李聰聰，張世軍，王紅彩，張依盼，霍 永，姜東鳳，宋素芳,2，牛 暉,3，姬向波，李婉濤

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院 動物科技學(xué)院，河南 鄭州 450046； 2.河南省畜禽遺傳資源保護工程技術(shù)研究中心， 河南 鄭州 450046； 3.鄭州市動物生殖分子調(diào)控重點實驗室，河南 鄭州 450046； 4.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046； 5.河南省非常規(guī)飼料資源創(chuàng)新利用重點實驗室，河南 鄭州 450046)

中國作為豬肉消費大國，生豬規(guī)?；B(yǎng)殖在不斷地擴大，對豬流行性疾病的預(yù)防和治療也顯得越來越重要。目前，豬場流行性疾病可以分為細菌性疾病和病毒性疾病兩大類，而病毒性疾病是防治的重中之重。豬偽狂犬病(PR)是由豬偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一種病毒性疾病，病死率高達80%～100%[1]，其中斷奶仔豬死亡率10%～20%[2]，嚴重影響種豬場生產(chǎn)。PRV屬于皰疹病毒科、豬皰疹病毒屬，宿主幾乎包含了所有的哺乳動物以及其他脊椎動物。PRV能在多種組織培養(yǎng)細胞內(nèi)增殖，其中以兔腎和豬腎細胞最為敏感，可以引起明顯的細胞病變[3]。PRV可以編碼11種糖蛋白，分別是gN、gM、gL、gK、gI、gH、gE、gG、gD、gB和gC糖蛋白，其中g(shù)D糖蛋白不僅參與了病毒侵染宿主細胞的整個過程[4]，還是PRV主要的免疫原性糖蛋白之一，在PRV感染宿主的過程中有著重要的作用。 因此，gD基因的表達量變化能夠反映PRV的增殖情況。

干擾素(Interferon,IFN)是一種糖蛋白，由英國科學(xué)家ISSAACS和LINDENMENN于1957年首先發(fā)現(xiàn)。根據(jù)基因的組成和蛋白質(zhì)的功能，可以將IFN分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，Ⅰ型IFN通過誘導(dǎo)自噬參與細胞清除[5]，在急性感染中主要起保護作用[6]；Ⅱ型IFN主要在宿主早期抗感染過程中起重要作用[7]；Ⅲ型IFN主要是在上皮細胞表面表達，其在上皮細胞對抗病毒中起著重要作用[8]。Ⅰ型和Ⅱ型IFN通常起協(xié)同作用，激活多種適應(yīng)性免疫活動，從而參與病原體感染的整個過程[9]。其中，Ⅰ型IFN包括IFNα、IFNβ、1FNδ、IFNε等亞型；Ⅱ型IFN主要是指IFNγ，是在人類第9號染色體新發(fā)現(xiàn)的一種細胞因子；Ⅲ型IFN主要是指IFNλ，發(fā)現(xiàn)較晚。研究表明，IFNα是由病毒感染白細胞后產(chǎn)生，IFNβ是由病毒感染成纖維細胞后產(chǎn)生，IFNγ是由抗原刺激細胞產(chǎn)生[10]。IFN能夠在動物體內(nèi)合成抗病毒蛋白來抑制病毒多肽鏈的形成，從而阻止病毒的增殖[11]。Ⅰ型IFN可以通過受體信號通路將信號傳遞到下游調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達，間接參與免疫功能的調(diào)節(jié)[12]。Ⅱ型IFNγ可以促使感染病毒的細胞和抗原遞呈細胞產(chǎn)生MHC Ⅱ型分子[13]。目前，有關(guān)Ⅰ型和Ⅱ型IFN影響PRV在宿主細胞中增殖的研究報道相對較少[14]。

