3，姬向波，李婉濤

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 鄭州 450046； 2.河南省畜禽遺傳資源保護(hù)工程技術(shù)研究中心， 河南 鄭州 450046； 3.鄭州市動(dòng)物生殖分子調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046； 4.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046； 5.河南省非常規(guī)飼料資源創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046)

中國作為豬肉消費(fèi)大國，生豬規(guī)模化養(yǎng)殖在不斷地?cái)U(kuò)大，對(duì)豬流行性疾病的預(yù)防和治療也顯得越來越重要。目前，豬場(chǎng)流行性疾病可以分為細(xì)菌性疾病和病毒性疾病兩大類，而病毒性疾病是防治的重中之重。豬偽狂犬病(PR)是由豬偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一種病毒性疾病，病死率高達(dá)80%～100%[1]，其中斷奶仔豬死亡率10%～20%[2]，嚴(yán)重影響種豬場(chǎng)生產(chǎn)。PRV屬于皰疹病毒科、豬皰疹病毒屬，宿主幾乎包含了所有的哺乳動(dòng)物以及其他脊椎動(dòng)物。PRV能在多種組織培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)增殖，其中以兔腎和豬腎細(xì)胞最為敏感，可以引起明顯的細(xì)胞病變[3]。PRV可以編碼11種糖蛋白，分別是gN、gM、gL、gK、gI、gH、gE、gG、gD、gB和gC糖蛋白，其中g(shù)D糖蛋白不僅參與了病毒侵染宿主細(xì)胞的整個(gè)過程[4]，還是PRV主要的免疫原性糖蛋白之一，在PRV感染宿主的過程中有著重要的作用。 因此，gD基因的表達(dá)量變化能夠反映PRV的增殖情況。

干擾素(Interferon,IFN)是一種糖蛋白，由英國科學(xué)家ISSAACS和LINDENMENN于1957年首先發(fā)現(xiàn)。根據(jù)基因的組成和蛋白質(zhì)的功能，可以將IFN分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，Ⅰ型IFN通過誘導(dǎo)自噬參與細(xì)胞清除[5]，在急性感染中主要起保護(hù)作用[6]；Ⅱ型IFN主要在宿主早期抗感染過程中起重要作用[7]；Ⅲ型IFN主要是在上皮細(xì)胞表面表達(dá)，其在上皮細(xì)胞對(duì)抗病毒中起著重要作用[8]。Ⅰ型和Ⅱ型IFN通常起協(xié)同作用，激活多種適應(yīng)性免疫活動(dòng)，從而參與病原體感染的整個(gè)過程[9]。其中，Ⅰ型IFN包括IFNα、IFNβ、1FNδ、IFNε等亞型；Ⅱ型IFN主要是指IFNγ，是在人類第9號(hào)染色體新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子；Ⅲ型IFN主要是指IFNλ，發(fā)現(xiàn)較晚。研究表明，IFNα是由病毒感染白細(xì)胞后產(chǎn)生，IFNβ是由病毒感染成纖維細(xì)胞后產(chǎn)生，IFNγ是由抗原刺激細(xì)胞產(chǎn)生[10]。IFN能夠在動(dòng)物體內(nèi)合成抗病毒蛋白來抑制病毒多肽鏈的形成，從而阻止病毒的增殖[11]。Ⅰ型IFN可以通過受體信號(hào)通路將信號(hào)傳遞到下游調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，間接參與免疫功能的調(diào)節(jié)[12]。Ⅱ型IFNγ可以促使感染病毒的細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞產(chǎn)生MHC Ⅱ型分子[13]。目前，有關(guān)Ⅰ型和Ⅱ型IFN影響PRV在宿主細(xì)胞中增殖的研究報(bào)道相對(duì)較少[14]。

