何瀟 何揚(yáng)波 朱少奎 何黎冰 王晗 王翀

3D打印技術(shù)作為一種增材制造的方式在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引起了極大的關(guān)注，主要有2 個(gè)原因：一是其多功能性、易用性和制造過(guò)程的精確控制，二是定制的骨組織工程支架具有不規(guī)則形狀的結(jié)構(gòu)和性能[1]。除此之外，骨組織工程支架為細(xì)胞提供一個(gè)導(dǎo)電的微環(huán)境，模擬人體組織的多尺度結(jié)構(gòu)[2]并能作為一個(gè)提供藥物（生物分子[3]）的優(yōu)良載體。近年來(lái)，隨著國(guó)內(nèi)外科研專家在骨組織工程支架方面的深入研究，骨組織工程支架開(kāi)始被賦予更多新功能，本文總結(jié)了2014—2019 年來(lái)3D打印骨組織工程支架的制備方式及材料和性能，介紹設(shè)計(jì)和制作骨組織工程支架的思路以及最新的研究成果。

1 3D 打印骨組織工程支架的材料及性能要求

骨再生是非常復(fù)雜的，其中涉及大量分子、細(xì)胞、生物和機(jī)械方面的因素。因此，誘導(dǎo)骨再生的多孔骨組織工程支架需要具有合適形狀、孔徑、孔隙率、降解性、生物相容性、力學(xué)性能和理想細(xì)胞反應(yīng)等一系列要素。

1.1 骨組織工程支架的材料種類

骨組織工程支架的材料很多樣：生物陶瓷粉末、天然/合成水凝膠、天然/合成聚合物及其復(fù)合材料，如表1 所示[4-10]。

表1 骨組織工程支架的材料種類

1.2 骨組織工程支架的結(jié)構(gòu)

1.3 骨組織工程支架的機(jī)械性能

人體骨組織由皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨組成。皮質(zhì)骨致密，孔隙率僅為5%～10%；松質(zhì)骨為海綿狀結(jié)構(gòu)，孔隙率為50%～90%。皮質(zhì)骨占人體骨骼重量的80%，而松質(zhì)骨占20%。皮質(zhì)骨的抗壓強(qiáng)度和楊氏模量明顯高于松質(zhì)骨[12]。所以制備支架時(shí)，需要使其有匹配的力學(xué)性能，提供足夠的力學(xué)支撐。

1.4 骨組織工程支架的細(xì)胞反應(yīng)

骨組織工程支架能否誘導(dǎo)良好的細(xì)胞反應(yīng)也是支架設(shè)計(jì)的重要內(nèi)容。首先，該支架應(yīng)具有生物相容性，在體內(nèi)外均無(wú)急性或長(zhǎng)期毒性。其次，由于細(xì)胞的初始黏附、擴(kuò)散和增殖與支架表面的潤(rùn)濕性等性質(zhì)密切相關(guān)，因此需要提供具有適當(dāng)表面親水性的支架材料，而這可以通過(guò)在支架表面涂敷親水聚合物和肽、生物分子等生物制劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。此外，為了改善骨再生，在支架中控制骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)劑的傳遞，以在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)足夠的骨生成。最后，促進(jìn)血管形成和血管生成的生長(zhǎng)因子也可以用于改善骨再生過(guò)程中支架的血管化。

2 3D 打印陶瓷骨組織工程支架

2.1 燒結(jié)3D 打印陶瓷支架

制備陶瓷骨組織支架最常用的方法是打印自定義形狀和孔徑的支架，然后高溫?zé)Y(jié)，去除所有有機(jī)相，形成純陶瓷支架。燒結(jié)后可能發(fā)生尺寸收縮，但機(jī)械強(qiáng)度和楊氏模量可大大提高。Song 等[13]利用低溫3D 打印+燒結(jié)制備出骨組織工程支架，該支架具有層次多孔結(jié)構(gòu)（支架表面的宏觀孔洞和微孔相互連接）和優(yōu)越的抗壓強(qiáng)度。Chen 等[14]通過(guò)3D 打印復(fù)合燒結(jié)工藝構(gòu)建了具有雙重生物活性的鋰鈣硅酸鹽晶體生物載體，用于骨軟骨界面重建，該支架具有較強(qiáng)的機(jī)械強(qiáng)度，支持間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化和軟骨細(xì)胞在體內(nèi)外的成軟骨分化。

2.2 室溫/低溫3D 打印陶瓷支架

除了高溫?zé)Y(jié)的骨組織工程支架，越來(lái)越多的研究者開(kāi)始使用室溫/低溫的3D 打印方式來(lái)制備骨組織工程支架。Song 等[15]研究者報(bào)道了采用基于擠壓的低溫3D 打印制備了負(fù)載富血小板纖維蛋白的納米雙相磷酸鈣nBCP/PVA（nBCP∶PVA=84∶16）復(fù)合材料。該支架具有更佳的體外生物相容性和生物活性，改善了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附、增殖和成骨分化的問(wèn)題，并在兔大段骨缺損模型中觀察到更多新骨形成。