IFN并不能直接作用于病毒發(fā)揮其抗病毒功能，而是與細胞表面的IFN受體結(jié)合，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)器促進大量干擾素刺激基因(Interferon stimulated gene,ISG)的表達，ISG的大量表達可以使機體處于一種抗病毒狀態(tài)[15]。ISG15(Interferon-stimulated gene 15,ISG15)是最早發(fā)現(xiàn)的ISG之一[16]，是在Ⅰ型干擾素的誘導(dǎo)下表達能力最強的刺激基因之一[17]。白細胞介素1β(IL1β)是在免疫反應(yīng)中或者炎癥狀態(tài)下由單核巨噬細胞產(chǎn)生，在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、促進造血、調(diào)節(jié)免疫細胞等方面發(fā)揮重要作用[18]。白細胞介素6(IL6)是T淋巴細胞、巨噬細胞和B淋巴細胞產(chǎn)生的淋巴因子，具有調(diào)節(jié)機體免疫功能、參與炎癥反應(yīng)及應(yīng)激反應(yīng)等多種生物學(xué)功能。白細胞介素10(IL10)是一種抗炎細胞因子，由單核細胞、淋巴細胞分泌，能夠在轉(zhuǎn)錄水平抑制炎癥因子IL1β、IL6、IL8、TNFα等的合成[19]，其在炎癥和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮多種作用。有研究表明，IL10和IFN存在相互競爭或相互作用誘導(dǎo)的細胞內(nèi)機制，其相對強度決定了IFN誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄[20]。因此，檢測與IFN相關(guān)細胞因子的表達量變化情況，也可以間接反映IFN影響病毒增殖的情況。

IFN在抗病毒以及提升機體免疫力方面具有十分突出的作用，雖然其具有明顯種屬特異性[21]，但由于其在治療豬的病毒性疾病中有較好效果[22]，在生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛。目前，關(guān)于IFN影響PRV在宿主細胞中增殖的具體作用機制未見報道。鑒于此，研究Ⅰ型IFNα、IFNβ和Ⅱ型IFNγ對PRV增殖的影響，旨在探討IFN的抗病毒機制，為IFN防治豬源病毒性疾病奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

豬腎細胞系(PK15)由河南省非常規(guī)飼料資源創(chuàng)新利用重點實驗室保存，PRV HNJY毒株由河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院李文剛教授課題組饋贈。試驗所用引物信息見表1，由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 引物信息Tab.1 Information of primers

1.2 IFNα、IFNβ、IFNγ表達載體的構(gòu)建

以Ensembl數(shù)據(jù)庫中記錄的豬的IFNα(ENSSSCT00000087954.1)、IFNβ(ENSSSCT00045019653.1)、IFNγ(ENSSSCT00000055560.2)序列為模板設(shè)計引物，擴增豬IFNα、IFNβ、IFNγ基因完整的CDS序列。將擴增得到的IFNα、IFNβ、IFNγ基因的CDS序列連接至pcDNA3.1載體，載體構(gòu)建成功后，提取無內(nèi)毒素質(zhì)粒備用。

1.3 PK15細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及攻毒試驗

培養(yǎng)PK15細胞的完全培養(yǎng)基由10%FBS、89%普通高糖DMEM和1%青-鏈霉素組成，以上試劑均購自Hyclone公司。在轉(zhuǎn)染前1 d，按每孔1.2×105個細胞的量接種至12孔板，將細胞置于 5% CO2、飽和濕度的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞匯合度達到60%～80%，采用Polyplus公司的Jetprime轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染，分為試驗組和對照組，試驗組分別為pcDNA3.1-IFNα、pcDNA3.1-IFNβ、pcDNA3.1-IFNγ3個表達載體，對照組(NC)為pcDNA3.1空載體，首次試驗在轉(zhuǎn)染24 h后收細胞，檢測3個基因的表達情況。而后進行第2次轉(zhuǎn)染試驗，與前面不同的是，轉(zhuǎn)染24 h后，在生物安全柜中以MOI為1接種PRV HNJY毒株，作用1 h后，PBS洗2次，換2%FBS+98%普通高糖DMEM的維持培養(yǎng)基，分別在接毒后的24、36、48 h收細胞。

1.4 病毒基因組DNA的提取及gD基因的檢測

收集細胞后，采用上海生工生物工程有限公司提病毒基因組試劑盒(貨號：B518261)，根據(jù)其說明書進行病毒基因組提取。將實驗室保存的PRV-gD質(zhì)粒進行10倍倍比稀釋，在ABI7500系統(tǒng)進行實時熒光定量PCR(qPCR)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；以病毒DNA為模板，對gD基因的表達量進行檢測分析。15 μL的反應(yīng)體系：7.5 μL 2×SYBR?Green Real-time PCR Master Mix (Toyobo公司)，50 pmol引物，75 ng模板DNA，補水至15 μL。擴增程序：預(yù)變性(95 ℃ 30 s)；變性(95 ℃ 5 s)，退火+延伸(60 ℃ 34 s)，進行45個循環(huán)；溶解曲線(95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s)。