IFN并不能直接作用于病毒發(fā)揮其抗病毒功能，而是與細(xì)胞表面的IFN受體結(jié)合，通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)器促進(jìn)大量干擾素刺激基因(Interferon stimulated gene,ISG)的表達(dá)，ISG的大量表達(dá)可以使機(jī)體處于一種抗病毒狀態(tài)[15]。ISG15(Interferon-stimulated gene 15,ISG15)是最早發(fā)現(xiàn)的ISG之一[16]，是在Ⅰ型干擾素的誘導(dǎo)下表達(dá)能力最強(qiáng)的刺激基因之一[17]。白細(xì)胞介素1β(IL1β)是在免疫反應(yīng)中或者炎癥狀態(tài)下由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)造血、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞等方面發(fā)揮重要作用[18]。白細(xì)胞介素6(IL6)是T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、參與炎癥反應(yīng)及應(yīng)激反應(yīng)等多種生物學(xué)功能。白細(xì)胞介素10(IL10)是一種抗炎細(xì)胞因子，由單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞分泌，能夠在轉(zhuǎn)錄水平抑制炎癥因子IL1β、IL6、IL8、TNFα等的合成[19]，其在炎癥和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮多種作用。有研究表明，IL10和IFN存在相互競(jìng)爭(zhēng)或相互作用誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制，其相對(duì)強(qiáng)度決定了IFN誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄[20]。因此，檢測(cè)與IFN相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)量變化情況，也可以間接反映IFN影響病毒增殖的情況。

IFN在抗病毒以及提升機(jī)體免疫力方面具有十分突出的作用，雖然其具有明顯種屬特異性[21]，但由于其在治療豬的病毒性疾病中有較好效果[22]，在生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛。目前，關(guān)于IFN影響PRV在宿主細(xì)胞中增殖的具體作用機(jī)制未見報(bào)道。鑒于此，研究Ⅰ型IFNα、IFNβ和Ⅱ型IFNγ對(duì)PRV增殖的影響，旨在探討IFN的抗病毒機(jī)制，為IFN防治豬源病毒性疾病奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

豬腎細(xì)胞系(PK15)由河南省非常規(guī)飼料資源創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，PRV HNJY毒株由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院李文剛教授課題組饋贈(zèng)。試驗(yàn)所用引物信息見表1，由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 引物信息Tab.1 Information of primers

1.2 IFNα、IFNβ、IFNγ表達(dá)載體的構(gòu)建

以Ensembl數(shù)據(jù)庫中記錄的豬的IFNα(ENSSSCT00000087954.1)、IFNβ(ENSSSCT00045019653.1)、IFNγ(ENSSSCT00000055560.2)序列為模板設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增豬IFNα、IFNβ、IFNγ基因完整的CDS序列。將擴(kuò)增得到的IFNα、IFNβ、IFNγ基因的CDS序列連接至pcDNA3.1載體，載體構(gòu)建成功后，提取無內(nèi)毒素質(zhì)粒備用。

1.3 PK15細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及攻毒試驗(yàn)

培養(yǎng)PK15細(xì)胞的完全培養(yǎng)基由10%FBS、89%普通高糖DMEM和1%青-鏈霉素組成，以上試劑均購自Hyclone公司。在轉(zhuǎn)染前1 d，按每孔1.2×105個(gè)細(xì)胞的量接種至12孔板，將細(xì)胞置于 5% CO2、飽和濕度的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)到60%～80%，采用Polyplus公司的Jetprime轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，試驗(yàn)組分別為pcDNA3.1-IFNα、pcDNA3.1-IFNβ、pcDNA3.1-IFNγ3個(gè)表達(dá)載體，對(duì)照組(NC)為pcDNA3.1空載體，首次試驗(yàn)在轉(zhuǎn)染24 h后收細(xì)胞，檢測(cè)3個(gè)基因的表達(dá)情況。而后進(jìn)行第2次轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，與前面不同的是，轉(zhuǎn)染24 h后，在生物安全柜中以MOI為1接種PRV HNJY毒株，作用1 h后，PBS洗2次，換2%FBS+98%普通高糖DMEM的維持培養(yǎng)基，分別在接毒后的24、36、48 h收細(xì)胞。

1.4 病毒基因組DNA的提取及gD基因的檢測(cè)

收集細(xì)胞后，采用上海生工生物工程有限公司提病毒基因組試劑盒(貨號(hào)：B518261)，根據(jù)其說明書進(jìn)行病毒基因組提取。將實(shí)驗(yàn)室保存的PRV-gD質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋，在ABI7500系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；以病毒DNA為模板，對(duì)gD基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)分析。15 μL的反應(yīng)體系：7.5 μL 2×SYBR?Green Real-time PCR Master Mix (Toyobo公司)，50 pmol引物，75 ng模板DNA，補(bǔ)水至15 μL。擴(kuò)增程序：預(yù)變性(95 ℃ 30 s)；變性(95 ℃ 5 s)，退火+延伸(60 ℃ 34 s)，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)；溶解曲線(95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s)。