2.3 3D 打印陶瓷支架后吸附藥劑

為了進(jìn)一步給生物陶瓷支架提供附加功能，涂層和功能劑的后吸附在內(nèi)的后處理被廣泛采用。Kim 等[16]使用PCL乳液涂層方法將骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2）負(fù)載的PLGA 納米顆粒添加到HA 支架表面。BMP-2/PLGA 納米顆粒均勻分布于支架表面，BMP-2 逐漸釋放。此外，PCL 涂層提高了支架的抗壓強(qiáng)度。采用PCL-BMP-2/PLGA 納米顆粒包覆支架，可改善體外細(xì)胞增殖、黏附、成骨分化及體內(nèi)新骨形成。

燒結(jié)的3D 打印陶瓷展現(xiàn)出了優(yōu)越的機(jī)械性能，作為骨組織工程的支架，可以更好地支持細(xì)胞的成骨分化和成軟骨分化。室溫/低溫的3D 打印陶瓷支架，使得陶瓷支架更為研究者們所接受，其相對(duì)于普通的實(shí)驗(yàn)條件讓更多研究人員能夠在自己的實(shí)驗(yàn)室中就復(fù)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)，使得室溫/低溫3D 打印陶瓷支架快速發(fā)展，而在陶瓷支架吸附的藥劑也為研究和應(yīng)用的多樣化提供了更多的可能性。

3 水凝膠骨組織工程支架

3.1 3D 打印水凝膠支架

近年來(lái)，由于水凝膠具有原位包封生物分子和細(xì)胞的能力，已被應(yīng)用于基于擠壓的3D 打印技術(shù)制作骨組織工程支架。通過(guò)調(diào)節(jié)水凝膠的組成，可以獲得具有不同力學(xué)性能和細(xì)胞反應(yīng)的支架，其中一些具有誘導(dǎo)骨再生的潛力。

Sithole 等[17]使用海藻酸鈉作為打印材料，使其與聚乙烯亞胺溶液相互作用，通過(guò)離子鍵形成聚電解質(zhì)復(fù)合物，制備出聚合物支架。在生物墨水中加入硅膠作為暫時(shí)的無(wú)機(jī)支撐成分，最終增強(qiáng)骨誘導(dǎo)再生。該支架具有較高的抗拉強(qiáng)度，可用于骨組織工程。Gao 等[18]研究者制備了具有梯度組成/結(jié)構(gòu)和優(yōu)異機(jī)械強(qiáng)度的水凝膠支架。梯度支架的軟骨層和軟骨下層有明顯的微觀結(jié)構(gòu)、成分和各向異性力學(xué)強(qiáng)度。梯度支架以時(shí)空相關(guān)自適應(yīng)方式誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成軟骨和成骨分化。此外，在體內(nèi)的研究也證實(shí)了它們同時(shí)實(shí)現(xiàn)新骨形成和軟骨修復(fù)的有效性。Luo 等[19]使用濃縮的海藻酸鹽/明膠溶液作為打印材料，然后在支架表面上均勻沉淀納米磷灰石涂層。該仿生支架材料具有良好的力學(xué)性能，其力學(xué)性能高于人松質(zhì)骨，并具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)吸附能力。沉淀的磷灰石促進(jìn)了支架上大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化。

3.2 3D 打印水凝膠細(xì)胞負(fù)載支架

Demirta 等[20]將MC3T3-E1 預(yù)成骨細(xì)胞封裝在殼聚糖和殼聚糖-HA 水凝膠，然后通過(guò)3D 打印的方式制備細(xì)胞負(fù)載支架。殼聚糖/殼聚糖-HA 復(fù)合水凝膠中細(xì)胞表達(dá)的早期、晚期成骨標(biāo)志物均達(dá)到峰值。與藻酸鹽基水凝膠相比，殼聚糖基水凝膠具有良好的打印性，可作為制備細(xì)胞負(fù)載水凝膠支架材料，唯一不足的是彈性模量（15 kPa）明顯低于人松質(zhì)骨。Heo 等[21]通過(guò)EDC/NHS 偶聯(lián)將骨形成肽與藻酸鹽結(jié)合形成打印材料，并將其打印到混合骨組織工程支架中。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明，海藻酸鹽支架為人脂肪源性干細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了穩(wěn)定的環(huán)境，并能誘導(dǎo)協(xié)同效應(yīng)，促進(jìn)骨再生。隨著研究的深入，細(xì)胞負(fù)載水凝膠支架可以展現(xiàn)出良好的性能，甚至在某些方面更勝一籌，其為成骨及成軟骨分化都提供了一些新的思路和方法。