1.5 細胞總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄PCR以及qPCR

按照Trizol(Invitrogen公司)的說明書提取細胞的總RNA，用NanoDrop1000(Themo Fisher公司)測定RNA含量備用。對提取的細胞總RNA用DNaseⅠ(Themo Fisher公司)去除基因組DNA，接下來嚴格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(KI622， Themo Fisher公司)的操作說明進行反轉(zhuǎn)錄，而后將得到的cDNA置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ梅崔D(zhuǎn)錄所得到的cDNA作為模板，對細胞因子IFNα、IFNβ、IFNγ、ISG15、IL6、IL1β和IL10的表達量進行檢測分析。采用15 μL的反應(yīng)體系：7.5 μL 2×SYBR?Green Real-time PCR Master Mix，50 pmol引物，75 ng模板cDNA，補水至15 μL。擴增程序：預(yù)變性(95 ℃ 2 min)；變性(95 ℃ 15 s)，退火+延伸(60 ℃ 1 min)，進行45個循環(huán)；溶解曲線(95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s)。以GAPDH基因作為內(nèi)參基因，qPCR數(shù)據(jù)分析采用相對定量2-△△Ct法[23]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Graph Pad Prism 6軟件對數(shù)據(jù)進行處理及作圖，差異顯著性分析采用t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 IFN在PK15細胞中的表達

將構(gòu)建的3種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK15細胞，24 h后收細胞，提取RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過qPCR檢測IFNα、IFNβ、IFNγ的表達量(圖1)。從圖1可以看出，與對照組相比，轉(zhuǎn)染IFNα、IFNβ、IFNγ重組質(zhì)粒的PK15細胞中IFN的相對表達量均上調(diào)600倍以上，說明3種基因在PK15細胞中超表達成功。

2.2 超表達IFN對PRV在PK15細胞中增殖的影響

2.2.1 感染PRV前后PK15細胞表型變化 待12孔板中的PK15細胞匯合度達到80%時，分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IFNα、pcDNA3.1-IFNβ、pcDNA3.1-IFNγ重組表達載體，24 h后，將PRV HNJY毒株接種細胞，設(shè)定MOI值為1，分別在24、36、48 h觀察細胞的生長狀態(tài)，結(jié)果如圖2所示。超表達IFNα的PK15細胞感染PRV后細胞形態(tài)與未攻毒時相比無明顯差異，但正常形態(tài)細胞數(shù)量多于對照組；轉(zhuǎn)染IFNβ的PK15細胞感染PRV后，細胞皺縮，48 h時明顯脫落，死亡，但正常形態(tài)細胞數(shù)量仍多于對照組；轉(zhuǎn)染IFNγ的PK15細胞感染PRV后，24 h時細胞出現(xiàn)明顯的皺縮，36 h時細胞死亡嚴重，48 h時與對照組相比細胞形態(tài)差異不明顯，正常形態(tài)細胞數(shù)量與對照組相當(dāng)。

2.2.2 感染PRV后gD基因表達量的變化 在感染PRV后的24、36、48 h收細胞，提取病毒的基因組DNA，qPCR檢測細胞中g(shù)D基因的表達量，如圖3所示。與對照組相比，IFNα和IFNβ試驗組gD基因的表達量在24、36、48 h顯著上調(diào)；IFNγ試驗組gD基因的表達量在24、36 h均極顯著低于對照組(P<0.01)，在48 h與對照組無顯著差異。

2.2.3 感染PRV后相關(guān)細胞因子表達量的變化 在感染PRV后的24、36、48 h收細胞，提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，檢測不同時間點IFNα、IFNβ、IFNγ、ISG15、IL6、IL1β以及IL10的相對表達量，結(jié)果如圖4、5所示。IFNα的表達量呈現(xiàn)下降趨勢，但均極顯著高于對照組(P<0.01)；IFNβ的相對表達量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，但均極顯著高于對照組(P<0.01)；IFNγ的表達量呈現(xiàn)上升趨勢，且極顯著高于對照組(P<0.01)。