1.5 細(xì)胞總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄PCR以及qPCR

按照Trizol(Invitrogen公司)的說明書提取細(xì)胞的總RNA，用NanoDrop1000(Themo Fisher公司)測(cè)定RNA含量備用。對(duì)提取的細(xì)胞總RNA用DNaseⅠ(Themo Fisher公司)去除基因組DNA，接下來嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(KI622， Themo Fisher公司)的操作說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，而后將得到的cDNA置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。用反轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA作為模板，對(duì)細(xì)胞因子IFNα、IFNβ、IFNγ、ISG15、IL6、IL1β和IL10的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)分析。采用15 μL的反應(yīng)體系：7.5 μL 2×SYBR?Green Real-time PCR Master Mix，50 pmol引物，75 ng模板cDNA，補(bǔ)水至15 μL。擴(kuò)增程序：預(yù)變性(95 ℃ 2 min)；變性(95 ℃ 15 s)，退火+延伸(60 ℃ 1 min)，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)；溶解曲線(95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s)。以GAPDH基因作為內(nèi)參基因，qPCR數(shù)據(jù)分析采用相對(duì)定量2-△△Ct法[23]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Graph Pad Prism 6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及作圖，差異顯著性分析采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 IFN在PK15細(xì)胞中的表達(dá)

將構(gòu)建的3種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，24 h后收細(xì)胞，提取RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過qPCR檢測(cè)IFNα、IFNβ、IFNγ的表達(dá)量(圖1)。從圖1可以看出，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染IFNα、IFNβ、IFNγ重組質(zhì)粒的PK15細(xì)胞中IFN的相對(duì)表達(dá)量均上調(diào)600倍以上，說明3種基因在PK15細(xì)胞中超表達(dá)成功。

2.2 超表達(dá)IFN對(duì)PRV在PK15細(xì)胞中增殖的影響

2.2.1 感染PRV前后PK15細(xì)胞表型變化 待12孔板中的PK15細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)，分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IFNα、pcDNA3.1-IFNβ、pcDNA3.1-IFNγ重組表達(dá)載體，24 h后，將PRV HNJY毒株接種細(xì)胞，設(shè)定MOI值為1，分別在24、36、48 h觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，結(jié)果如圖2所示。超表達(dá)IFNα的PK15細(xì)胞感染PRV后細(xì)胞形態(tài)與未攻毒時(shí)相比無明顯差異，但正常形態(tài)細(xì)胞數(shù)量多于對(duì)照組；轉(zhuǎn)染IFNβ的PK15細(xì)胞感染PRV后，細(xì)胞皺縮，48 h時(shí)明顯脫落，死亡，但正常形態(tài)細(xì)胞數(shù)量仍多于對(duì)照組；轉(zhuǎn)染IFNγ的PK15細(xì)胞感染PRV后，24 h時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的皺縮，36 h時(shí)細(xì)胞死亡嚴(yán)重，48 h時(shí)與對(duì)照組相比細(xì)胞形態(tài)差異不明顯，正常形態(tài)細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相當(dāng)。

2.2.2 感染PRV后gD基因表達(dá)量的變化 在感染PRV后的24、36、48 h收細(xì)胞，提取病毒的基因組DNA，qPCR檢測(cè)細(xì)胞中g(shù)D基因的表達(dá)量，如圖3所示。與對(duì)照組相比，IFNα和IFNβ試驗(yàn)組gD基因的表達(dá)量在24、36、48 h顯著上調(diào)；IFNγ試驗(yàn)組gD基因的表達(dá)量在24、36 h均極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，在48 h與對(duì)照組無顯著差異。

2.2.3 感染PRV后相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)量的變化 在感染PRV后的24、36、48 h收細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)IFNα、IFNβ、IFNγ、ISG15、IL6、IL1β以及IL10的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖4、5所示。IFNα的表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；IFNβ的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，但均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；IFNγ的表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