4 合成/天然高分子骨組織工程支架

4.1 高溫3D 打?。‵DM）聚酯骨組織支架

聚酯也是在制作骨組織工程支架廣泛使用的打印材料。由于其操作過(guò)程簡(jiǎn)單、環(huán)保、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，骨組織工程支架常采用聚乳酸、PLGA、PCL 等生物可降解、生物相容聚酯制成的絲團(tuán)或球團(tuán)來(lái)制作。Liu 等[22]利用FDM 技術(shù)制備了具有多種大孔結(jié)構(gòu)的PLGA 支架。支架抗壓強(qiáng)度為15～23 MPa，隨著支架孔隙率的增大，抗壓強(qiáng)度降低。由于PLGA 是生物可降解的，其pH、重量殘留和抗壓強(qiáng)度均隨著孵育時(shí)間的增加而不同程度下降。PLGA 支架表現(xiàn)出良好的細(xì)胞反應(yīng)，但是由于支架上缺少微孔，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)，支架表面只能觀察到有限的細(xì)胞。Nyberg 等[23]使用FDM 技術(shù)制備了TCP/PCL、HA/PCL、Bio-Oss/PCL 和去細(xì)胞骨基質(zhì)dBM/PCL 支架。礦物顆粒的加入并沒(méi)有顯著降低支架的壓縮模量，固體塊的壓縮模量為260 MPa，多孔支架的壓縮模量為32～83 MPa。當(dāng)脂肪源基質(zhì)/干細(xì)胞在體外支架上培養(yǎng)時(shí)，Ⅰ型膠原蛋白和骨鈣素在Bio-Oss/PCL 和dBM/PCL 中的基因表達(dá)是PCL 的10 倍，這表明與HA/PCL或TCP/PCL 共混物相比，Bio-Oss/PCL 和dBM/PCL 雜化材料更有利于骨愈合應(yīng)用。Neufurth 等[24]將Ca-P 微粒子與比例為2∶1 的PCL 微粒子混合。在PCL 基質(zhì)中添加Ca-P 微粒子不僅可以顯著改善支架的力學(xué)性能，還可以在支架表面顯示更多的活的成骨細(xì)胞，從而提高生物性能。

4.2 高溫3D 打?。‵DM）聚酯骨組織支架后處理

通過(guò)FDM 制備的生物可降解高分子支架雖然可以作為骨組織工程支架，但其表面光滑、阻礙細(xì)胞有效附著等缺點(diǎn)仍然存在，需要改進(jìn)這些缺點(diǎn)，所以很多研究者嘗試加上了一些后處理的手段。Wang 等[25]將石墨烯與PCL 高溫共混，通過(guò)FDM 制備石墨烯/PCL 支架，以增強(qiáng)其表面親水性和細(xì)胞附著性。原始石墨烯的加入對(duì)細(xì)胞活力和增殖有積極的影響。Jang 等[26]通過(guò)FDM 制備了PCL 支架，并與BMP-2 和臍帶血清進(jìn)一步吸附，最終被CaCl2交聯(lián)的藻酸鹽層阻斷。雙支架在體外誘導(dǎo)了更高水平的成骨分化和細(xì)胞礦化，在體內(nèi)誘導(dǎo)了新的骨形成。Park 等[27]通過(guò)FDM 制備PCL/PEG支架，然后將其從水溶性PEG 中沖洗出來(lái)，在螺紋表面形成微孔。PCL 支架的潤(rùn)濕性得到明顯改善，細(xì)胞增殖也得到了改善。Duan 等[28]也使用選擇性激光燒結(jié)技術(shù)制備Ca-P/PHBV支架，并與肝素進(jìn)一步移植支架表面結(jié)合rhBMP-2，以實(shí)現(xiàn)rhBMP-2 的持續(xù)釋放，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，rhBMP-2 結(jié)合的Ca-P/PHBV 支架可顯著改善成骨。

4.3 室溫/低溫3D 打印合成/天然高分子骨組織工程支架

基于擠壓的室溫或低溫3D打印技術(shù)也是一種先進(jìn)的3D打印技術(shù)，用于制備具有生物分子原位傳遞能力的合成/天然高分子骨組織工程支架。將合成聚酯溶解在1，4-二氧六環(huán)、二甲基亞砜等多種有機(jī)溶劑中，可以作為打印材料，可裝載大量生物介質(zhì)：生物陶瓷顆粒、藥物和生物分子。通過(guò)調(diào)整工藝參數(shù)，可以打印和穩(wěn)定多遞送骨組織工程支架。Kim 等[29]將PCL/DMSO 溶液與阿侖膦酸鹽結(jié)合，通過(guò)基于擠出的3D 打印技術(shù)制備出了ALN/PCL 支架。ALN/PCL支架可獲得4 周以上的ALN 持續(xù)釋放，對(duì)MG63 細(xì)胞無(wú)毒性。ALN/PCL 支架增強(qiáng)了成骨細(xì)胞活性和礦化作用。此外，與單純的PCL 支架相比，ALN/PCL 支架植入大鼠脛骨缺損模型可顯著促進(jìn)骨形成。