如圖5所示，在IFNα試驗組細胞中，ISG15的表達量隨著PRV的持續(xù)感染呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，ISG15的表達量在24 h時與對照組相比無明顯差異，36、48 h均上調(diào)表達，顯著高于對照組(P<0.05)。在IFNβ試驗組細胞中，ISG15的表達量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在24 h時與對照組相比無明顯差異；36 h上調(diào)表達，顯著高于對照組(P<0.05)；48 h下調(diào)表達，極顯著低于對照組(P<0.01)。在IFNγ試驗組細胞中，ISG15的表達量隨著PRV的持續(xù)感染呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，ISG15的表達量在24、36 h時與對照組相比均無明顯差異；48 h時上調(diào)表達，但仍極顯著低于對照組(P<0.01)。

在IFNα試驗組細胞中，IL6的表達量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，IL6的表達量在24、36 h時與對照組相比均無明顯差異，48 h時上調(diào)表達，顯著高于對照組(P<0.05)。在IFNβ試驗組細胞中，IL6的表達量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在24 h顯著低于對照組(P<0.05)，36、48 h均上調(diào)表達，極顯著高于對照組(P<0.01)。在IFNγ試驗組細胞中，IL6的表達量隨著PRV的持續(xù)感染呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，與對照組相比，在3個時間點的表達量均上調(diào)表達，顯著高于對照組(P<0.01)。

在IFNα試驗組細胞中，IL1β的表達量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，IL1β的表達量在24 h時與對照組相比無明顯差異；36 h時下調(diào)表達，極顯著低于對照組(P<0.01)；在48 h時上調(diào)表達，極顯著高于對照組(P<0.01)。在IFNβ試驗組細胞中，IL1β的表達量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在24 h極顯著低于對照組(P<0.01)，36、48 h均上調(diào)表達，極顯著高于對照組(P<0.01)。在IFNγ試驗組細胞中，IL1β的表達量隨著PRV的持續(xù)感染呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，在24 h極顯著低于對照組(P<0.01)，在36、48 h時上調(diào)，極顯著高于對照組(P<0.01)。

在IFNα試驗組細胞中，IL10的表達量隨著PRV的持續(xù)感染呈現(xiàn)下降趨勢，IL10的表達量在24 h顯著高于對照組(P<0.05)，36、48 h下調(diào)，極顯著低于對照組(P<0.01)。在IFNβ試驗組細胞中，IL10的表達量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在24、36 h極顯著高于對照組(P<0.01)，48 h表達量下降，但仍極顯著高于對照組(P<0.01)。在IFNγ試驗組細胞中，IL10的表達量隨著PRV的持續(xù)感染呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，但在24 h極顯著低于對照組(P<0.01)，36 h顯著低于對照組(P<0.05)，48 h上調(diào)，極顯著高于對照組(P<0.01)。

3 結(jié)論與討論

3.1 轉(zhuǎn)染IFN的PK15細胞感染PRV后對gD基因表達量的影響

IFN作用的發(fā)揮是一個復(fù)雜的過程，主要是通過一個IFN系統(tǒng)實現(xiàn)，表現(xiàn)為免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和抗腫瘤的作用。本研究采用qPCR檢測轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IFNα、pcDNA3.1-IFNβ、pcDNA3.1-IFNγ重組質(zhì)粒的PK15細胞攻毒后gD基因表達量變化，結(jié)果顯示，IFNα、IFNβ試驗組PK15細胞中g(shù)D基因的表達量在24、36、48 h均高于對照組。此前有試驗證明，IFNα、IFNβ能夠潛在抑制PRV的增殖[24]，然而這些試驗并未探討其抗病毒機制。本研究中，隨著攻毒時間的增加，不同試驗組gD表達量變化趨勢不同，推測與IFNα、IFNβ、IFNγ瞬時轉(zhuǎn)染PK15細胞有關(guān)。李厚偉等[25]在研究不同MOI的PRV對PK15細胞感染后細胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄的影響時，分別用MOI為0.1、1.0、10.0的PRV感染PK15細胞，并且在1、2、3、6、12、24、48、60、72 h收集細胞，結(jié)果表明，在感染48 h且MOI為1.0時，病毒的DNA達到最高峰。本研究同樣選用MOI為1的PRV感染PK15細胞，且在感染48 h時，gD的表達量達到高峰。因此，gD的表達水平也與MOI值有關(guān)。