如圖5所示，在IFNα試驗(yàn)組細(xì)胞中，ISG15的表達(dá)量隨著PRV的持續(xù)感染呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，ISG15的表達(dá)量在24 h時(shí)與對(duì)照組相比無明顯差異，36、48 h均上調(diào)表達(dá)，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。在IFNβ試驗(yàn)組細(xì)胞中，ISG15的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在24 h時(shí)與對(duì)照組相比無明顯差異；36 h上調(diào)表達(dá)，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；48 h下調(diào)表達(dá)，極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。在IFNγ試驗(yàn)組細(xì)胞中，ISG15的表達(dá)量隨著PRV的持續(xù)感染呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，ISG15的表達(dá)量在24、36 h時(shí)與對(duì)照組相比均無明顯差異；48 h時(shí)上調(diào)表達(dá)，但仍極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。

在IFNα試驗(yàn)組細(xì)胞中，IL6的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，IL6的表達(dá)量在24、36 h時(shí)與對(duì)照組相比均無明顯差異，48 h時(shí)上調(diào)表達(dá)，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。在IFNβ試驗(yàn)組細(xì)胞中，IL6的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在24 h顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，36、48 h均上調(diào)表達(dá)，極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。在IFNγ試驗(yàn)組細(xì)胞中，IL6的表達(dá)量隨著PRV的持續(xù)感染呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均上調(diào)表達(dá)，顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

在IFNα試驗(yàn)組細(xì)胞中，IL1β的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，IL1β的表達(dá)量在24 h時(shí)與對(duì)照組相比無明顯差異；36 h時(shí)下調(diào)表達(dá)，極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；在48 h時(shí)上調(diào)表達(dá)，極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。在IFNβ試驗(yàn)組細(xì)胞中，IL1β的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在24 h極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，36、48 h均上調(diào)表達(dá)，極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。在IFNγ試驗(yàn)組細(xì)胞中，IL1β的表達(dá)量隨著PRV的持續(xù)感染呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，在24 h極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，在36、48 h時(shí)上調(diào)，極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

在IFNα試驗(yàn)組細(xì)胞中，IL10的表達(dá)量隨著PRV的持續(xù)感染呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，IL10的表達(dá)量在24 h顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，36、48 h下調(diào)，極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。在IFNβ試驗(yàn)組細(xì)胞中，IL10的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在24、36 h極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，48 h表達(dá)量下降，但仍極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。在IFNγ試驗(yàn)組細(xì)胞中，IL10的表達(dá)量隨著PRV的持續(xù)感染呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，但在24 h極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，36 h顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，48 h上調(diào)，極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

3 結(jié)論與討論

3.1 轉(zhuǎn)染IFN的PK15細(xì)胞感染PRV后對(duì)gD基因表達(dá)量的影響

IFN作用的發(fā)揮是一個(gè)復(fù)雜的過程，主要是通過一個(gè)IFN系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)，表現(xiàn)為免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和抗腫瘤的作用。本研究采用qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IFNα、pcDNA3.1-IFNβ、pcDNA3.1-IFNγ重組質(zhì)粒的PK15細(xì)胞攻毒后gD基因表達(dá)量變化，結(jié)果顯示，IFNα、IFNβ試驗(yàn)組PK15細(xì)胞中g(shù)D基因的表達(dá)量在24、36、48 h均高于對(duì)照組。此前有試驗(yàn)證明，IFNα、IFNβ能夠潛在抑制PRV的增殖[24]，然而這些試驗(yàn)并未探討其抗病毒機(jī)制。本研究中，隨著攻毒時(shí)間的增加，不同試驗(yàn)組gD表達(dá)量變化趨勢(shì)不同，推測(cè)與IFNα、IFNβ、IFNγ瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞有關(guān)。李厚偉等[25]在研究不同MOI的PRV對(duì)PK15細(xì)胞感染后細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄的影響時(shí)，分別用MOI為0.1、1.0、10.0的PRV感染PK15細(xì)胞，并且在1、2、3、6、12、24、48、60、72 h收集細(xì)胞，結(jié)果表明，在感染48 h且MOI為1.0時(shí)，病毒的DNA達(dá)到最高峰。本研究同樣選用MOI為1的PRV感染PK15細(xì)胞，且在感染48 h時(shí)，gD的表達(dá)量達(dá)到高峰。因此，gD的表達(dá)水平也與MOI值有關(guān)。

3.2 轉(zhuǎn)染IFN的PK15細(xì)胞感染PRV后對(duì)相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)量的影響