4.4 靜電紡絲法制備合成/天然高分子骨組織工程支架

Ristovski 等[30]采用直接寫入近場(chǎng)熔體靜電紡絲法制備了200 層厚的有序支架。獲得了有圖案的微觀結(jié)構(gòu)（纖維間距為1 mm，直徑為40 m），觀察到細(xì)胞在支架中的成功附著還有均質(zhì)細(xì)胞的分布，證明了利用靜電控制制備具有規(guī)則微觀結(jié)構(gòu)的支架的可行性。Qu 等[31]也通過(guò)近場(chǎng)靜電紡絲構(gòu)建了用于骨組織工程的微尺度仿生納米HA/PCL 復(fù)合支架。該支架具有基本規(guī)則的晶格結(jié)構(gòu)，孔徑為50～100 m，絲徑10 m。MC3T3-E1 細(xì)胞可以附著在纖維表面并隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增殖。這些支架在多尺度、多材料水平上調(diào)節(jié)細(xì)胞微環(huán)境，促進(jìn)骨組織再生。

5 總結(jié)和展望

綜上所述，對(duì)于用以上方法制備出的骨組織工程支架，筆者做出如下總結(jié)。以上方法的區(qū)別在于陶瓷骨組織工程支架具有更好的生物相容特性，能夠很好地融入生物體內(nèi)。水凝膠骨組織工程支架則表現(xiàn)出更好的力學(xué)性能，在臨床實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)得更加優(yōu)異。高分子骨組織工程支架綜合了以上2 種材料的支架良好特性，表現(xiàn)出良好的生物特性的同時(shí)也具有優(yōu)異的力學(xué)性能，靜電紡絲的技術(shù)則為構(gòu)建細(xì)胞支架的微觀結(jié)構(gòu)提供了非常有效的手段。這就為更多的高分子骨組織工程支架的研究和應(yīng)用提供了豐富的方式。

目前，3D 打印技術(shù)的飛速發(fā)展使得3D 打印骨組織工程支架在結(jié)構(gòu)仿生和生物分子/藥物控釋方面取得了一定的進(jìn)展。然而多功能骨組織工程支架材料的需求遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了藥物/生物分子的簡(jiǎn)單傳遞，這就促進(jìn)了3D 打印技術(shù)的發(fā)展。未來(lái)3D 打印骨組織工程支架技術(shù)將愈發(fā)成熟，擁有巨大的應(yīng)用空間，在臨床實(shí)驗(yàn)以及中發(fā)揮價(jià)值，同時(shí)也減少了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的需求；同時(shí)用于器官移植和修復(fù)，為患者提供基于個(gè)性化的生物組織。例如，研究負(fù)載細(xì)胞的支架遇到的問(wèn)題：難以實(shí)現(xiàn)足夠的機(jī)械強(qiáng)度，宏微復(fù)合的微孔結(jié)構(gòu)和難以同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞/生物分子原位加載功能。另一方面，如血管形成和血管生成這樣的功能，對(duì)于支架深層細(xì)胞的長(zhǎng)期生存是至關(guān)重要的。與其他組織制作技術(shù)相比，3D 生物打印技術(shù)的優(yōu)勢(shì)包括：制作解剖學(xué)上正確的形狀、制作多孔結(jié)構(gòu)、使用多種細(xì)胞類型、控制生長(zhǎng)因子和基因的傳遞。而打印技術(shù)的分辨率是需要改進(jìn)的部分，使組織和器官的血管化成為可能。設(shè)計(jì)具有仿生特性和良好的骨形成能力的骨組織工程支架，對(duì)于由皮質(zhì)骨、松質(zhì)骨和血管組成的復(fù)雜骨組織結(jié)構(gòu)修復(fù)具有重要意義。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展，骨科植入物的個(gè)性化。對(duì)于小尺寸標(biāo)準(zhǔn)植入物或假肢，尤其是用于脊柱，牙齒或顱面疾病的假體，自定義打印3D 對(duì)象的成本很低，這將服務(wù)于對(duì)于生產(chǎn)量低或生產(chǎn)高度復(fù)雜或需要頻繁修改的零件或產(chǎn)品的公司。我們需要繼續(xù)深入改進(jìn)3D 打印骨組織工程支架，以使骨組織在最佳條件下進(jìn)行再生。