3.2 轉(zhuǎn)染IFN的PK15細胞感染PRV后對相關(guān)細胞因子表達量的影響

本研究中，感染PRV后，PK15細胞中的細胞因子IFNα、IFNβ、IFNγ、ISG15、IL6、IL1β和IL10的表達量發(fā)生顯著變化。這些細胞因子表達水平的變化不但與PK15細胞瞬時轉(zhuǎn)染IFNα、IFNβ、IFNγ有關(guān)，也與PRV的感染有關(guān)。ISG15所編碼的蛋白質(zhì)是在病毒感染期間起重要的抗病毒作用，其抗病毒作用在天然免疫中具有重要意義。在治療PR時，豬源IFNα、IFNβ、IFNγ能否刺激ISG15的表達尚不明確。本研究結(jié)果顯示，在IFNα試驗組細胞中，ISG15的表達量顯著高于對照組，說明IFNα可以刺激ISG15的表達。在IFNβ試驗組細胞中，ISG15的表達量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，48 h下調(diào)表達，極顯著低于對照組。推測在48 h時ISG15的表達量下調(diào)可能與PRV的增殖有關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)，PRV可極顯著抑制IFNβ調(diào)節(jié)的抗病毒反應(yīng)[26]，且過表達ISG15可上調(diào)IFNβ的mRNA水平，并抑制PRV復(fù)制[27]。在IFNγ試驗組細胞中，ISG15的表達量隨著PRV的持續(xù)感染呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，與對照組相比，ISG15的表達量在48 h時上調(diào)，但仍極顯著低于對照組(P<0.01)，推測IFNγ不能誘導(dǎo)ISG15的表達。IL6作為一種刺激因子，它可以直接或間接增強自然殺傷細胞(NK)的作用。在本試驗中，IFNα、IFNβ、IFNγ試驗組細胞在48 h時與對照組相比，IL6的表達量均上調(diào)。樊江平等[28]探討IL1β、IL6、IFNγ在甲型H1N1流感病毒性肺炎患者血清中的表達，結(jié)果表明，與健康組相比，重癥組和輕癥組血清IL1β、IL6、IFNγ水平較高，且重癥組高于輕癥組。IL1β、IL6的上調(diào)可能引起了炎癥因子風(fēng)暴。本研究中，IL1β、IL6的表達水平可能與gD基因的表達水平有關(guān)。IL10是抗炎性細胞因子，能夠抑制促炎細胞因子的產(chǎn)生，如TNFα和IFNγ。有研究發(fā)現(xiàn),PRV感染PK15細胞能顯著降低IL10啟動子的甲基化水平，且PRV誘導(dǎo)IL10表達與病毒增殖密切相關(guān)[29-30]。由此，推測IFN通過調(diào)控IL10表達來影響gD基因的復(fù)制。綜上，推測Ⅰ型IFN和Ⅱ型IFN通過不同途徑影響PRV在PK15細胞中的增殖，Ⅰ型IFN，特別是IFNα是通過誘導(dǎo)ISG15的表達影響PRV增殖；IFNβ同樣可誘導(dǎo)ISG15的表達，但還要借助于其他細胞因子比如IL6、IL1β、IL10來影響PRV增殖；Ⅱ型IFN影響PRV的增殖不依賴ISG15的表達，而是依賴于其他細胞因子比如IL6、IL1β、IL10的上調(diào)表達。各自具體的作用途徑，還需要進一步的試驗探討。

本研究結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IFNα、pcDNA3.1-IFNβ、pcDNA3.1-IFNγ重組質(zhì)粒的PK15細胞中感染PRV之后，IFNα、IFNβ可誘導(dǎo)ISG15的表達，IFNγ對ISG15的表達并無明顯促進作用，IFNα、IFNβ、IFNγ對IL6、IL1β的表達在一定條件下均有促進作用，IFNα抑制IL10的表達，IFNβ、IFNγ對IL10的表達具有一定促進作用，IFNα、IFNβ、IFNγ均影響gD基因的表達量。綜上，IFNα、IFNβ、IFNγ經(jīng)不同途徑在不同時間段通過調(diào)控不同細胞因子的表達來影響PRV的增殖。