本研究中，感染PRV后，PK15細(xì)胞中的細(xì)胞因子IFNα、IFNβ、IFNγ、ISG15、IL6、IL1β和IL10的表達(dá)量發(fā)生顯著變化。這些細(xì)胞因子表達(dá)水平的變化不但與PK15細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染IFNα、IFNβ、IFNγ有關(guān)，也與PRV的感染有關(guān)。ISG15所編碼的蛋白質(zhì)是在病毒感染期間起重要的抗病毒作用，其抗病毒作用在天然免疫中具有重要意義。在治療PR時(shí)，豬源IFNα、IFNβ、IFNγ能否刺激ISG15的表達(dá)尚不明確。本研究結(jié)果顯示，在IFNα試驗(yàn)組細(xì)胞中，ISG15的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，說明IFNα可以刺激ISG15的表達(dá)。在IFNβ試驗(yàn)組細(xì)胞中，ISG15的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，48 h下調(diào)表達(dá)，極顯著低于對(duì)照組。推測(cè)在48 h時(shí)ISG15的表達(dá)量下調(diào)可能與PRV的增殖有關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)，PRV可極顯著抑制IFNβ調(diào)節(jié)的抗病毒反應(yīng)[26]，且過表達(dá)ISG15可上調(diào)IFNβ的mRNA水平，并抑制PRV復(fù)制[27]。在IFNγ試驗(yàn)組細(xì)胞中，ISG15的表達(dá)量隨著PRV的持續(xù)感染呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，ISG15的表達(dá)量在48 h時(shí)上調(diào)，但仍極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，推測(cè)IFNγ不能誘導(dǎo)ISG15的表達(dá)。IL6作為一種刺激因子，它可以直接或間接增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞(NK)的作用。在本試驗(yàn)中，IFNα、IFNβ、IFNγ試驗(yàn)組細(xì)胞在48 h時(shí)與對(duì)照組相比，IL6的表達(dá)量均上調(diào)。樊江平等[28]探討IL1β、IL6、IFNγ在甲型H1N1流感病毒性肺炎患者血清中的表達(dá)，結(jié)果表明，與健康組相比，重癥組和輕癥組血清IL1β、IL6、IFNγ水平較高，且重癥組高于輕癥組。IL1β、IL6的上調(diào)可能引起了炎癥因子風(fēng)暴。本研究中，IL1β、IL6的表達(dá)水平可能與gD基因的表達(dá)水平有關(guān)。IL10是抗炎性細(xì)胞因子，能夠抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如TNFα和IFNγ。有研究發(fā)現(xiàn),PRV感染PK15細(xì)胞能顯著降低IL10啟動(dòng)子的甲基化水平，且PRV誘導(dǎo)IL10表達(dá)與病毒增殖密切相關(guān)[29-30]。由此，推測(cè)IFN通過調(diào)控IL10表達(dá)來影響gD基因的復(fù)制。綜上，推測(cè)Ⅰ型IFN和Ⅱ型IFN通過不同途徑影響PRV在PK15細(xì)胞中的增殖，Ⅰ型IFN，特別是IFNα是通過誘導(dǎo)ISG15的表達(dá)影響PRV增殖；IFNβ同樣可誘導(dǎo)ISG15的表達(dá)，但還要借助于其他細(xì)胞因子比如IL6、IL1β、IL10來影響PRV增殖；Ⅱ型IFN影響PRV的增殖不依賴ISG15的表達(dá)，而是依賴于其他細(xì)胞因子比如IL6、IL1β、IL10的上調(diào)表達(dá)。各自具體的作用途徑，還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)探討。

本研究結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IFNα、pcDNA3.1-IFNβ、pcDNA3.1-IFNγ重組質(zhì)粒的PK15細(xì)胞中感染PRV之后，IFNα、IFNβ可誘導(dǎo)ISG15的表達(dá)，IFNγ對(duì)ISG15的表達(dá)并無明顯促進(jìn)作用，IFNα、IFNβ、IFNγ對(duì)IL6、IL1β的表達(dá)在一定條件下均有促進(jìn)作用，IFNα抑制IL10的表達(dá)，IFNβ、IFNγ對(duì)IL10的表達(dá)具有一定促進(jìn)作用，IFNα、IFNβ、IFNγ均影響gD基因的表達(dá)量。綜上，IFNα、IFNβ、IFNγ經(jīng)不同途徑在不同時(shí)間段通過調(diào)控不同細(xì)胞因子的表達(dá)來影響PRV的增殖。